Name: primary culture of rat adrenocortical cells and assays of steroidogenic functions
Uploaded: 2019-03-12T12:30:00
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Ce travail a été soutenu par une subvention de la Taiwan National de conseil scientifique (NSC102-2320-B-037-008-MY3) et une subvention de recherche kit de développement National Cheng-Kung University hôpital (NCKUH-10102045).

Toutes les procédures y compris les sujets animaux ont été approuvés par animalier institutionnel et utilisation Comité de Kaohsiung Medical University.
1. marche à suivre
<ol><li>Sacrifier les rats de SD femelle/mâle adulte (8 à 12 semaines) en CO2 euthanasie.</li>
	<li>Appliquer de l’éthanol à 70 % et laissez-le être absorbée par la peau et puis essuyer la peau avec un papier de soie.</li>
	<li>Mettre le rat sur une plaque de plastique propre en décubitus dorsal.<...

<ol>
	<li>Frith, C. H., Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histology,+Adrenal+Gland,+Mouse.">Histology, Adrenal Gland, Mouse.</a> Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. , 8-12 (1983).</li><li>Keegan, C. E., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+organogenesis+of+the+adrenal+cortex.">Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex.</a> Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).</li><li>Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).</li><li>Chrousos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic-pituitary-adrenal+axis+and+immune-mediated+inflammation.">The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation.</a> New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).</li><li>Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+and+steroidogenesis.">Cytokines and steroidogenesis.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 135-141 (2004).</li><li>Bielohuby, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+analysis+of+the+mouse+adrenal+gland+from+weaning+to+adulthood:+time-+and+gender-dependent+alterations+of+cell+size+and+number+in+the+cortical+compartment.">Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).</li><li>van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenal+glands+of+mouse+and+rat+do+not+synthesize+androgens.">Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens.</a> Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).</li><li>Wang, T., Rainey, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adrenocortical+carcinoma+cell+lines.">Human adrenocortical carcinoma cell lines.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).</li><li>Payne, A. H., Hales, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+steroidogenic+enzymes+in+the+pathway+from+cholesterol+to+active+steroid+hormones.">Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones.</a> Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).</li><li>Ruggiero, C., Lalli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+ACTH+Signaling+on+Transcriptional+Regulation+of+Steroidogenic+Genes.">Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes.</a> Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).</li><li>Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Toona+sinensis-stimulated+adrenal+steroidogenesis+in+primary+rat+adrenal+cells.">Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells.</a> Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).</li><li>Rybak, S. M., Ramachandran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+normal+rat+adrenocortical+cells.+I.+Culture+conditions+for+optimal+growth+and+function.">Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function.</a> In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).</li><li>Rybak, S. M., Ramachandran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+normal+rat+adrenocortical+cells.+II.+Quantitation+of+steroid+dehydrogenase+stain.">Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain.</a> In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).</li><li>O'Hare, M. J., Neville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+metabolism+by+adult+rat+adrenocortical+cells+in+monolayer+culture.">Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture.</a> Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).</li><li>Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+cell+proliferation+and+steroidogenesis+in+cultured+human+fetal+adrenal+cells+chronically+exposed+to+adrenocorticotropic+hormone:+rationalization+of+in+vitro+and+in+vivo+findings.">Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings.</a> Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).</li><li>Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+adipocyte+biology.+The+perilipin+family+of+structural+lipid+droplet+proteins:+stabilization+of+lipid+droplets+and+control+of+lipolysis.">Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis.</a> Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).</li><li>Hoeflich, A., Bielohuby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+adrenal+gland+growth:+signal+integration+by+extracellular+signal+regulated+kinases1/2.">Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).</li><li>O'Hare, M. J., Neville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+responses+to+corticotrophin+and+cyclic+AMP+by+adult+rat+adrenocortical+cells+in+monolayer+culture.">Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture.</a> Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).</li></ol>

Les glandes surrénales jouent un rôle clé dans l’adaptation environnementale3. Le par lequel la corticosurrénale sécrète l’hormone permettant de régler et ajuster les fonctions physiologiques et l’homéostasie du3. Le modèle in vivo reflète les effets réels physiologiques dans le corps. Toutefois, il est toujours influencée par de nombreux facteurs complexes, provoquant des effets instables dans les expériences. En revanche, le modèle in vitro de cellules...

