Name: a mouse model to assess innate immune response to staphylococcus aureus infection
Uploaded: 2019-02-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el nacional institutos de salud becas R01 AI129302 (a SIS) y el programa de capacitación en farmacología: de banco a cabecera en UC Davis (NIH T32 GM099608 a L.S.A). Molecular y genómica Imaging (CMGI) en la Universidad de California en Davis proporcionan excelente soporte tecnológico.

Se revisaron todos los estudios del ratón fueron realizados según los lineamientos de la ley de Bienestar Animal y la ley de extensión de investigación de salud y aprobado por el cuidado institucional de animales y uso en UC Davis. Asegúrese de usar guantes estériles cuando se trabaja con animales.
1. ratón fuente y vivienda
<ol><li>EGFP LysM ratones en un fondo genético de C57BL/6J se derivan como se describió anteriormente12. Derivan LysM-EGFP × MyD88...

<ol>
	<li>Moran, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methicillin-Resistant+S.+aureus+Infections+among+Patients+in+the+Emergency+Department.">Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department.</a> New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).</li><li>Suaya, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+cost+of+hospitalizations+associated+with+Staphylococcus+aureus+skin+and+soft+tissue+infections+in+the+United+States+from+2001+through+2009.">Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P &amp; T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+use+and+its+consequences+for+the+normal+microbiome.">Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome.</a> Science. 352 (6285), 544-545 (2016).</li><li>Hilliard, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Alpha-Toxin+Monoclonal+Antibody+and+Antibiotic+Combination+Therapy+Improves+Disease+Outcome+and+Accelerates+Healing+in+a+Staphylococcus+aureus+Dermonecrosis+Model.">Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).</li><li>Proctor, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+for+Staphylococcus+aureus+vaccines:+clinical+and+basic+science+challenges.">Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges.</a> European Cells &amp; Materials. 30, 315-326 (2015).</li><li>M&#246;lne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Neutrophil+Leukocytes+in+Cutaneous+Infection+Caused+by+Staphylococcus+aureus.">Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).</li><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+Marrow+to+Microbes.">Neutrophils, from Marrow to Microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Miller, L. S., Cho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+against+Staphylococcus+aureus+cutaneous+infections.">Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).</li><li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catchup:+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes.">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li><li>Falahee, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Toxin+Regulates+Local+Granulocyte+Expansion+from+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Staphylococcus+aureus-Infected+Wounds.">&#945;-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds.</a> Journal of immunology. 199 (5), 1772-1782 (2017).</li><li>Kim, M. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Neutrophil+Infiltration+during+Cutaneous+Wound+Healing+and+Infection+Using+Fluorescence+Imaging.">Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).</li><li>Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+microscopy+of+host-pathogen+interactions+in+a+mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+skin+abscess+formation.">Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation.</a> Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).</li><li>Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+recruited+through+high+endothelial+venules+of+the+lymph+nodes+via+PNAd+intercept+disseminating+Staphylococcus+aureus.">Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).</li><li>Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+TLR2-Deficient+and+MyD88-Deficient+Mice+Are+Highly+Susceptible+to+Staphylococcus+aureus+Infection.">Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection.</a> The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).</li><li>Miller, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88+Mediates+Neutrophil+Recruitment+Initiated+by+IL-1R+but+Not+TLR2+Activation+in+Immunity+against+Staphylococcus+aureus.">MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus.</a> Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).</li><li>Macedo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+is+impaired+in+MyD88-deficient+mice:+a+role+for+MyD88+in+the+regulation+of+wound+healing+by+adenosine+A2A+receptors.">Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors.</a> The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).</li><li>Cho, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+IL-1&#946;+Is+Sufficient+for+Abscess+Formation+in+Immunity+against+Staphylococcus+aureus+in+Mice.">Neutrophil-derived IL-1&#946; Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).</li><li>Granick, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+recognition+by+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+via+TLR2/MyD88/PGE2+stimulates+granulopoiesis+in+wounds.">Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds.</a> Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).</li><li>Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+survival+and+c-kit+-progenitor+proliferation+in+Staphylococcus+aureus-infected+skin+wounds+promote+resolution.">Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution.</a> Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).</li><li>Foster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+evasion+by+staphylococci.">Immune evasion by staphylococci.</a> Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).</li><li>Gordon, R. J., Lowy, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus+Infection.">Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection.</a> Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).</li><li>Cho, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+IL-1&#946;+Is+Sufficient+for+Abscess+Formation+in+Immunity+against+Staphylococcus+aureus+in+Mice.">Neutrophil-derived IL-1&#946; Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).</li><li>Bernthal, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+post-arthroplasty+Staphylococcus+aureus+joint+infection+to+evaluate+in+vivo+the+efficacy+of+antimicrobial+implant+coatings.">A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).</li><li>Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+Luminescent+Staphylococcus+aureus+Clinical+Strains+for+Use+in+Bioluminescent+Imaging.">Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging.</a> PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).</li><li>Dillen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+&#947;&#948;+T+cells+protect+against+Staphylococcus+aureus+skin+reinfection.">Clonally expanded &#947;&#948; T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).</li></ol>

