Name: a mouse model to assess innate immune response to staphylococcus aureus infection
Uploaded: 2019-02-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pela National institutos de saúde subsídios R01 AI129302 (para s.i.s.) e o programa de formação em farmacologia: da bancada ao lado da cama na UC Davis (NIH T32 GM099608 para L.S.A). O Molecular e genômica Imaging (CMGI) na Universidade da Califórnia Davis fornecido suporte tecnológico soberbo.

Todos os estudos de rato foram revisados e aprovados pelo Comitê de uso na UC Davis e institucional Cuidado Animal e foram realizados de acordo com as diretrizes do Animal Welfare Act e o ato de extensão de pesquisa de saúde. Não se esqueça de usar luvas estéreis, ao trabalhar com animais.
1. mouse fonte e habitação
<ol><li>Derivar de camundongos LysM-eGFP sobre um fundo genético C57BL/6J conforme descrito anteriormente,12. Derive LysM-EGFP × MyD88- / -...

<ol>
	<li>Moran, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methicillin-Resistant+S.+aureus+Infections+among+Patients+in+the+Emergency+Department.">Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department.</a> New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).</li><li>Suaya, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+cost+of+hospitalizations+associated+with+Staphylococcus+aureus+skin+and+soft+tissue+infections+in+the+United+States+from+2001+through+2009.">Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P &amp; T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+use+and+its+consequences+for+the+normal+microbiome.">Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome.</a> Science. 352 (6285), 544-545 (2016).</li><li>Hilliard, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Alpha-Toxin+Monoclonal+Antibody+and+Antibiotic+Combination+Therapy+Improves+Disease+Outcome+and+Accelerates+Healing+in+a+Staphylococcus+aureus+Dermonecrosis+Model.">Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).</li><li>Proctor, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+for+Staphylococcus+aureus+vaccines:+clinical+and+basic+science+challenges.">Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges.</a> European Cells &amp; Materials. 30, 315-326 (2015).</li><li>M&#246;lne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Neutrophil+Leukocytes+in+Cutaneous+Infection+Caused+by+Staphylococcus+aureus.">Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).</li><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+Marrow+to+Microbes.">Neutrophils, from Marrow to Microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Miller, L. S., Cho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+against+Staphylococcus+aureus+cutaneous+infections.">Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).</li><li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catchup:+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes.">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li><li>Falahee, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Toxin+Regulates+Local+Granulocyte+Expansion+from+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Staphylococcus+aureus-Infected+Wounds.">&#945;-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds.</a> Journal of immunology. 199 (5), 1772-1782 (2017).</li><li>Kim, M. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Neutrophil+Infiltration+during+Cutaneous+Wound+Healing+and+Infection+Using+Fluorescence+Imaging.">Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).</li><li>Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+microscopy+of+host-pathogen+interactions+in+a+mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+skin+abscess+formation.">Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation.</a> Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).</li><li>Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+recruited+through+high+endothelial+venules+of+the+lymph+nodes+via+PNAd+intercept+disseminating+Staphylococcus+aureus.">Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).</li><li>Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+TLR2-Deficient+and+MyD88-Deficient+Mice+Are+Highly+Susceptible+to+Staphylococcus+aureus+Infection.">Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection.</a> The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).</li><li>Miller, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88+Mediates+Neutrophil+Recruitment+Initiated+by+IL-1R+but+Not+TLR2+Activation+in+Immunity+against+Staphylococcus+aureus.">MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus.</a> Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).</li><li>Macedo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+is+impaired+in+MyD88-deficient+mice:+a+role+for+MyD88+in+the+regulation+of+wound+healing+by+adenosine+A2A+receptors.">Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors.</a> The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).</li><li>Cho, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+IL-1&#946;+Is+Sufficient+for+Abscess+Formation+in+Immunity+against+Staphylococcus+aureus+in+Mice.">Neutrophil-derived IL-1&#946; Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).</li><li>Granick, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+recognition+by+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+via+TLR2/MyD88/PGE2+stimulates+granulopoiesis+in+wounds.">Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds.</a> Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).</li><li>Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+survival+and+c-kit+-progenitor+proliferation+in+Staphylococcus+aureus-infected+skin+wounds+promote+resolution.">Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution.</a> Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).</li><li>Foster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+evasion+by+staphylococci.">Immune evasion by staphylococci.</a> Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).</li><li>Gordon, R. J., Lowy, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus+Infection.">Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection.</a> Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).</li><li>Cho, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+IL-1&#946;+Is+Sufficient+for+Abscess+Formation+in+Immunity+against+Staphylococcus+aureus+in+Mice.">Neutrophil-derived IL-1&#946; Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).</li><li>Bernthal, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+post-arthroplasty+Staphylococcus+aureus+joint+infection+to+evaluate+in+vivo+the+efficacy+of+antimicrobial+implant+coatings.">A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).</li><li>Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+Luminescent+Staphylococcus+aureus+Clinical+Strains+for+Use+in+Bioluminescent+Imaging.">Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging.</a> PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).</li><li>Dillen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+&#947;&#948;+T+cells+protect+against+Staphylococcus+aureus+skin+reinfection.">Clonally expanded &#947;&#948; T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).</li></ol>