Le système endocrinien est chargé de réglementer les activités physiologiques et l’homéostasie du1. Les glandes surrénales situées au pôle crânial des reins sont l’un des principaux organes endocrines qui sécrètent les minéralocorticoïdes, glucocorticoïdes et androgènes2,3. Il y a deux parties distinctes de la glande surrénale : le cortex et la médulla. Le cortex surrénalien se compose de trois couches : la glomérulée externe, le fasciculata intermédiaire et les reticularis interne3. La zone glomérulée est le site original de sécrétion d’aldostérone, un minéralocorticoïde, qui facilite en résorbant les ions sodium et eau dans les reins à3. Le fasciculata de zona produit principalement un niveau basal des glucocorticoïdes dans des conditions physiologiques normales3. Corticostéroïdes chez les rongeurs et le cortisol chez l’homme agissent pour aider le corps à gérer le stress en régulant le débit sanguin de glucose3. Dans une certaine mesure, ils peuvent inhiber les réponses inflammatoires et réguler le système immunitaire4,5. Contrairement aux autres mammifères, les souris et les rats n’ont pas un reticularis de zona fonctionnelle en raison de l’absence d’une expression 17α-hydroxylase dans la glande surrénale6,7. Ainsi, les glandes surrénales de rats et de souris sont dépourvues de la sécrétion des stéroïdes de C-19 surrénales (cortisol et androgènes surrénaux).
Primaire des cellules corticosurrénales ont est avérés utile pour étudier les mécanismes contrôlant la physiologie surrénalienne8. Comme les autres tissus stéroïdogènes, chaque zone surrénalienne synthétise ses stéroïdes du cholestérol libre9. Lors de la stimulation de l’hormone adrénocorticotrope (ACTH), le cholestérol libre est libéré de gouttelettes lipidiques de ventilation et, par conséquent, améliore la production de stéroïdes chez le fasciculata et reticularis10.
Plusieurs groupes ont tenté d’établir des lignées stables de carcinomes corticosurrénales. Toutefois, plusieurs préoccupations ont limité l’utilisation de lignées de cellules corticosurrénaliennes comme vitro modèles8. Les réponses de stéroïdes de lignées cellulaires peuvent différer entre les passages, le numéro de lot du sérum et la qualité du sérum, etc.. En outre, des lignées de cellules surrénaliennes commerciale (Y1 et SW13) ne pas sécréter corticostérone, rendant plus difficile à étudier la stéroïdogénèse surrénalienne8. L’utilisation des surrénales bovines et équines comme ex vivo modèles peuvent être un bon choix, même si les tissus de ces marchés peuvent occulter certains risques inconnus. Comparé à eux, gestion des glandes surrénales de rat est plus facile et la source est relativement plus stable et exempts de micro-organismes pathogènes. Pris ensemble, la présente méthode décrite ici pourrait être utilisée pour étudier le mécanisme de synthèse de la corticostérone dans les cellules surrénales fasciculata rat.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>female/ male, SD/Wistar rats (8-12 wk)</td>
			<td>BioLASCO</td>
			<td></td>
			<td>male or femal rats are suitable for experiments. Female&#39;s adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6885</td>
			<td>isolation of adrenal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12800-017</td>
			<td>powder media for adrenal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21700-075</td>
			<td>powder media for adrenal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>JT.baker</td>
			<td>4018</td>
			<td>buffer (powder)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>JT.baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>16050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12103C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved forceps</td>
			<td>BRAUN</td>
			<td>BD343R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>BRAUN</td>
			<td>BD331R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>BRAUN</td>
			<td>BC224R</td>
			<td>cut rat skin and muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>delicate scissor</td>
			<td>BRAUN</td>
			<td>BC101R</td>
			<td>cut adrenal glands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adipose-differentiation related protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108323</td>
			<td>antibody for lipid droplet associated protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>corticosterone ELISA kit</td>
			<td>cayman</td>
			<td>500655</td>
			<td>assay for corticosterone synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted light microscopy</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>JT.baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td>for immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>for immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ADFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>108323</td>
			<td>for immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td>for immunofluorescence staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of rat adrenocortical cells and assays of steroidogenic functions

L’hormone qui sécrète de la corticosurrénale est vital pour les animaux contre le stress et les maladies. La méthode décrite ici est la procédure de cellules surrénaliennes cultivés primaires de rat et des tests fonctionnels (immunofluorescence souillant de protéine de surface de gouttelettes lipidiques, ainsi que l’analyse corticostérone). Contrairement à un modèle in vivo, la variation d’interexperiments dans des cultures monocouches surrénalienne est inférieure et la condition expérimentale est facile à contrôler. En outre, la source des rats est aussi plus stable que les autres animaux, comme les bovins ones. Il y a aussi plusieurs lignes de cellules surrénales humaines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) qui peuvent être utilisées dans les études surrénaliennes. Cependant, la production de stéroïdes de ces lignes sera toujours influencée par de nombreux facteurs, qui comprennent le numéro de lot de sérum, nombre de passage, mutant/perte de gènes distincts, etc.. Sauf faute de 17α-hydroxylase, la culture primaire de cellules corticosurrénaliennes rat est une technique mieux et plus pratique pour l’étude de la physiologie surrénalienne. En résumé, les glandes surrénales cultures primaires de rat pourraient être une bonne plateforme in vitro pour les chercheurs d’étudier les mécanismes du réactif d’intérêt dans le système de la glande surrénale.