Modelos de infección de S. aureus que utilizan bioluminiscente S. aureus la infección en un ratón fluorescente reportera neutrófilo junto con técnicas avanzadas de proyección de imagen óptica in vivo todo animal ha avanzado nuestro conocimiento de lo innato respuesta inmune a la infección. Estudios anteriores utilizando el ratón LysM-EGFP han demostrado que hasta 1 x 107 neutrófilos recluta a una herida infectada de S. aureus en las primeras 24 h de infección<sup class="xr...

Staphylococcus aureus (S. aureus) representa la mayoría de la piel y las infecciones de tejidos blandos (SETSI) en los Estados Unidos1. La incidencia de methicillin-resistente S. aureus (MRSA) infecciones ha aumentado constantemente en los últimos dos décadas2, motivar el estudio de los mecanismos de persistencia y el descubrimiento de nuevas estrategias de tratamiento. El estándar del cuidado para las infecciones de MRSA es la terapia antibiótico sistémica, pero MRSA se ha convertido en cada vez más resistente a los antibióticos en tiempo3 y estas drogas pueden disminuir la microbioma beneficiosos del anfitrión, causando efectos negativos en la salud, especialmente en los niños4. Estudios preclínicos han examinado estrategias alternativas para el tratamiento de las infecciones de MRSA5, pero traducir estos enfoques a la clínica ha demostrado ser un reto debido a la aparición de factores de virulencia que frustrar anfitrión inmunorespuestas6. Para diseccionar la dinámica huésped-patógeno que impulsan S. aureus SETSI, combinamos no invasiva y longitudinales lecturas del número de neutrófilos reclutaron al lecho de la herida con medidas cinéticas de la abundancia bacteriana y área de la herida.
Neutrófilos son los leucocitos circulantes más abundantes en los seres humanos y los primeros respondientes a una infección bacteriana7. Neutrófilos son un componente necesario para una respuesta eficaz del anfitrión contra infecciones por S. aureus debido a sus mecanismos bactericidas, incluyendo la producción de especies reactivas del oxígeno, proteasas, péptidos antimicrobianos y respuestas funcionales como fagocitosis neutrófilo trampa extracelular producción8,9. Pacientes humanos con defectos genéticos en la función del neutrófilo, como el síndrome de Chediak-Higashi, enfermedad granulomatosa crónica muestran una mayor susceptibilidad a la infección por S. aureus . Además, los pacientes con genética (como la neutropenia congénita) y adquiridas (como la neutropenia en pacientes de la quimioterapia) defectos en los números de neutrófilos también son altamente susceptibles a la infección de S. aureus 10. Dada la importancia de los neutrófilos en la limpieza de las infecciones de S. aureus , potenciar su capacidad inmune o templar sus números dentro de una lesión de S. aureus puede resultar una estrategia eficaz en la resolución de la infección.
En la última década, se han desarrollado ratones transgénicos con reporteros neutrófilo fluorescencia para estudiar su tráfico de11,12. Combinación de ratones reportero neutrófilo con técnicas de imagen todo animales permite análisis espacio-temporales de los neutrófilos en los tejidos y órganos. Cuando se combina con bioluminiscentes cepas de S. aureus, es posible rastrear la acumulación de neutrófilos en respuesta a la abundancia de S. aureus y persistencia en el contexto de la virulencia bacteriana factores que directa e indirectamente perturbar el número de neutrófilo en el tejido afectado13,14,15,16.
Los ratones son menos susceptibles a S. aureus virulencia e inmune mecanismos de evasión que los seres humanos. Como tal, ratones de tipo salvaje no pueden ser un modelo animal ideal para investigar la eficacia de un dado terapéutica para el tratamiento crónico de S. aureus la infección. Ratones deficientes en MyD88 (es decir, MyD88- / - ratones), una cepa de ratón immunocompromised que carece de receptores funcionales de interleukin-1 (IL-1R) y Toll-like receptor (TLR) de señalización, mostrar mayor susceptibilidad a la infección por S. aureus en comparación con ratones de tipo salvaje17 y un deterioro en el tráfico de neutrófilos al sitio de la infección de S. aureus en la piel18. Desarrollo de una cepa de ratón que posee un reportero fluorescente neutrófilo en ratones- / - MyD88 ha proporcionado un modelo alternativo para la investigación de la eficacia de terapias para tratar la infección de S. aureus en comparación con el actual recuento de neutrófilos ratones de reportero.
En este protocolo, caracterizan a la infección de S. aureus en los inmunocomprometidos LysM-EGFP × MyD88- / - ratones y comparar la evolución temporal y la resolución de la infección con los ratones LysM-EGFP. MyD88- / - ratones de EGFP LysM × desarrollan una infección crónica que no se resuelve, y 75% sucumben a la infección después de 8 días. Un defecto importante en el reclutamiento inicial de neutrófilo ocurre más de 72 h de la fase inflamatoria de la infección, y reclutan neutrófilos de menos de 50% durante la última etapa de la infección. El aumento de la susceptibilidad del × LysM-EGFP MyD88- / - ratones hace que este particular colar un riguroso modelo preclínico para evaluar la eficacia de nuevas técnicas terapéuticas dirigidas a la infección por S. aureus en comparación con el actual modelos utilizar ratones de tipo salvaje, especialmente las técnicas con el objetivo de potenciar la respuesta inmune innata contra la infección.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1101px;" width="1101">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:301px;">Falcon</td>
			<td style="width:229px;">352059</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6mm Disposable Biopsy Punch</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioluminescent S. aureus</td>
			<td>Lloyd Miller, Johns Hopkins&#160;</td>
			<td>ALC 2906 SH1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buprenoprhine hydrochloride injectable</td>
			<td>Western Medical Supply</td>
			<td>7292</td>
			<td>0.3 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Labratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloramphenicol (crystalline powder)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (1X)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin Syringes</td>
			<td>Becton, Dickson and Company</td>
			<td>329461</td>
			<td>.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2&#39;&#39;)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Living Image Software &#8211; IVIS Spectrum Series</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>128113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LysM-eGFP Mice</td>
			<td>Thomas Graff Albert Einstein College of New York&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microvolume Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyD88 KO Mice</td>
			<td>Jackson Labratory</td>
			<td>009088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-woven sponges</td>
			<td>AMD- Ritmed Inc</td>
			<td>A2101-CH</td>
			<td>5 cm x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Povidone Iodine 10% Solution</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>697731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 7.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>License&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Becton, Dickson and Company</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model to assess innate immune response to staphylococcus aureus infection