Modelos de infecção de S. aureus que utilizam bioluminescentes S. aureus infecção em um rato de repórter neutrófilos fluorescente em conjunto com técnicas avançadas de imagem óptica em vivo todo animal tem nossa conhecimento avançado da inata resposta imune à infecção. Usando o mouse LysM-EGFP de estudos anteriores mostraram que acima de 1 x 107 neutrófilos recruta para uma ferida infectada de S. aureus durante as primeiras 24 horas de infecção14</su...

Staphylococcus aureus (S. aureus) é responsável para a maioria das infecções na pele e tecidos moles (SSTIs) no Estados Unidos1. A incidência de methicillin-resistente S. aureus (MRSA) infecções aumentou constantemente durante as últimas duas décadas2, motivando o estudo dos mecanismos de persistência e a descoberta de novas estratégias de tratamento. O padrão de atendimento para infecções por MRSA é antibioticoterapia sistêmica, mas MRSA tornou-se cada vez mais resistente aos antibióticos ao longo do tempo3 e estas drogas podem diminuir microbiome benéfico do hospedeiro, causando efeitos negativos para a saúde, especialmente em crianças4. Estudos pré-clínicos examinaram estratégias alternativas para tratamento de infecções de MRSA5, mas traduzir essas abordagens à clínica revelou-se um desafio devido ao surgimento de fatores de virulência que frustrar de respostas imunes do anfitrião6. Para dissecar a dinâmica hospedeiro-patógeno daquela unidade SSTIs de S. aureus , combinamos não invasiva e leituras longitudinais do número de neutrófilos recrutaram para o leito da ferida com medidas cinéticas de abundância bacteriana e ferida área.
Os neutrófilos são os leucócitos circulantes mais abundante nos seres humanos e as socorristas para uma infecção bacteriana7. Os neutrófilos são um componente necessário para uma resposta eficaz do hospedeiro contra S. aureus infecções devido a seus mecanismos bactericidas, incluindo a produção de espécies reativas de oxigênio, proteases, peptídeos antimicrobianos e respostas funcionais incluindo a fagocitose e a produção de neutrófilos extracelular armadilha8,9. Pacientes humanos com defeitos genéticos na função dos neutrófilos, como a doença granulomatosa crônica e síndrome de Chediak-Higashi, mostram um aumento da susceptibilidade à infecção de S. aureus . Em adição, pacientes com genética (por exemplo, neutropenia congênita) e adquirida (como visto em pacientes de quimioterapia de neutropenia) defeitos em números de neutrófilos também são altamente suscetíveis a S. aureus infecção10. Dada a importância dos neutrófilos em compensação S. aureus infecções, aumentando a sua capacidade imune ou ajuste seus números dentro de uma lesão de S. aureus pode revelar uma estratégia eficaz na resolução de infecção.
Na última década, ratos transgénicos com repórteres de neutrófilos de fluorescência foram desenvolvidos para estudar seu tráfico de11,12. Combinar os ratos repórter neutrófilos com técnicas de imagem todo animais permite análise spatiotemporal de neutrófilos em tecidos e órgãos. Quando combinado com bioluminescentes cepas de S. aureus, é possível controlar o acúmulo de neutrófilos em resposta a abundância de S. aureus e persistência no contexto da virulência bacteriana fatores que direta e indiretamente perturb neutrófilos números no tecido afetado13,14,15,16.
Os ratos são menos suscetíveis a mecanismos de evasão de virulência e imune de S. aureus que os humanos. Como tal, ratos do selvagem-tipo não podem ser um modelo animal ideal para investigar a eficácia de um dado terapêutico para tratar a crônica de S. aureus infecção. Deficiência de MyD88 ratos (ou seja, MyD88- / - ratos), uma cepa de rato imunocomprometidos que carece de receptor funcional interleucina-1 (IL-1R) e Toll-like receptor (TLR) sinalização, mostrar maior susceptibilidade à infecção de S. aureus em comparação com rato do selvagem-tipo17 e um comprometimento em tráfico de neutrófilos para um site de S. aureus infecção na pele18. Desenvolvimento de uma cepa de rato que possui um repórter neutrófilos fluorescente no MyD88- / - ratos forneceu um modelo alternativo para investigar a eficácia de terapias para tratar a infecção de S. aureus em relação ao atual neutrófilos ratos de repórter.
Neste protocolo, podemos caracterizar a infecção de S. aureus nos imunocomprometidos LysM-EGFP × MyD88- / - ratos e comparar a evolução temporal e resolução de infecção com os camundongos LysM-EGFP. LysM-EGFP × MyD88- / - ratos desenvolvem uma infecção crônica que não resolve, e 75% sucumbem à infecção após 8 dias. Um defeito significativo no recrutamento de neutrófilos inicial ocorre mais de 72 h da fase inflamatória da infecção, e menos de 50% neutrófilos recrutam durante o último estágio da infecção. O aumento da susceptibilidade da LysM-EGFP × MyD88 ratos- / - isso torna particular Coe um rigoroso modelo pré-clínicos para avaliar a eficácia de novas técnicas terapêuticas visando a infecção de S. aureus em relação ao atual que modela Utilize o selvagem-tipo ratos, especialmente técnicas com o objetivo de aumentar a resposta imune inata contra infecção.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1101px;" width="1101">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:301px;">Falcon</td>
			<td style="width:229px;">352059</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6mm Disposable Biopsy Punch</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioluminescent S. aureus</td>
			<td>Lloyd Miller, Johns Hopkins&#160;</td>
			<td>ALC 2906 SH1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buprenoprhine hydrochloride injectable</td>
			<td>Western Medical Supply</td>
			<td>7292</td>
			<td>0.3 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Labratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloramphenicol (crystalline powder)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (1X)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin Syringes</td>
			<td>Becton, Dickson and Company</td>
			<td>329461</td>
			<td>.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2&#39;&#39;)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Living Image Software &#8211; IVIS Spectrum Series</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LysM-eGFP Mice</td>
			<td>Thomas Graff Albert Einstein College of New York&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyD88 KO Mice</td>
			<td>Jackson Labratory</td>
			<td>009088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-woven sponges</td>
			<td>AMD- Ritmed Inc</td>
			<td>A2101-CH</td>
			<td>5 cm x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Povidone Iodine 10% Solution</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>697731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 7.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>License&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Becton, Dickson and Company</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model to assess innate immune response to staphylococcus aureus infection