En utilisant la procédure décrite ici, les cellules surrénales cultivés primaires se distinguaient sous un microscope à contraste de phase (Figure 1 a). Pour confirmer que les vésicules dans le cytoplasme sont des gouttelettes lipidiques, la coloration à l’immunofluorescence de protéine de liées à la différenciation adipeuse (PACA) pourrait être réalisée sur des cultures de jour-3 (Figure 1 b). Les cellules ont é...

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Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

Culture primaire de cellules Corticosurrénaliennes Rat et tests des fonctions Stéroïdogéniques

L’hormone sécrétée par le cortex surrénalien est vital pour les animaux contre le stress et les maladies. Nous présentons ici un protocole à la culture le rat primaire les cellules surrénales. Ça pourrait être une bonne plateforme in vitro pour étudier les mécanismes du réactif d’intérêt dans la stéroïdogénèse surrénalienne et la biosynthèse des lipides.

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Le protocole présenté est très facile et il aidera les chercheurs à préparer les cultures surrénales primaires. Il fournit une procédure facile pour commencer la steroidogenèse surrénale. Cette technique peut être appliquée sur le dépistage des maladies liées au stress, tous les potentiels des réponses inflammatoires inhibées par l’agent.Wei-Chang Lee, étudiant à la maîtrise de mon laboratoire, démontrera la procédure. Commencez par stériliser le rat SD euthanasié à l’aide de 70 % d’éthanol et laissez-le être absorbé dans la peau. Après avoir essuyé la peau avec le papier de soie, placez le rat sur une plaque de plastique propre en position supine.Ensuite, utilisez des forceps incurvés externes pour soulever la peau à la ligne médiane. Utilisez des ciseaux pour effectuer une dissection émoussée de la peau en créant une forme Y du niveau de la cuisse à l’angle subcostal. Après avoir rincer les ciseaux avec 70% d’éthanol, couper le muscle, également la création d’une forme Y.Localiser la glande surrénale gauche derrière l’estomac dans la droite derrière le foie. Avec une paire de forceps standard et une paire de forceps incurvés, soulevez l’estomac et le foie, puis isolez les surrénales avec un autre forceps incurvé et placez-les dans un plat stérile. Utilisez des forceps fins pour déplacer soigneusement la capsule surrénale de chaque glande.Maintenant, utilisez une délicate paire de ciseaux pour couper les surrénales en petits morceaux en quantité suffisante de sérum sans DMEM F-12 moyen pour couvrir le tissu. Préparer trois pipettes pasteur de taille de coulée différentes en les chauffant au-dessus d’un brûleur. Utilisez la première pipette avec la plus grande ouverture pour transférer tous les morceaux surrénales dans un tube conique de 50mL contenant le milieu avec Collagenase II.Gently Pipette les morceaux de tissu vers le haut et vers le bas environ 10 fois.Puis incuber le tube dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant vingt minutes, et le secouer toutes les cinq minutes, quatre fois au total. Il est très essentiel d’effectuer correctement la dispersion des tissus pendant la digestion des enzymes. Utilisez la deuxième pipette, puis la plus petite pipette de taille pour répéter le pipetage et l’incubation jusqu’à ce que tous les morceaux de tissu deviennent plus petits.Ajoutez ensuite six fois le volume de bresh dans le milieu froid de quatre degrés Celsius pour arrêter la réaction enzymatique. Puis centrafuge à 800 fois G pendant 10 minutes, et jeter le supernatant les deux fois. Ajouter un volume approprié de milieu, et re-suspendre les cellules.Plantez les cellules dans les assiettes désirées ou les plats cultivés à feu moyen pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans 95% d’humidité et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, lavez soigneusement les cellules deux fois à l’moyen DMEM F-12 sans sérum et chaud. Ajouter le milieu de croissance frais et maintenir les cellules à 37 degrés Celsius et 95% d’humidité et 5% de dioxyde de carbone jusqu’au jour 3.Utilisant ce protocole, les cellules surrénales de rat cultivé primaire ont été obtenues. Des cellules surrénales de jour 3 ont été confirmées sous un microscope de contraste de phase. La coloration immunofluorescente de la protéine liée à la différenciation adipeux effectuée le jour 3 cultures a confirmé que les vésicules dans le cytoplasme sont des gouttelettes lipidiques.Après stimulation d’hormone adrenocorticotropic des cellules surrénales de rat, la capacité hormone-productrice des cellules a été déterminée par l’essai de corticosterone, montrant la libération accrue de corticosterone avec la concentration plus élevée d’ACTH. Cette méthode peut être appliquée à d’autres systèmes de culture primaire, tels que les cultures cardiaques primaires, les cultures médullaires surrénales, et cetera. Cette technique peut également aider à étudier l’interaction entre les cellules adrenocorticales et les cellules de chromaffine.

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