Name: primary culture of rat adrenocortical cells and assays of steroidogenic functions
Uploaded: 2019-03-12T12:30:00
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이 작품은 국가 과학 위원회 대만 (NSC102-2320-B-037-008-MY3)와 국립 쳉 쿵 대학 병원 연구 부여 (NCKUH-10102045)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

동물 주제를 포함 하 여 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 가오슝 의학 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 실험 절차
<ol><li>CO2 안락사에 의해 성인 (8 12 주 오래 된) 여성/남성 SD 쥐를 희생.</li>
	<li>70% 에탄올을 적용 하 고, 피부에 흡수 되 고는 티슈로 피부를 닦아 보자.</li>
	<li>부정사 위치에 깨끗 한 플라스틱 접시에 쥐를 넣어.</li>
	<li>"외부" 곡선된 겸 자?...

<ol>
	<li>Frith, C. H., Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histology,+Adrenal+Gland,+Mouse.">Histology, Adrenal Gland, Mouse.</a> Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. , 8-12 (1983).</li><li>Keegan, C. E., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+organogenesis+of+the+adrenal+cortex.">Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex.</a> Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).</li><li>Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).</li><li>Chrousos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic-pituitary-adrenal+axis+and+immune-mediated+inflammation.">The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation.</a> New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).</li><li>Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+and+steroidogenesis.">Cytokines and steroidogenesis.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 135-141 (2004).</li><li>Bielohuby, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+analysis+of+the+mouse+adrenal+gland+from+weaning+to+adulthood:+time-+and+gender-dependent+alterations+of+cell+size+and+number+in+the+cortical+compartment.">Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).</li><li>van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenal+glands+of+mouse+and+rat+do+not+synthesize+androgens.">Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens.</a> Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).</li><li>Wang, T., Rainey, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adrenocortical+carcinoma+cell+lines.">Human adrenocortical carcinoma cell lines.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).</li><li>Payne, A. H., Hales, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+steroidogenic+enzymes+in+the+pathway+from+cholesterol+to+active+steroid+hormones.">Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones.</a> Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).</li><li>Ruggiero, C., Lalli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+ACTH+Signaling+on+Transcriptional+Regulation+of+Steroidogenic+Genes.">Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes.</a> Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).</li><li>Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Toona+sinensis-stimulated+adrenal+steroidogenesis+in+primary+rat+adrenal+cells.">Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells.</a> Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).</li><li>Rybak, S. M., Ramachandran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+normal+rat+adrenocortical+cells.+I.+Culture+conditions+for+optimal+growth+and+function.">Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function.</a> In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).</li><li>Rybak, S. M., Ramachandran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+normal+rat+adrenocortical+cells.+II.+Quantitation+of+steroid+dehydrogenase+stain.">Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain.</a> In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).</li><li>O'Hare, M. J., Neville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+metabolism+by+adult+rat+adrenocortical+cells+in+monolayer+culture.">Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture.</a> Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).</li><li>Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+cell+proliferation+and+steroidogenesis+in+cultured+human+fetal+adrenal+cells+chronically+exposed+to+adrenocorticotropic+hormone:+rationalization+of+in+vitro+and+in+vivo+findings.">Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings.</a> Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).</li><li>Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+adipocyte+biology.+The+perilipin+family+of+structural+lipid+droplet+proteins:+stabilization+of+lipid+droplets+and+control+of+lipolysis.">Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis.</a> Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).</li><li>Hoeflich, A., Bielohuby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+adrenal+gland+growth:+signal+integration+by+extracellular+signal+regulated+kinases1/2.">Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).</li><li>O'Hare, M. J., Neville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+responses+to+corticotrophin+and+cyclic+AMP+by+adult+rat+adrenocortical+cells+in+monolayer+culture.">Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture.</a> Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).</li></ol>

아드레날린은 환경 적응3에서 핵심 역할을 한다. 부 신 피 질에서 분 비는 호르몬 조절 하 고 생리 기능 및 항상성3조정 수 있습니다. Vivo에서 모델 본문에 진짜 생리 적 효과 반영 한다. 그러나, 그것은 여전히 실험에서 불안정 한 효과 일으키는 많은 복잡 한 요인에 의해 좌우 된다. 대조적으로, 생체 외 세포 모델 때문에 동물 모델에 비교할 수 없는 이점이 있다...