Staphylococcus aureus Infecções (S. aureus), incluindo manchas resistentes à meticilina, são uma enorme sobrecarga para o sistema de saúde. Com taxas de incidência de infecção de S. aureus escalada anualmente, há uma demanda para a pesquisa adicional em sua patogenicidade. Modelos animais de doenças infecciosas avançam nossa compreensão da resposta do hospedeiro-patógeno e levam ao desenvolvimento de terapêuticas eficazes. Os neutrófilos desempenham um papel primordial na resposta imune inata que controla infecções de S. aureus , formando um abscesso para parede a infecção e facilitar a remoção de bactérias; o número de neutrófilos que se infiltrar em uma infecção de pele de S. aureus , muitas vezes se correlaciona com o resultado de doença. Camundongos LysM-EGFP, que possuem a maior proteína verde fluorescente (EGFP) inserida na região promotora de lisozima M (LysM) (expressada principalmente por neutrófilos), quando usado em conjunto com imagens de fluorescência todo animal in vivo (FLI) fornecem um meios de quantificar a emigração dos neutrófilos canaliza e longitudinalmente na pele ferida. Quando combinado com um bioluminescentes S. aureus estirpe e sequencial imagem bioluminescente todo animal in vivo (BLI), é possível monitorar longitudinalmente a dinâmica do recrutamento de neutrófilos e vivo em carga bacteriana no local da infecção em ratos anestesiados desde precoce da infecção, a resolução ou a morte. Os ratos são mais resistentes a uma série de fatores de virulência produzido por S. aureus que facilitam a colonização eficaz e infecção em seres humanos. Camundongos imunodeficientes fornecem um modelo animal mais sensível para examinar persistente S. aureus infecções e a capacidade da terapêutica para impulsionar inatas respostas imunes. Neste documento, podemos caracterizar respostas em camundongos LysM-EGFP que foram criados para camundongos deficientes em MyD88 (LysM-EGFP × MyD88- / - ratos) juntamente com ratos de LysM-EGFP selvagem-tipo para investigar a infecção de ferida de pele de S. aureus . Multiespectral detecção simultânea habilitado o estudo da dinâmica de recrutamento dos neutrófilos usando FLI in vivo, carga bacteriana usando BLI in vivo e cicatrização longitudinalmente e de forma não invasiva ao longo do tempo.

