Name: a mouse model to assess innate immune response to staphylococcus aureus infection
Uploaded: 2019-02-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da nazionale istituti di salute sovvenzioni R01 AI129302 (al s.i.s.) e il programma di formazione in farmacologia: da banco al capezzale presso UC Davis (NIH T32 GM099608 a Silvana). Il molecolare e Imaging Genomic (CMGI) presso la University of California Davis fornito eccellente supporto tecnologico.

Tutti gli studi del topo sono stati esaminati e approvati dal comitato di uso presso UC Davis e istituzionali Animal Care e sono state eseguite secondo le indicazioni dell'Animal Welfare Act e la legge di estensione di ricerca salute. Assicurarsi di utilizzare guanti sterili quando si lavora con gli animali.
1. mouse fonte e custodia
<ol><li>Derivare LysM-eGFP topi su una priorità bassa genetica C57BL/6J come descritto in precedenza12. Derivare LysM-EGFP × MyD88<sup...

<ol>
	<li>Moran, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methicillin-Resistant+S.+aureus+Infections+among+Patients+in+the+Emergency+Department.">Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department.</a> New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).</li><li>Suaya, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+cost+of+hospitalizations+associated+with+Staphylococcus+aureus+skin+and+soft+tissue+infections+in+the+United+States+from+2001+through+2009.">Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P &amp; T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+use+and+its+consequences+for+the+normal+microbiome.">Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome.</a> Science. 352 (6285), 544-545 (2016).</li><li>Hilliard, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Alpha-Toxin+Monoclonal+Antibody+and+Antibiotic+Combination+Therapy+Improves+Disease+Outcome+and+Accelerates+Healing+in+a+Staphylococcus+aureus+Dermonecrosis+Model.">Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).</li><li>Proctor, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+for+Staphylococcus+aureus+vaccines:+clinical+and+basic+science+challenges.">Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges.</a> European Cells &amp; Materials. 30, 315-326 (2015).</li><li>M&#246;lne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Neutrophil+Leukocytes+in+Cutaneous+Infection+Caused+by+Staphylococcus+aureus.">Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).</li><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+Marrow+to+Microbes.">Neutrophils, from Marrow to Microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Miller, L. S., Cho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+against+Staphylococcus+aureus+cutaneous+infections.">Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).</li><li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catchup:+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes.">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li><li>Falahee, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Toxin+Regulates+Local+Granulocyte+Expansion+from+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Staphylococcus+aureus-Infected+Wounds.">&#945;-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds.</a> Journal of immunology. 199 (5), 1772-1782 (2017).</li><li>Kim, M. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Neutrophil+Infiltration+during+Cutaneous+Wound+Healing+and+Infection+Using+Fluorescence+Imaging.">Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).</li><li>Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+microscopy+of+host-pathogen+interactions+in+a+mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+skin+abscess+formation.">Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation.</a> Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).</li><li>Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+recruited+through+high+endothelial+venules+of+the+lymph+nodes+via+PNAd+intercept+disseminating+Staphylococcus+aureus.">Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).</li><li>Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+TLR2-Deficient+and+MyD88-Deficient+Mice+Are+Highly+Susceptible+to+Staphylococcus+aureus+Infection.">Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection.</a> The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).</li><li>Miller, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88+Mediates+Neutrophil+Recruitment+Initiated+by+IL-1R+but+Not+TLR2+Activation+in+Immunity+against+Staphylococcus+aureus.">MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus.</a> Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).</li><li>Macedo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+is+impaired+in+MyD88-deficient+mice:+a+role+for+MyD88+in+the+regulation+of+wound+healing+by+adenosine+A2A+receptors.">Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors.</a> The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).</li><li>Cho, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+IL-1&#946;+Is+Sufficient+for+Abscess+Formation+in+Immunity+against+Staphylococcus+aureus+in+Mice.">Neutrophil-derived IL-1&#946; Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).</li><li>Granick, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+recognition+by+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+via+TLR2/MyD88/PGE2+stimulates+granulopoiesis+in+wounds.">Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds.</a> Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).</li><li>Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+survival+and+c-kit+-progenitor+proliferation+in+Staphylococcus+aureus-infected+skin+wounds+promote+resolution.">Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution.</a> Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).</li><li>Foster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+evasion+by+staphylococci.">Immune evasion by staphylococci.</a> Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).</li><li>Gordon, R. J., Lowy, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus+Infection.">Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection.</a> Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).</li><li>Cho, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+IL-1&#946;+Is+Sufficient+for+Abscess+Formation+in+Immunity+against+Staphylococcus+aureus+in+Mice.">Neutrophil-derived IL-1&#946; Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).</li><li>Bernthal, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+post-arthroplasty+Staphylococcus+aureus+joint+infection+to+evaluate+in+vivo+the+efficacy+of+antimicrobial+implant+coatings.">A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).</li><li>Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+Luminescent+Staphylococcus+aureus+Clinical+Strains+for+Use+in+Bioluminescent+Imaging.">Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging.</a> PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).</li><li>Dillen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+&#947;&#948;+T+cells+protect+against+Staphylococcus+aureus+skin+reinfection.">Clonally expanded &#947;&#948; T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).</li></ol>

