Name: a mouse model to assess innate immune response to staphylococcus aureus infection
Uploaded: 2019-02-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid subsidies R01 AI129302 (voor S.I.S.) en het programma van de opleiding in de farmacologie: van Bench naar Bedside bij UC Davis (NIH T32 GM099608 naar L.S.A). De moleculaire en genomische Imaging (CMGI) bij de Universiteit van Californië-Davis verleend prachtig technologische steun.

Alle muis studies werden herzien en goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij UC Davis en werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Animal Welfare Act en de Health Act voor de uitbreiding van de onderzoek. Zorg ervoor dat gebruik van steriele handschoenen bij het werken met dieren.
1. muis bron en huisvesting
<ol><li>Afleiden van LysM-eGFP muizen op een genetische achtergrond van C57BL/6J zoals eerder beschreven12. LysM-EGFP × MyD88...

<ol>
	<li>Moran, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methicillin-Resistant+S.+aureus+Infections+among+Patients+in+the+Emergency+Department.">Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department.</a> New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).</li><li>Suaya, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+cost+of+hospitalizations+associated+with+Staphylococcus+aureus+skin+and+soft+tissue+infections+in+the+United+States+from+2001+through+2009.">Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P &amp; T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+use+and+its+consequences+for+the+normal+microbiome.">Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome.</a> Science. 352 (6285), 544-545 (2016).</li><li>Hilliard, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Alpha-Toxin+Monoclonal+Antibody+and+Antibiotic+Combination+Therapy+Improves+Disease+Outcome+and+Accelerates+Healing+in+a+Staphylococcus+aureus+Dermonecrosis+Model.">Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).</li><li>Proctor, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+for+Staphylococcus+aureus+vaccines:+clinical+and+basic+science+challenges.">Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges.</a> European Cells &amp; Materials. 30, 315-326 (2015).</li><li>M&#246;lne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Neutrophil+Leukocytes+in+Cutaneous+Infection+Caused+by+Staphylococcus+aureus.">Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).</li><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+Marrow+to+Microbes.">Neutrophils, from Marrow to Microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Miller, L. S., Cho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+against+Staphylococcus+aureus+cutaneous+infections.">Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).</li><li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catchup:+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes.">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li><li>Falahee, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Toxin+Regulates+Local+Granulocyte+Expansion+from+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Staphylococcus+aureus-Infected+Wounds.">&#945;-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds.</a> Journal of immunology. 199 (5), 1772-1782 (2017).</li><li>Kim, M. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Neutrophil+Infiltration+during+Cutaneous+Wound+Healing+and+Infection+Using+Fluorescence+Imaging.">Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).</li><li>Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+microscopy+of+host-pathogen+interactions+in+a+mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+skin+abscess+formation.">Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation.</a> Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).</li><li>Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+recruited+through+high+endothelial+venules+of+the+lymph+nodes+via+PNAd+intercept+disseminating+Staphylococcus+aureus.">Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).</li><li>Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+TLR2-Deficient+and+MyD88-Deficient+Mice+Are+Highly+Susceptible+to+Staphylococcus+aureus+Infection.">Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection.</a> The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).</li><li>Miller, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88+Mediates+Neutrophil+Recruitment+Initiated+by+IL-1R+but+Not+TLR2+Activation+in+Immunity+against+Staphylococcus+aureus.">MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus.</a> Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).</li><li>Macedo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+is+impaired+in+MyD88-deficient+mice:+a+role+for+MyD88+in+the+regulation+of+wound+healing+by+adenosine+A2A+receptors.">Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors.</a> The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).</li><li>Cho, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+IL-1&#946;+Is+Sufficient+for+Abscess+Formation+in+Immunity+against+Staphylococcus+aureus+in+Mice.">Neutrophil-derived IL-1&#946; Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).</li><li>Granick, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+recognition+by+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+via+TLR2/MyD88/PGE2+stimulates+granulopoiesis+in+wounds.">Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds.</a> Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).</li><li>Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+survival+and+c-kit+-progenitor+proliferation+in+Staphylococcus+aureus-infected+skin+wounds+promote+resolution.">Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution.</a> Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).</li><li>Foster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+evasion+by+staphylococci.">Immune evasion by staphylococci.</a> Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).</li><li>Gordon, R. J., Lowy, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus+Infection.">Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection.</a> Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).</li><li>Cho, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+IL-1&#946;+Is+Sufficient+for+Abscess+Formation+in+Immunity+against+Staphylococcus+aureus+in+Mice.">Neutrophil-derived IL-1&#946; Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).</li><li>Bernthal, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+post-arthroplasty+Staphylococcus+aureus+joint+infection+to+evaluate+in+vivo+the+efficacy+of+antimicrobial+implant+coatings.">A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).</li><li>Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+Luminescent+Staphylococcus+aureus+Clinical+Strains+for+Use+in+Bioluminescent+Imaging.">Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging.</a> PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).</li><li>Dillen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+&#947;&#948;+T+cells+protect+against+Staphylococcus+aureus+skin+reinfection.">Clonally expanded &#947;&#948; T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).</li></ol>