LysM-EGFP × MyD88- / - os ratos são mais suscetíveis à infecção de S. aureus que camundongos LysM-EGFP
A cepa de S. aureus utilizado neste estudo, ALC290618, foi construído com um plasmídeo que contém a construção de lux que produz sinais bioluminescentes de bactérias vivas e ativamente metabolisante. Quando inoculado em camundongos, bioluminescênci...

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A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Uma abordagem é descrita para a detecção em tempo real da resposta imune inata de ferimento cutâneo e Staphylococcus aureus infecção de ratos. Por LysM-EGFP comparando os ratos (que possuem fluorescentes neutrófilos) com um LysM-EGFP mestiços cepa de rato imunodeficientes, avançamos nossa compreensão da infecção e o desenvolvimento de abordagens para combater a infecção.

Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

Técnicas que monitoram a carga das bactérias e um neutrófilo respondem simultaneamente podem fornecer insights sobre os mecanismos da persistência do Estafilococo e a eficácia das estratégias de tratamento. A principal vantagem desta técnica é que múltiplos parâmetros podem ser medidos longitudinalmente em um hospedeiro ao vivo durante toda a duração da infecção. É fundamental mostrar onde colocar a ferida em um dorso de rato, como extircular a pele, e como vacinar a ferida com Staph aureus.Comece descongelando a variedade de interesse do Estafáfi aureus de bioluminescência a partir do armazenamento negativo de 80 graus Celsius no gelo. Antes de estriar a cultura em um prato de ágar de sangue bovino de 5%. Para uma incubação noturna a 37 graus Celsius.Na manhã seguinte, transfira três para quatro colônias individuais da placa de Aureus estafilococos para o caldo de soja tptic, ou TSB. Complementado com 10 microgramas por mililitro de clororamfenicol para uma incubação de agitação durante a noite a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, diluir 120 microliters de amostra de cultura em seis mililitros de TSB.Com 10 microgramas por mililitro de clororamfenicol, para uma incubação de duas horas a 37 graus Celsius, e 200 rotações por minuto. Quando a densidade óptica em 600 nanômetros atingir 0,5, transfira três mililitros de suspensão bacteriana para 10 mililitros de DPBS gelados. Depois de decantar cuidadosamente o supernasce, adicione DPBS refrigerado adicional à pelota e o vórtice das bactérias re-suspensas completamente.Após uma segunda centrifugação, suspenda a pelota bacteriana em 1,5 mililitros de PBS no gelo. Para verificar a concentração de bactérias, diluir em série 100 microliters da suspensão bacteriana por um fator de 1 x 10 para o 4º, e 1 x 10 para o 5º, em PBS fresco. E placa 20 microliters de cada diluição em placas de ágar individuais.Após uma incubação noturna a 37 graus Celsius, conte o número de unidades formadoras de colônias por exame bruto para calcular a concentração bacteriana do dia anterior. Para ferimentos de pele excisional dos animais receptores, confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do pé, antes de raspar uma seção de uma a duas polegadas na parte de trás do camundongo. Limpe suavemente para remover os cabelos perdidos.E desinfetar a pele exposta, com iodo sequencial de 10%, e aplicações de gaze encharcada de 70% de etanol. Movendo-se para fora do centro da área cirúrgica, em um padrão espiral. Depois de permitir que a pele seque por cerca de um minuto, pressione firmemente uma biópsia estéril de seis milímetros no centro da área cirúrgica preparada.Torça a biópsia do soco para criar um contorno circular na pele, que corta completamente o tecido da pele, e pelo menos uma seção do contorno. Tomando o cuidado de não cortar a fáscia ou tecido subjacente. Em seguida, use uma tesoura estéril, e fórceps, para cortar a epiderme e a derme, seguindo o padrão circular impresso pela biópsia do soco.Para a inoculação de aureus estafilococos, encha uma seringa de insulina de 28 bitolas com 50 microliters do inoculante bacteriano bioluminescente preparado. E use um dedo para puxar a dermis do animal ferido para o lado. Segurando a seringa quase paralela ao tecido, insira lentamente a seringa no tecido até que uma diminuição repentina da resistência seja sentida.Indicando piercing da fáscia. Com a agulha colocada no centro da ferida, entregue lentamente todo o volume do inoculante. Confirme se o inoculante forma uma bolha no centro da ferida, com vazamento mínimo ou dispersão.E remova a seringa lentamente do animal. Em seguida, devolva o animal para sua gaiola com calor e monitoramento até a recuperação completa. Após ferimentos e infecções, e diariamente durante o experimento, coloque o rato anestesiado em um bioluminescente e florescence imager, com a ferida o mais plana possível.No software imager, selecione luminescência e fotografia como os modos de imagem. O tempo de exposição deve ser predefinido para um minuto em binning