Staphylococcus aureus Infecciones (S. aureus), incluyendo las manchas resistentes a la meticilina, son una enorme carga en el sistema de salud. Con tasas de incidencia de infección de S. aureus que sube anualmente, hay una demanda para la investigación adicional en su patogenicidad. Modelos animales de enfermedades infecciosas avanzan nuestro entendimiento de la respuesta del huésped-patógeno y conducen al desarrollo de la terapéutica eficaz. Neutrófilos juegan un papel primario en la respuesta inmune innata que controla las infecciones de S. aureus mediante la formación de un absceso de la pared la infección y facilitar la remoción bacteriana; el número de neutrófilos que infiltran a menudo una infección de la piel de S. aureus se correlaciona con el resultado de la enfermedad. Ratones LysM-EGFP, que poseen la mayor proteína verde fluorescente (EGFP) en la región del promotor lisozima M (LysM) (expresada sobre todo por los neutrófilos), cuando se utiliza junto con imágenes de fluorescencia de todo animal en vivo (FLI) proporcionan un medio de cuantificar la emigración de neutrófila no invasor y longitudinalmente en la piel herida. Cuando se combina con un bioluminiscente S. aureus cepa y secuencial en vivo todo animal bioluminiscente la proyección de imagen (BLI), es posible monitorizar longitudinalmente la dinámica de reclutamiento de neutrófilos y la carga bacteriana en vivo en el sitio de infección en ratones anestesiados de aparición de la infección a la resolución o la muerte. Los ratones son más resistentes a un número de factores de virulencia de S. aureus que facilitan la efectiva colonización y la infección en seres humanos. Ratones inmunodeficientes son un modelo animal más sensible para examinar persistente S. aureus las infecciones y la capacidad de la terapéutica para estimular la respuesta inmune innata. Aquí, se caracterizan las respuestas en ratones LysM-EGFP que han sido criados a los ratones deficientes en MyD88 (EGFP LysM × MyD88- / - ratones) junto con ratones de tipo salvaje LysM-EGFP investigar S. aureus piel infección de la herida. Detección simultánea multiespectral había habilitado estudio de dinámica de reclutamiento de neutrófilos mediante el uso de FLI en vivo, carga bacteriana mediante el uso de BLI en vivo y cicatrización longitudinalmente y no invasor con el tiempo.