Modelli di infezione di S. aureus che utilizzano bioluminescenti S. aureus infezione in un mouse fluorescente del neutrofilo reporter in combinazione con tecniche avanzate di animale intero in vivo imaging ottico hanno avanzato la nostra conoscenza dell'innata risposta immunitaria all'infezione. Utilizzando il mouse LysM-EGFP gli studi precedenti hanno indicato che fino a 1 x 107 neutrofili recluta per una ferita infetta di S. aureus sopra le prime 24 ore dell'infezione<sup class="xr...

Staphylococcus aureus (S. aureus) rappresenta la maggior parte della pelle e infezioni dei tessuti molli (SSTI) in Stati Uniti d'America1. L'incidenza di meticillino-resistenti Staphylococcus aureus (MRSA) infezioni è aumentato costantemente sopra il passato due decenni2, motivare lo studio dei meccanismi di persistenza e la scoperta di nuove strategie di trattamento. Lo standard di cura per le infezioni da MRSA è la terapia antibiotica sistemica, ma MRSA è diventato sempre più resistente agli antibiotici nel corso tempo3 e questi farmaci possono diminuire microbiome benefico dell'host, causando effetti negativi sulla salute, soprattutto in bambini4. Studi preclinici hanno esaminato le strategie alternative per il trattamento di infezioni di MRSA5, ma tradurre questi approcci alla clinica ha dimostrato difficile a causa di comparsa di fattori di virulenza che contrastare host le risposte immunitarie6. Per sezionare le dinamiche di ospite-patogeno tale unità S. aureus SSTI, uniamo non invadente e letture longitudinale del numero di neutrofili reclutati al letto della ferita con misure cinetiche dell'abbondanza batterica e la zona ferita.
I neutrofili sono il più abbondanti leucociti circolanti negli esseri umani e i primi soccorritori ad un' infezione batterica7. I neutrofili sono una componente necessaria per una risposta efficace ospite contro le infezioni da Staphylococcus aureus dovuto i loro meccanismi battericidi, compresa la produzione delle specie reattive dell'ossigeno, proteasi, peptidi antimicrobici e le risposte funzionali tra cui la fagocitosi e trappola extracellulari del neutrofilo produzione8,9. I pazienti umani con difetti genetici in funzione dei neutrofili, come la malattia granulomatosa cronica e la sindrome di Chediak-Higashi, mostrano un aumento della suscettibilità alle infezioni di S. aureus . Inoltre, pazienti con genetiche (come la neutropenia congenita) e acquisite (quali neutropenia vista nei pazienti di chemioterapia) difetti nei numeri del neutrofilo sono anche altamente suscettibili di S. aureus infezione10. Data l'importanza dei neutrofili in compensazione le infezioni da S. aureus , rafforzandone la capacità immunitaria o tuning loro numeri all'interno di una lesione di S. aureus può rivelarsi una strategia efficace nel risolvere l'infezione.
Nell'ultimo decennio, topi transgenici con i giornalisti del neutrofilo di fluorescenza sono stati sviluppati per studiare il loro traffico di11,12. Combinando i topi reporter del neutrofilo con tecniche di imaging animale intero consente analisi spazio-temporale dei neutrofili in tessuti e organi. Quando combinato con bioluminescenti ceppi di Staphylococcus aureus, è possibile tracciare l'accumulo di neutrofili in risposta all'abbondanza di S. aureus e persistenza nel contesto della virulenza batterica fattori che direttamente e indirettamente perturbare i numeri dei neutrofili nel tessuto colpito13,14,15,16.
I topi sono meno suscettibili di meccanismi di evasione di virulenza e immunitario di S. aureus che gli esseri umani. Come tale, topi wild-type non possono essere un modello animale ideale per studiare l'efficacia di un dato terapeutico per il trattamento cronico S. aureus infezione. Topi MyD88-carenti (cioè, MyD88- / - topi), un ceppo di topo immunocompromessi che manca di recettore funzionale interleuchina-1 (IL-1R) e del recettore Toll-like (TLR) segnalazione, Visualizza una maggiore suscettibilità all'infezione di S. aureus rispetto al topi wild-type17 e un danno del neutrofilo traffico a un sito di S. aureus infezione nella pelle18. Sviluppo di un ceppo di topo che possiede un reporter fluorescente del neutrofilo nei topi di MyD88- / - ha fornito un modello alternativo per indagare l'efficacia di terapie per trattare l'infezione di S. aureus rispetto alla corrente del neutrofilo topi reporter.
In questo protocollo, ci caratterizzano lo Staphylococcus aureus infezione nei LysM-EGFP × MyD88- / - topi immunocompromessi e confrontare il decorso e la risoluzione dell'infezione con i topi LysM-EGFP. LysM-EGFP × MyD88- / - topi sviluppano un'infezione cronica che non si risolve, e 75% soccombere all'infezione dopo 8 giorni. Un difetto significativo in iniziale reclutamento dei neutrofili si verifica oltre 72 h della fase infiammatoria della infezione, e meno del 50% neutrofili reclutano durante la seconda fase dell'infezione. L'aumentata suscettibilità del × LysM-EGFP MyD88 topi- / - rende questo particolare ceppo un rigoroso modello preclinico per valutare l'efficacia di nuove tecniche terapeutiche targeting per S. aureus infezione rispetto agli attuali modelli che utilizzare topi wild-type, soprattutto tecniche con l'obiettivo di aumentare la risposta immunitaria innata contro l'infezione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1101px;" width="1101">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:301px;">Falcon</td>
			<td style="width:229px;">352059</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6mm Disposable Biopsy Punch</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioluminescent S. aureus</td>
			<td>Lloyd Miller, Johns Hopkins&#160;</td>
			<td>ALC 2906 SH1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buprenoprhine hydrochloride injectable</td>
			<td>Western Medical Supply</td>
			<td>7292</td>
			<td>0.3 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Labratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloramphenicol (crystalline powder)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (1X)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin Syringes</td>
			<td>Becton, Dickson and Company</td>
			<td>329461</td>
			<td>.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2&#39;&#39;)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Living Image Software &#8211; IVIS Spectrum Series</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LysM-eGFP Mice</td>
			<td>Thomas Graff Albert Einstein College of New York&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyD88 KO Mice</td>
			<td>Jackson Labratory</td>
			<td>009088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-woven sponges</td>
			<td>AMD- Ritmed Inc</td>
			<td>A2101-CH</td>
			<td>5 cm x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Povidone Iodine 10% Solution</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>697731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 7.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>License&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Becton, Dickson and Company</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model to assess innate immune response to staphylococcus aureus infection