pequeno, F/Stop 1 para luminescência, F/Stop 8 para fotografia e aberto para o filtro de emissão. Em seguida, clique em adquirir, para gravar a imagem.Para imagens de fluorescência in vivo, selecione fluorescência e fotografia, como os modos de imagem. O tempo de exposição deve ser predefinido para um segundo em binning pequeno, F/Stop 1 para fluorescência, F/Stop 8 para fotografia, e comprimentos de onda excitação e emissão de 465 sobre 30 nanômetros, e 520 sobre 20 nanômetros, com uma lâmpada de alta intensidade, respectivamente. Em seguida, clique em adquirir para gravar a imagem.Após a obtenção de ambos os conjuntos de imagens, devolva o animal para sua gaiola, com monitoramento, até a recuperação completa. Para análise de imagem, abra a imagem a ser quantificada, em um programa de software de análise de imagem apropriado, e coloque a região circular padrão de interesse sobre toda a área da ferida, incluindo a pele circundante. Clique em medir a região de interesse e regissore os valores para o fluxo médio da ferida, para permitir que o fluxo médio de cada sinal seja plotado versus o tempo.Para medir a cicatrização da ferida, coloque uma região circular de interesse sobre a borda da ferida, e meça a área da ferida em centímetros quadrados, para permitir a plotagem da mudança fracionária da linha de base versus o tempo. Neste experimento representativo, a expressão EGFP condicional resposta primária de diferenciação 88, ou MyD88 ratos nocautes, demonstrou maior suscetibilidade à inoculação de estafilococos, do que animais expressos não condicionalmente EGFP. Com uma letalidade de 80% observada durante os primeiros oito dias de infecção.Ambas as cepas de camundongos perderam aproximadamente 5% de seus pesos corporais imediatamente após a infecção. No entanto, os camundongos expressos egfp condicional recuperaram seus pesos originais no segundo dia. Enquanto os ratos MyD88 não.O fechamento da ferida na presença da infecção por Estafilococos não foi diferente entre as duas cepas. No entanto, camundongos de nocaute MyD88 estéril, apresentaram um defeito significativo na cicatrização de feridas, em comparação com animais expressos condicionalmente EGFP. Imagens animais inteiras revelaram uma maior carga bacteriana, como evidenciado por um aumento do sinal bioluminescente nas feridas de animais de nocaute MyD88, em comparação com animais expressos condicionalmente EGFP.Também foi observada uma redução de 40% no tráfico inicial de neutrófilos para feridas não infectadas de animais de efeito de myd88, em comparação com animais expressos condicionalmente EGFP. Quando 1 x 10 à 7ª colônia formando unidades de Staph aureus foram introduzidas imediatamente após o ferimento, o tráfico de neutrófilos foi significativamente atenuado em animais de nocaute em comparação com animais expressos condicionalmente EGFP. Antes de dispensar as bactérias, certifique-se de que não há bolhas de ar na seringa, e que a localização da agulha esteja corretamente posicionada no centro da ferida.Os tecidos animais podem ser colhidos no ponto final para medir a expressão de proteínas de interesse e disseminação bacteriana da ferida. Staph aureus é contagioso para os humanos. Como tal, os equipamentos de proteção individual devem ser usados ao manusear as bactérias, e deve-se ter cuidado ao manusear uma seringa contendo o patógeno.Esta técnica ajudou a explorar o uso de tratamentos biológicos para infecções por Estafilococos aureus que aumentam a resposta imune inata dos hospedeiros contra a infecção.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

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Infecção subcutânea de Staphylococcus aureus resistente (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Imunologia e Infecção

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

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Modelo Experimental de Endocardite resistente à meticilina<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) em Rato

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

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Staphylococcus aureus usando hemoglobina humana como uma fonte de ferro

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Quantificação da Resposta explosão respiratória como um indicador da imunitário inatas Saúde em Zebrafish

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Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

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In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

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Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

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The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

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The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

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