내 분 비 시스템은 생리 활동 및 항상성1규제에 대 한 책임. 두개골의 장 대는 신장에 있는 부 신 땀 샘 분 비 mineralocorticoids, 스테로이드 제제, 그리고 안 드로 겐2,3주요 내 분 비 장기 중 하나입니다. 부 신 동맥의 2 개의 명백한 부품이 있다: 피 질 하 고 모 수. 부 신 피 질은 3 개의 층으로 이루어져: 외부 glomerulosa, 중간 fasciculata 및 내부 reticularis3. Zona glomerulosa 호르몬, reabsorbing 나트륨 이온과 신장3물에서 에이즈는 mineralocorticoid의 원래 은닉 사이트입니다. Zona fasciculata 주로 정상적인 생리 적인 조건3스테로이드 제제의 기초 수준을 생성합니다. 설치류에서 코르 티 코 스테로이드 및 인 간에 있는 코 티 솔 통제 혈액 포도 당3스트레스 대처에 시체를 돕기 위해 행동. 어느 정도까지, 그들은 선 동적인 응답을 억제 하 고 면역 시스템4,5조절 수 있습니다. 다른 포유류, 쥐 및 쥐와 달리 필요가 없습니다 기능 zona reticularis 17α-hydroxylase 식의 부족으로 인해 부 신6,7. 따라서, 쥐 및 쥐에서 adrenals 없는 부 신 C-19 스테로이드 (코 티 솔 그리고 부 신 안 드로 겐)의 분 비는.
기본 교양된 adrenocortical 셀 부 신 생리학8제어 메커니즘을 조사 하는 데 유용 해야 표시 되었습니다. Steroidogenic 다른 조직 처럼 각 부 신 존 무료 콜레스테롤9에서 스테로이드 합성. Adrenocorticotropic 호르몬 (ACTH) 자극, 무료 콜레스테롤 고장 지질 작은 물방울에서 출시 고, 따라서, fasciculata 및 reticularis10스테로이드 생산을 향상 시킵니다.
많은 그룹은 adrenocortical carcinomas에서 안정적인 셀 라인을 설정 하려고 했습니다. 그러나, 몇 가지 우려 체 외 모델8에서 adrenocortical 셀 라인의 사용을 제한 했다. 세포의 스테로이드 응답 구절, 혈 청의 많은 수와 혈 청, 등의 품질 간에 달라질 수 있습니다. 또한, 상업 부 신 셀 라인 (y 1과 SW13) corticosterone, 부 신 steroidogenesis8공부 하기 더 어렵게 만드는 분 비 하지 않습니다. 사용 소 및 말 adrenals ex vivo 모델 좋은 선택이 될 수 있습니다 비록 조직이이 시장에서 몇 가지 알 수 없는 위험 모호한 수 있습니다. 그들에 비해, 쥐 아드레날린 관리 쉽게 이며 소스는 상대적으로 더 안정 되 고 병원 체-무료. 함께 찍은, 여기 설명 하는 현재 방법은 corticosterone 합성 쥐 부 신 fasciculata 세포에서의 관련된 메커니즘을 조사 하 사용 될 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>female/ male, SD/Wistar rats (8-12 wk)</td>
			<td>BioLASCO</td>
			<td></td>
			<td>male or femal rats are suitable for experiments. Female&#39;s adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6885</td>
			<td>isolation of adrenal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12800-017</td>
			<td>powder media for adrenal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21700-075</td>
			<td>powder media for adrenal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>JT.baker</td>
			<td>4018</td>
			<td>buffer (powder)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>JT.baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>16050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12103C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved forceps</td>
			<td>BRAUN</td>
			<td>BD343R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>BRAUN</td>
			<td>BD331R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>BRAUN</td>
			<td>BC224R</td>
			<td>cut rat skin and muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>delicate scissor</td>
			<td>BRAUN</td>
			<td>BC101R</td>
			<td>cut adrenal glands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adipose-differentiation related protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108323</td>
			<td>antibody for lipid droplet associated protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>corticosterone ELISA kit</td>
			<td>cayman</td>
			<td>500655</td>
			<td>assay for corticosterone synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted light microscopy</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>JT.baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td>for immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>for immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ADFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>108323</td>
			<td>for immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td>for immunofluorescence staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of rat adrenocortical cells and assays of steroidogenic functions