Staphylococcus aureus (S. aureus) infezioni, compresi meticillina resistente alle macchie, sono un enorme onere per il sistema sanitario. Con tassi di incidenza di infezione da Staphylococcus aureus arrampicata annualmente, c'è una domanda per ulteriori ricerche nelle sua patogenicità. Modelli animali di malattia infettiva avanzano la nostra comprensione della risposta ospite-patogeno e portano allo sviluppo di terapie efficaci. I neutrofili svolgono un ruolo primario nella risposta immunitaria innata che controlla le infezioni da S. aureus formando un ascesso per muro fuori l'infezione e facilitare lo spazio batterico; il numero dei neutrofili che infiltrarsi un'infezione della pelle di S. aureus spesso correla con risultato di malattia. Topi LysM-EGFP, che possiedono la proteina fluorescente verde avanzata (EGFP) inserita nella regione del promotore di lisozima M (LysM) (espressa principalmente dai neutrofili), quando utilizzato in combinazione con imaging in vivo animale intero fluorescenza (FLI) forniscono un mezzi di quantificazione del neutrofilo emigrazione non invadente e longitudinalmente in pelle ferita. Quando combinato con un bioluminescenti Staphylococcus aureus strain e sequenziale in vivo imaging intero animale bioluminescente (BLI), è possibile monitorare longitudinalmente sia le dinamiche di reclutamento dei neutrofili e la carica batterica in vivo presso il sito di infezione nei topi anestetizzati dall'inizio dell'infezione alla risoluzione o alla morte. I topi sono più resistenti a una serie di fattori di virulenza prodotta da S. aureus che facilitano efficace colonizzazione e l'infezione in esseri umani. Topi immunodeficienti forniscono un modello animale più sensibile per esaminare persistente S. aureus infezioni e la possibilità di terapeutica per amplificare la risposta immune innata. Nel presente documento, ci caratterizzano le risposte in topi LysM-EGFP che sono stati allevati per topi MyD88-carenti (LysM-EGFP × MyD88- / - topi) insieme con selvaggio-tipo LysM-EGFP topi per indagare lo Staphylococcus aureus pelle infezione della ferita. Rilevazione simultanea multispettrali abilitato studio delle dinamiche di reclutamento dei neutrofili utilizzando in vivo FLI, carica batterica utilizzando BLI in vivo e cicatrizzazione longitudinalmente e non invadente nel corso del tempo.