S. aureus -infectie modellen die gebruik maken van bioluminescente S. aureus -infectie in een fluorescerende neutrofiele verslaggever muis in combinatie met geavanceerde technieken van hele dieren in vivo optische beeldvorming hebben onze kennis van de aangeboren geavanceerde immune reactie op de infectie. Eerdere studies met de LysM-EGFP muis hebben aangetoond dat omhoog aan 1 x 107 neutrofielen werven op een S. aureus geïnfecteerde wond gedurende de eerste 24 h van besmetting<sup ...

Staphylococcus aureus (S. aureus) is goed voor de meerderheid van de huid en weke delen infecties (SSTIs) in de Verenigde Staten1. De incidentie van methicilline-resistente S. aureus (MRSA) infecties gestaag gestegen de afgelopen twee decennia2, de studie van de mechanismen van de persistentie en de ontdekking van nieuwe behandelingsstrategieën motiveren. De standaard van zorg voor MRSA infecties is systemische antibiotische therapie, maar MRSA is geworden tijd3 steeds meer resistent tegen antibiotica en deze drugs kunnen verminderen van de host gunstig microbiome, waardoor negatieve gezondheidseffecten, vooral in kinderen4. Preklinische studies hebben onderzocht alternatieve strategieën voor de behandeling van MRSA infecties5, maar het vertalen van deze benaderingen naar de kliniek heeft bewezen uitdagende als gevolg van de opkomst van Virulentiefactoren die host immuunrespons6dwarsbomen. We combineren om te ontleden de dynamiek van de gastheer-pathogeen dat station S. aureus SSTIs, noninvasive en longitudinale uitlezingen van het aantal neutrofielen gerekruteerd om het bed van de wond met kinetische maatregelen van bacteriële overvloed en wond gebied.
Neutrofielen zijn het meest voorkomende circulerende leukocyten in de mens en de eerste responders om een bacteriële infectie7. Neutrofielen zijn een noodzakelijk onderdeel voor een effectieve host reactie tegen S. aureus infecties als gevolg van hun bactericide mechanismen, met inbegrip van de productie van reactieve zuurstof soorten, proteasen, antimicrobiële peptiden en functionele reacties inclusief fagocytose en neutrofiele extracellulaire val productie8,9. Menselijke patiënten met genetische defecten in neutrofiele functie, zoals Chronische granulomateuze ziekte en syndroom van Chediak-Higashi, tonen een verhoogde gevoeligheid voor S. aureus -infectie. In toevoeging, patiënten met (zoals aangeboren neutropenie) genetische en verworven (zoals neutropenie gezien bij chemotherapie patiënten) gebreken in neutrofiele nummers zijn ook zeer gevoelig voor S. aureus -infectie10. Gezien het belang van neutrofielen in het ontruimen van S. aureus -infecties, kan vergroten hun immuun capaciteit of het afstemmen van hun nummers binnen een S. aureus -laesie blijken een effectieve strategie bij het oplossen van de infectie.
In het afgelopen decennium, zijn transgene muizen met fluorescentie neutrofiele verslaggevers ontwikkeld om te bestuderen van hun handel11,12. Neutrofiele reporter muizen combineren met hele dierlijke beeldvormingstechnieken toelaat Spatio analyse van neutrofielen in weefsels en organen. Wanneer gecombineerd met de bioluminescente stammen van S. aureus, is het mogelijk om bij te houden van de accumulatie van neutrofielen naar aanleiding van S. aureus overvloed en persistentie in het kader van bacteriële virulentie factoren die direct en indirect neutrofiele getallen in aangetast weefsel13,14,15,16erover.