MyD88- / - ratones de EGFP LysM × son más susceptibles a la infección por S. aureus que ratones LysM-EGFP
La cepa de S. aureus utilizados en este estudio, ALC290618, fue construido con un plásmido que contiene el concepto de lux que produce señales bioluminiscentes de bacteria metabolizante activamente y en vivo. Cuando se inocula en ratones, bioluminiscenc...

Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection at JoVE.com

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Se describe un enfoque para la detección en tiempo real de la respuesta inmune innata a heridas cutáneas y la infección de Staphylococcus aureus de los ratones. Por que comparan LysM-EGFP ratones (que poseen fluorescentes neutrófilos) con un LysM-EGFP mestizas cepa de ratón inmunodeficiente, avanzar en nuestra comprensión de la infección y el desarrollo de enfoques para combatir la infección.

Un modelo de ratón para evaluar respuesta inmune innata a la infección por Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

Las técnicas que monitorean la carga bacteriana y un neutrófilo responden simultáneamente pueden proporcionar información sobre los mecanismos de persistencia de Staph aureus y la eficacia de las estrategias de tratamiento. La principal ventaja de esta técnica es que múltiples parámetros se pueden medir longitudinalmente en un huésped vivo durante toda la duración de la infección. Es fundamental mostrar dónde colocar la herida en un dorso de ratón, cómo extirpar la piel y cómo inocular la herida con Staph aureus.Comience descongelando la bioluminiscencia Estafilocoa aureus cepa de interés de almacenamiento negativo de 80 grados Celsius en hielo. Antes de rayar el cultivo en un plato de agar sangre bovino del 5%. Para una incubación nocturna a 37 grados centígrados.A la mañana siguiente, transfiera de tres a cuatro colonias individuales del plato Staph a aureus al caldo de soja tríptico, o TSB. Suplementado con 10 microgramos por mililitro de cloramphenicol para una incubación de temblores durante la noche a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente, diluir 120 microlitros de muestra de cultivo en seis mililitros de TSB.Con 10 microgramos por mililitro de cloramphenicol, para una incubación de dos horas a 37 grados celsius, y 200 rotaciones por minuto. Cuando la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 0,5, transfiera tres mililitros de suspensión bacteriana a 10 mililitros DPBS helados. Después de decantar cuidadosamente el sobrenadante, agregue DPBS refrigerado adicional al pellet, y vórtice las bacterias re-suspendidas a fondo.Después de una segunda centrifugación, vuelva a suspender el pellet bacteriano en 1,5 mililitros de PBS sobre hielo. Para verificar la concentración de bacterias, diluir en serie 100 microlitros de la suspensión bacteriana por un factor de 1 x 10 a la 4a, y 1 x 10 a la 5a, en PBS fresco. Y placa 20 microlitros de cada dilución en placas de agar individuales.Después de una incubación durante la noche a 37 grados centígrados, cuente el número de unidades formadoras de colonias mediante un examen bruto para calcular la concentración bacteriana del día anterior. Para heridas de la piel por escisión de los animales receptores, confirme una falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo. Limpie suavemente para eliminar los pelos perdidos.Y desinfectar la piel expuesta, con 10%yodo de povidona secuencial, y 70%aplicaciones de gasa empapada de etanol. Moviéndose hacia afuera desde el centro del área quirúrgica, en un patrón espiral. Después de permitir que la piel se seque durante aproximadamente un minuto, presione firmemente una biopsia de punzón estéril de seis milímetros en el centro del área quirúrgica preparada.Gire la biopsia de punzonado para crear un contorno circular en la piel, que corte completamente el tejido de la piel y al menos una sección del contorno. Teniendo cuidado de no cortar en la fascia o tejido subyacente. Luego usa tijeras estériles, y fórceps, para cortar la epidermis y la dermis, siguiendo el patrón circular impreso por la biopsia de punzón.Para la inoculación de estafilococo, llene una jeringa de insulina de calibre 28 con 50 microlitros del inoculante bacteriano bioluminiscente preparado. Y usa un dedo para tirar de la dermis del animal herido a un lado. Sosteniendo la jeringa casi paralela al tejido, inserte lentamente la jeringa en el tejido hasta que se sienta una disminución repentina de la resistencia.Indicando perforación de la fascia. Con la aguja colocada en el centro de la herida, entregue lentamente todo el volumen del inoculante. Confirme que el inoculante forma una burbuja en el centro de la herida, con una fuga o dispersión mínima.Y retire la jeringa lentamente del animal. A continuación, devolver el animal a su jaula con calor y monitoreo hasta la recuperación completa. Después de la herida y la infección, y diariamente durante el experimento, coloque el ratón anestesiado en un imágenes bioluminiscente y de florescencia, con la herida lo más plana posible.En el