LysM-EGFP × MyD88- / - topi sono più suscettibili di infezione da S. aureus che topi LysM-EGFP
Il ceppo di S. aureus utilizzato in questo studio, ALC290618, è stato costruito con un plasmide contenente il costrutto di lux che produce segnali bioluminescenti da batteri vivi e attivamente metabolizzante. Quando inoculate nei topi, bioluminescenza in vivo (BLI) ...

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A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Un approccio è descritto per la rilevazione in tempo reale della risposta immunitaria innata di ferite cutanee e Staphylococcus aureus infezione dei topi. Di confronto LysM-EGFP topi (che possiedono i neutrofili fluorescenti) con un LysM-EGFP incrociate topo immunodeficiente, abbiamo anticipato la nostra comprensione dell'infezione e lo sviluppo di approcci per combattere l'infezione.

Un modello di topo per valutare risposta immunitaria innata per infezione da Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

Le tecniche che monitorano il carico batterico e un neutrofilo rispondono contemporaneamente possono fornire informazioni sui meccanismi di persistenza dello Staph aureus e sull'efficacia delle strategie di trattamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che più parametri possono essere misurati longitudinalmente in un ospite vivo per tutta la durata dell'infezione. È fondamentale mostrare dove posizionare la ferita su un dorsum di topo, come asportare la pelle e come inoculare la ferita con Staph aureus.Inizia scongelando il ceppo di aureo Staph di bioluminescenza di interesse dallo stoccaggio negativo di 80 gradi Celsius sul ghiaccio. Prima di strisciare la coltura su una piastra di agar di sangue bovino al 5%. Per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius.La mattina seguente, trasferire da tre a quattro colonie individuali dalla piastra di Staph aureus nel brodo di soia triptico, o TSB. Integrato con 10 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo per un'incubazione di scuotimento durante la notte a 37 gradi Celsius. La mattina seguente, diluire 120 microlitri di campione di coltura in sei millilitri di TSB.Con 10 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo, per un'incubazione di due ore a 37 gradi Celsius e 200 rotazioni al minuto. Quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 0,5, trasferire tre millilitri di sospensione batterica in 10 millilitri ghiacciati DPBS. Dopo aver decantato attentamente il supernatante, aggiungere ulteriori DPBS refrigerati al pellet e vortice accuratamente i batteri ri-sospesi.Dopo una seconda centrifugazione, sospendere di nuovo il pellet batterico in 1,5 millilitri di PBS sul ghiaccio. Per verificare la concentrazione di batteri, diluire in serie 100 microlitri della sospensione batterica di un fattore da 1 x 10 al 4° e 1 x 10 al 5°, in PBS fresco. E piastra 20 microlitri di ogni diluizione su singole piastre di agar.Dopo un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius, conta il numero di unità che formano colonie per esame lordo per calcolare la concentrazione batterica del giorno precedente. Per il mento della pelle escisionale degli animali riceventi, confermare una mancanza di risposta al dito del dito, prima di radere una sezione di uno per due pollici sul retro del mouse. Pulire delicatamente per rimuovere eventuali peli randagi.E disinfettare la pelle esposta, con iodio sequenziale al 10% di povidone e applicazioni di garza imbevuta di etanolo al 70%. Spostandosi verso l'esterno dal centro dell'area chirurgica, in un modello a spirale. Dopo aver permesso alla pelle di asciugarsi per circa un minuto, premere saldamente una biopsia sterile a pugno di sei millimetri al centro dell'area chirurgica preparata.Ruotare la biopsia del punzone per creare un contorno circolare sulla pelle, che taglia completamente il tessuto cutaneo e almeno una sezione del contorno. Fare attenzione a non tagliare nella fascia o nel tessuto sottostante. Quindi utilizzare forbici sterili e forcep, per tagliare l'epidermide e il derma, seguendo il modello circolare impresso dalla biopsia del punzone.Per l'inoculazione di Staph aureus, riempire una siringa per insulina calibro 28 con 50 microlitri dell'inoculante batterico bioluminescente preparato. E usa un dito per tirare di lato il derma dell'animale ferito. Tenendo la siringa quasi parallela al tessuto, inserire lentamente la siringa nel tessuto fino a quando non si sente un'improvvisa diminuzione della resistenza.Indicando