Muizen zijn minder gevoelig voor S. aureus virulentie en immuun belastingontduiking mechanismen dan mensen. Als zodanig, wild-type muizen niet mag zijn een ideale diermodel te onderzoeken van de effectiviteit van een therapeutisch te behandelen chronische S. aureus gegeven infectie. MyD88-deficiënte muizen (dat wil zeggen, MyD88- / - muizen), een stam van immuungecompromitteerde muis die mist functionele interleukin-1 receptor (IL-1R) en Toll-like receptor (TLR) signalering, Toon grotere vatbaarheid voor S. aureus -infectie in vergelijking met wild-type muizen17 en een bijzondere waardevermindering neutrofiele mensenhandel naar een site van S. aureus -infectie van de huid18. Ontwikkeling van de stam van een muis die beschikt over een fluorescerende neutrofiele verslaggever bij MyD88- / - muizen heeft een alternatief model voor het onderzoek naar de werkzaamheid van therapieën voor de behandeling van S. aureus -infectie in vergelijking met huidige neutrofiele reporter muizen.
In dit protocol, we karakteriseren van S. aureus -infectie in de immuungecompromitteerde LysM-EGFP × MyD88- / - muizen, en vergelijk het tijdsverloop en de resolutie van infectie met het LysM-EGFP muizen. LysM-EGFP × MyD88- / - muizen ontwikkelen een chronische infectie die niet wordt opgelost, en 75% bezwijken voor infectie na 8 dagen. Een aanzienlijk gebrek in eerste neutrofiele aanwerving gebeurt meer dan 72 h van de inflammatoire fase van infectie, en 50% minder neutrofielen werven tijdens de laatste fase van de infectie. De verhoogde gevoeligheid van de LysM-EGFP × MyD88- / - muizen maakt dit bijzondere stam een rigoureuze preklinische model te evalueren van de werkzaamheid van nieuwe therapeutische technieken, gericht op van S. aureus -infectie in vergelijking met de huidige modellen gebruik maken van wild-type muizen, met name technieken die zijn gericht op het stimuleren van de aangeboren immuunreactie tegen infectie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1101px;" width="1101">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:301px;">Falcon</td>
			<td style="width:229px;">352059</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6mm Disposable Biopsy Punch</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioluminescent S. aureus</td>
			<td>Lloyd Miller, Johns Hopkins&#160;</td>
			<td>ALC 2906 SH1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buprenoprhine hydrochloride injectable</td>
			<td>Western Medical Supply</td>
			<td>7292</td>
			<td>0.3 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Labratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloramphenicol (crystalline powder)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (1X)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin Syringes</td>
			<td>Becton, Dickson and Company</td>
			<td>329461</td>
			<td>.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2&#39;&#39;)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Living Image Software &#8211; IVIS Spectrum Series</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LysM-eGFP Mice</td>
			<td>Thomas Graff Albert Einstein College of New York&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyD88 KO Mice</td>
			<td>Jackson Labratory</td>
			<td>009088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-woven sponges</td>
			<td>AMD- Ritmed Inc</td>
			<td>A2101-CH</td>
			<td>5 cm x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Povidone Iodine 10% Solution</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>697731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 7.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>License&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Becton, Dickson and Company</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model to assess innate immune response to staphylococcus aureus infection