software imager, seleccione luminiscencia y fotografía como modos de imagen. El tiempo de exposición debe preestablecerse en un minuto en binning pequeño, F/Stop 1 para luminiscencia, F/Stop 8 para fotografía y abierto para el filtro de emisión. A continuación, haga clic en adquirir para grabar la imagen.Para imágenes de fluorescencia in vivo, seleccione fluorescencia y fotografíe, como modos de imagen. El tiempo de exposición debe preestablecerse a un segundo en binning pequeño, F/Stop 1 para fluorescencia, F/Stop 8 para fotografía y longitudes de onda de excitación y emisión de 465 sobre 30 nanómetros, y 520 sobre 20 nanómetros, con una alta intensidad de lámpara, respectivamente. A continuación, haga clic en adquirir para grabar la imagen.Después de obtener ambos conjuntos de imágenes, devolver el animal a su jaula, con monitoreo, hasta la recuperación completa. Para el análisis de imágenes, abra la imagen que se va a cuantificar, en un programa de software de análisis de imágenes adecuado, y coloque la región circular predeterminada de interés sobre toda el área de la herida, incluida la piel circundante. Haga clic en Medir la región de interés y registre los valores del flujo medio de la herida, para permitir que el flujo medio de cada señal se trace frente al tiempo.Para medir la cicatrización de la herida, ajuste una región circular de interés sobre el borde de la herida y mida el área de la herida en centímetros al cuadrado, para permitir el trazado del cambio fraccionario desde el valor basal frente al tiempo. En este experimento representativo, la expresión condicional de EGFP mieloid respuesta primaria 88, o ratones noqueados MyD88, demostró una mayor susceptibilidad a la inoculación de Staph aureus, que la expresión de animales no condicional EGFP. Con un 80% de letalidad observado durante los primeros ocho días de infección.Ambas cepas de ratones perdieron aproximadamente el 5% de su peso corporal inmediatamente después de la infección. Sin embargo, el EGFP condicional que expresaba ratones recuperó sus pesos originales en el segundo día. Mientras que los ratones MyD88 no lo hicieron.El cierre de la herida en presencia de la infección por Estafilococo no fue diferente entre las dos cepas. Sin embargo, los ratones myD88 noqueadores heridos estérilmente.tenían un defecto significativo en la cicatrización de heridas, en comparación con los animales que expresan EGFP condicionalmente. Las imágenes de animales enteros revelaron una mayor carga bacteriana, como lo demuestra un aumento de la señal bioluminiscente en las heridas de los animales noqueados MyD88, en comparación con los animales que expresan EGFP condicionalmente.También se observó una disminución del 40% en el tráfico inicial de neutrófilos a heridas no infectadas de animales noqueados de MyD88, en comparación con los animales de expresión de EGFP condicionales. Cuando se introdujeron de 1 x 10 a la 7a colonia unidades formadoras de Staph aureus inmediatamente después de las heridas, el tráfico de neutrófilos se atenió significativamente en animales noqueados en comparación con los animales que expresaban la EGFP condicional. Antes de dispensar las bacterias, asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa y de que la ubicación de la aguja esté correctamente colocada en el centro de la herida.Los tejidos animales se pueden cosechar en el punto final para medir la expresión de proteínas de interés y la diseminación bacteriana de la herida. El estafilococo aureus es infeccioso para los humanos. Como tal, se debe usar equipo de protección personal al manipular las bacterias, y se debe tener precaución al manipular una jeringa que contenga el patógeno.Esta técnica ha ayudado a explorar el uso de tratamientos biológicos para las infecciones por Staph aureus que mejoran la respuesta inmune innata de los huéspedes contra la infección.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Subcutánea infección de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Modelo experimental de endocarditis Resistente a la Meticilina<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (SARM) en la rata

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Crecimiento con hemoglobina humana como una fuente de hierro

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

El análisis in vitro de la respuesta inmune celular Myd88 mediada por el Virus del Nilo Occidental cepa mutante Infección

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infección

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Un modelo de administración Oral de Galleria mellonella para la respuesta inmune innata Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Cuantificación de la citotoxicidad de Staphyloccus aureus contra leucocitos polimorfonucleares humanos

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Aislamiento de células mononucleares tonitarias para estudiar las respuestas inmunitarias innatas ex vivo en un tejido linfático mucoso humano

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...