il piercing della fascia. Con l'ago posto al centro della ferita, consegnare lentamente l'intero volume dell'inoculante. Verificare che l'inoculante formi una bolla al centro della ferita, con perdite o dispersione minime.E rimuovere lentamente la siringa dall'animale. Quindi riportare l'animale nella sua gabbia con calore e monitoraggio fino al pieno recupero. Dopo il mento e l'infezione, e ogni giorno durante l'esperimento, posizionare il topo anestetizzato in un imager bioluminescente e florescence, con la ferita il più piatta possibile.Nel software imager, selezionare la luminescenza e fotografare come modalità di imaging. Il tempo di esposizione deve essere preimpostato a un minuto con un piccolo binning, F/Stop 1 per la luminescenza, F/Stop 8 per la fotografia e aperto per il filtro di emissione. Quindi fare clic su acquisisci, per registrare l'immagine.Per l'imaging a fluorescenza in vivo, selezionare la fluorescenza e fotografare, come modalità di imaging. Il tempo di esposizione deve essere preimpostato a un secondo a piccolo binning, F/Stop 1 per la fluorescenza, F/Stop 8 per la fotografia e lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 465 su 30 nanometri e 520 su 20 nanometri, con un'alta intensità della lampada, rispettivamente. Quindi fare clic su acquisisci per registrare l'immagine.Dopo aver ottenuto entrambi i set di immagini, riportare l'animale nella sua gabbia, con monitoraggio, fino al completo recupero. Per l'analisi delle immagini, apri l'immagine da quantificare, in un programma software di analisi delle immagini appropriato, e posiziona l'area circolare di interesse predefinita sull'intera area della ferita, inclusa la pelle circostante. Fare clic sulla regione di misura di interesse e registrare i valori per il flusso medio per la ferita, per consentire di tracciare il flusso medio di ogni segnale rispetto al tempo.Per misurare la guarigione della ferita, montare una regione circolare di interesse sul bordo della ferita e misurare l'area della ferita in centimetri al quadrato, per consentire la trama del cambiamento frazionato dalla linea di base rispetto al tempo. In questo esperimento rappresentativo, l'espressione condizionale EGFP myeloid differentiation primary response 88, Or MyD88 knockout mice, ha dimostrato una maggiore suscettibilità all'inoculazione di Staph aureus, rispetto all'EGFP non condizionale che esprimeva animali. Con una letalità dell'80% osservata durante i primi otto giorni di infezione.Entrambi i ceppi di topi hanno perso circa il 5% del loro peso corporeo immediatamente dopo l'infezione. Tuttavia, l'EGFP condizionale che esprimeva topi recuperava i loro pesi originali entro il secondo giorno. Mentre i topi MyD88 no.La chiusura delle ferite in presenza di infezione da Staph aureus non era diversa tra i due ceppi. Tuttavia, i topi knockout MyD88 feriti sterilemente, avevano un difetto significativo nella guarigione delle ferite, rispetto all'EGFP condizionale che esprimeva animali. L'imaging di animali interi ha rivelato un maggiore carico batterico, come evidenziato da un aumento del segnale bioluminescente nelle ferite degli animali knockout MyD88, rispetto all'EGFP condizionale che esprime animali.È stata osservata anche una diminuzione del 40% del traffico iniziale di neutrofili verso ferite non infette di animali knockout MyD88 rispetto all'EGFP condizionale che esprime animali. Quando 1 x 10 alla 7a colonia che forma unità di Staph aureus sono state introdotte immediatamente dopo il mento, il traffico di neutrofili è stato significativamente attenuato negli animali knockout rispetto all'EGFP condizionale che esprime animali. Prima di erogare i batteri, assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella siringa e che la posizione dell'ago sia posizionata correttamente al centro della ferita.I tessuti animali possono essere raccolti al punto finale per misurare l'espressione di proteine di interesse e diffusione batterica dalla ferita. Lo Staph aureus è contagioso per l'uomo. Pertanto, i dispositivi di protezione individuale devono essere indossati durante la manipolazione dei batteri e si deve prestare attenzione quando si maneggia una siringa contenente l'agente patogeno.Questa tecnica ha aiutato a esplorare l'uso di trattamenti biologici per le infezioni da Staph aureus che migliorano la risposta immunitaria innata degli ospiti contro le infezioni.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

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