Staphylococcus aureus (S. aureus) infecties, met inbegrip van methicilline resistente vlekken, zijn een enorme belasting voor de gezondheidszorg. Met de incidentiecijfers van S. aureus -infectie jaarlijks klimmen, is er een vraag voor aanvullend onderzoek in de pathogeniteit. Dierlijke modellen van een besmettelijke ziekte verder van ons begrip van de reactie van de gastheer-pathogeen en leiden tot de ontwikkeling van effectieve therapeutics. Neutrofielen spelen een primaire rol in het aangeboren immuunrespons waarop de S. aureus -infecties wordt beheerd door de vorming van een abces muur van de infectie te vergemakkelijken van bacteriële goedkeuring; het aantal neutrofielen die infiltreren van een S. aureus -huidinfectie vaak correleert met ziekte resultaat. LysM-EGFP muizen, die de verbeterde groen fluorescent proteïne (EGFP) ingevoegd in de lysozym M (LysM) promotor regio (uitgedrukt voornamelijk door neutrofiele granulocyten) bezitten, wanneer gebruikt in combinatie met in vivo hele dierlijke fluorescentie imaging (FLI) bieden een middelen voor het kwantificeren van neutrofiele emigratie noninvasively en overlangs in gewonde huid. Wanneer deze wordt gecombineerd met een bioluminescente S. aureus -stam en sequentiële in vivo hele dierlijke bioluminescente afbeeldingen (BLI), is het mogelijk lengterichting volgen zowel de neutrofiele werving dynamiek en in vivo bacteriële belasting op de site van infectie bij narcose muizen vanaf begin van infectie tot resolutie of de dood. Muizen meer resistent zijn tegen een aantal virulentiefactoren geproduceerd door S. aureus die effectieve kolonisatie en infectie bij de mens vergemakkelijken. Immunodeficiëntie muizen bieden een gevoeliger diermodel te onderzoeken persistente S. aureus infecties en de mogelijkheid van therapeutics om aangeboren immuunresponsen stimuleren. Hierin, karakteriseren wij antwoorden in LysM-EGFP muizen die aan MyD88-deficiënte muizen (LysM-EGFP × MyD88- / - muizen) hebben gefokt samen met wild-type LysM-EGFP muizen te onderzoeken van S. aureus huid wondinfectie. Multispectrale simultane detectie studie van neutrofiele werving dynamiek ingeschakeld met behulp van in vivo FLI, bacteriële belasting met behulp van in vivo BLI, en wondgenezing lengterichting en noninvasively na verloop van tijd.

LysM-EGFP × MyD88- / - muizen zijn meer vatbaar voor S. aureus -infectie dan LysM-EGFP muizen
De stam van S. aureus gebruikt in deze studie, ALC290618, , werd gebouwd met een plasmide waarin de lux -constructie waarbij bioluminescente signalen van live en actief metaboliseringssysteem bacteriën produceert. Wanneer geënt in muizen, kan in vivo bioluminescentie...

Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection at JoVE.com

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Een aanpak wordt beschreven voor real-time detectie van de ingeboren immune reactie op het verwonden van cutane en Staphylococcus aureus -infectie van muizen. Door vergelijking LysM-EGFP muizen (die bezitten fluorescerende neutrofielen) met een LysM-EGFP gekruist immunodeficiëntie muis stam, we vooraf ons begrip van de infectie en de ontwikkeling van benaderingen ter bestrijding van de infectie.

Een muismodel te beoordelen ingeboren immuunreactie op Staphylococcus aureus -infectie

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

Technieken die de bacterielast en een neutrofiele tegelijkertijd monitoren, kunnen inzicht geven in de mechanismen van Staph aureus persistentie en de werkzaamheid van behandelingsstrategieën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat meerdere parameters in de lengterichting kunnen worden gemeten in een live host gedurende de duur van de infectie. Het is van cruciaal belang om te laten zien waar de wond op een muis dorsum moet worden gezet, hoe de huid moet worden verwijderd en hoe de wond met Staph aureus moet worden ineenten.Begin met het ontdooien van de bioluminescentie Staph aureus stam van belang van negatieve 80 graden Celsius opslag op ijs. Voordat de cultuur op een 5% runderbloed agar plaat. Voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius.De volgende ochtend, breng drie tot vier individuele kolonies van de Staph aureus plaat in de tryptische sojabouillon, of TSB. Aangevuld met 10 microgram per milliliter chlooramfenicol voor een nachtelijke schudden incubatie bij 37 graden Celsius. De volgende ochtend, verdun 120 microliters van cultuur monster in zes milliliter TSB.Met 10 microgram per milliliter chlooramfenicol, voor een incubatie van twee uur bij 37 graden Celsius en 200 rotaties per minuut. Wanneer de optische dichtheid op 600 nanometer 0,5 bereikt, breng dan drie milliliter bacteriële suspensie over in 10 milliliter ijskoud DPBS. Na het zorgvuldig decanteren van de supernatant, voeg extra gekoelde DPBS aan de pellet, en vortex de opnieuw opgehangen bacteriën grondig.Na een tweede centrifugatie, opnieuw opschorten de bacteriële pellet in 1,5 milliliter PBS op ijs. Om de concentratie van bacteriën te verifiëren, verdunt u in de serie 100 microliter van de bacteriële suspensie met een factor 1 x 10 tot de 4e en 1 x 10 tot de 5e in verse PBS. En plaat 20 microliter van elke verdunning op individuele agar platen.Tel na een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius het aantal kolonievormende eenheden door middel van brutoonderzoek om de bacteriële concentratie van de vorige dag te berekenen. Voor excisional huid verwonding van de ontvangende dieren, bevestigen een gebrek aan reactie op teen knijpen, voordat scheren een een door twee inch sectie op de achterkant van de muis. Veeg voorzichtig af om verdwaalde haren te verwijderen.En desinfecteren de blootgestelde huid, met sequentiële 10%povidone jodium, en 70% ethanol doordrenkte gaas toepassingen. Naar buiten bewegen vanuit het midden van het chirurgische gebied, in een spiraalpatroon. Na het toestaan van de huid te drogen voor ongeveer een minuut, stevig druk op een steriele zes millimeter punch biopsie in het midden van de voorbereide chirurgische gebied.Draai de punch biopsie om een cirkelvormige omtrek op de huid te creëren, die volledig snijdt door het huidweefsel, en ten minste een deel van de omtrek. Zorg ervoor dat u niet in de onderliggende fascia of weefsel snijdt. Gebruik vervolgens steriele schaar, en tangen, te snijden door de opperhuid en dermis, volgens de cirkelvormige patroon bedrukt door de punch biopsie.Voor Staph aureus inenting, vul een 28-gauge insulinespuit met 50 microliter van de voorbereide bioluminescente bacteriële inentingsmiddelen. En gebruik een vinger om de dermis van het gewonde dier naar de kant te trekken. Houd de spuit bijna parallel aan het weefsel, steek de spuit langzaam in het weefsel totdat een plotselinge afname van de weerstand wordt gevoeld.Wat wijst op piercing van de fascia. Met de naald geplaatst in het midden van de wond, langzaam leveren het gehele volume van de entmateriaal. Bevestig dat de entmateriaal een bel vormt in het midden van de wond, met minimale lekkage of dispersie.En verwijder de spuit langzaam van het dier. Breng het dier dan terug naar zijn kooi met warmte en monitoring tot volledig herstel. Na het verwonden en infectie, en dagelijks tijdens het experiment, plaats de verdoofde muis in een bioluminescente en florescentie imager, met de wond zo plat mogelijk.Selecteer in de imager-software luminescentie en fotografeer als beeldmodi. De belichtingstijd moet worden ingesteld op één minuut bij kleine binning, F/Stop 1 voor luminescentie, F/Stop 8 voor foto en open voor het emissiefilter. Klik vervolgens op acquire om de afbeelding op te nemen.Voor in vivo fluorescentie beeldvorming, selecteer fluorescentie, en foto, als de beeldvorming modi. De belichtingstijd moet worden ingesteld op een seconde bij kleine binning, F /Stop 1 voor fluorescentie, F/Stop 8 voor foto, en Opwinding en emissiegolflengten van 465 meer dan 30 nanometer, en 520 meer dan 20 nanometer, met een hoge lampintensiteit, respectievelijk. Klik vervolgens op acquire om de afbeelding op te nemen.Na het verkrijgen van beide sets van beelden, terug te keren het dier naar zijn kooi, met monitoring, tot volledig herstel. Open voor beeldanalyse de te kwantificeren afbeelding in een geschikt softwareprogramma voor beeldanalyse en plaats het standaard cirkelgebied dat van belang is over het gehele wondgebied, inclusief de omringende huid. Klik op het interessegebied meten en nota van de waarden voor de gemiddelde flux voor de wond, zodat de gemiddelde flux van elk signaal kan worden uitgezet ten opzichte van de tijd.Om de wondgenezing te meten, past u een cirkelvormig gebied van belang over de wondrand en meet u het gebied van de wond in vierkante centimeters, zodat de fractionele verandering van de basislijn versus de tijd kan worden uitgezet. In dit representatieve experiment, voorwaardelijke EGFP expressie myeloïde differentiatie primaire respons 88, Of MyD88 knock-out muizen, toonde een grotere gevoeligheid voor Staph aureus inenting, dan niet-voorwaardelijke EGFP uitdrukken van dieren. Met een 80%-letaliteit waargenomen tijdens de eerste acht dagen van infectie.Beide stammen van muizen verloren ongeveer 5% van hun lichaamsgewicht onmiddellijk na infectie. Echter, de voorwaardelijke EGFP uitdrukken muizen herstelden hun oorspronkelijke gewichten door dag twee. Terwijl de MyD88 muizen dat niet deden.Wondsluiting in aanwezigheid van Staph aureus infectie was niet verschillend tussen de twee stammen. Echter, steriel gewonde MyD88 knock-out muizen, had een aanzienlijk defect in wondgenezing, in vergelijking met voorwaardelijke EGFP uitdrukken van dieren. De hele beeldvorming van dieren toonde een hogere bacteriële belasting, zoals blijkt uit een verhoogd bioluminescent signaal in de wonden van MyD88 knock-outdieren, in vergelijking met voorwaardelijke EGFP uitdrukken van dieren.Een daling van 40% in de initiële neutrofiele handel tot niet-geïnfecteerde wonden van MyD88 knock-out dieren, werd ook waargenomen in vergelijking met voorwaardelijke EGFP uitdrukken van dieren. Toen onmiddellijk na het verwonden 1 x 10 tot de 7e kolonievormende eenheden van Staph aureus werden geïntroduceerd, werd de neutrofielehandel aanzienlijk verzwakt bij knock-outdieren in vergelijking met voorwaardelijke EGFP-uitdrukkende dieren. Voordat u de bacteriën uitdeelt, moet u ervoor zorgen dat er geen luchtbellen in de spuit zitten en dat de locatie van de naald correct in het midden van de wond is geplaatst.Dierlijk weefsel kan worden geoogst op het eindpunt om de expressie van eiwitten van belang en bacteriële verspreiding van de wond te meten. Staph aureus is besmettelijk voor de mens. Als zodanig moeten persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen bij het hanteren van de bacteriën, en voorzichtigheid moet worden betracht bij het hanteren van een spuit die de ziekteverwekker bevat.Deze techniek heeft geholpen bij het verkennen van het gebruik van biologische behandelingen voor Staph aureus infecties die de gastheren aangeboren immuunrespons tegen infectie te verbeteren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Subcutane Infectie van Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Experimentele Endocarditis Model van Methicilline Resistente<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) in Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth met humaan hemoglobine als een ijzerbron

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kwantificering van de Respiratory Burst Response als een indicator van het aangeboren immuunsysteem Gezondheid in zebravis

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analyse van Myd88 gemedieerde cellulaire immuunrespons op West Nile Virus mutantstam Infectie

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons in een zebravis larven Model van<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infectie

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Een mondelinge beheermodel voor wasmot te Study Commensal-Induced aangeboren immuunresponsen

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Kwantificeren van de cytotoxiciteit van Staphyloccus aureus tegen menselijke polymorfonucleaire leukocyten

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Isolatie van tonsillaire mononucleaire cellen om ex vivo ingeboren immuunreacties te bestuderen in een menselijk mucosale lymfoïde weefsel

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...