부 신 피 질에서 분 비 하는 호르몬은 스트레스와 질병에 대 한 동물에 대 한 중요 합니다. 여기에 설명 된 메서드는 기본 교양된 쥐 부 신 세포와 관련 된 기능 분석 실험 (corticosterone 분석 뿐 아니라 지질 작은 물방울 표면 단백질, 면역 형광 얼룩)의. Vivo에서 모델과 달리 단층 부 신 문화에 interexperiments의 변이 덜 이며 실험 조건을 제어 하기 쉽습니다. 게다가, 쥐의 소스 소 것 들과 같은 다른 동물 보다 더 안정적 이기도합니다. 또한 부 신 연구에 사용할 수 있는 여러 인간의 부 신 셀 라인 (NCI H295, NCI-H295R, SW13, 등)이 있다. 그러나,이 선의 스테로이드 생산 여전히 혈 청 로트 번호, 통로 번호, 돌연변이/손실 고유 유전자 등의 수많은 요인에 의해 좌우 됩니다. 17α-hydroxylase 부족, 제외한 쥐 adrenocortical 셀의 기본 문화 부 신 생리학을 공부 하는 더 편리 하 고 더 나은 기술 이다. 요약 하자면, 기본 쥐 부 신 문화 연구자 조사 부 신 시스템에 대 한 관심의 시 약의 메커니즘에 대 한 좋은 생체 외에서 플랫폼 수 있습니다.

여기에 설명 된 절차를 사용 하 여, 기본 교양된 부 신 세포 단계 대조 현미경 (그림 1A) 구별 될 수 있습니다. 더 확인 하려면 소포 세포질 내의 지질 작은 물방울은, 지방 분화 관련 단백질 (ADRP)의 면역 형광 염색 3 일 문화 (그림 1B)에 실시 수 있습니다. 세포는 유리 coverslips에 성장 했다. 셀 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)로 세 번 세?...

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Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

쥐 Adrenocortical 셀 및 Steroidogenic 기능의 분석 실험의 기본 문화

부 신 피 질에서 분 비 하는 호르몬은 스트레스와 질병에 대 한 동물에 대 한 중요 합니다. 여기, 우리는 문화 기본 쥐 프로토콜 부 신 셀을 제시. 그것은 부 신 steroidogenesis와 지질 생 합성의 약의 메커니즘을 조사 하기 위한 좋은 생체 외에서 플랫폼을 수 있습니다.

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

제시된 프로토콜은 아주 쉽고 연구원이 1차 부신 문화를 준비하는 것을 도울 것입니다. 그것은 부 신 스테로이드 발생을 시작 하기 위한 쉬운 절차를 제공 합니다. 이 기술은 스트레스 관련 질병, 에이전트 억제 염증 반응의 모든 잠재력을 선별에 적용될 수 있다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 석사 학생인 웨이창 이병창이 될 것입니다. 먼저 70%에탄올을 사용하여 안락사 된 SD 쥐를 살균하고 피부에 흡수시키는 것으로 시작합니다. 티슈 페이퍼로 피부를 닦은 후, 쥐를 수핀 위치에 깨끗한 플라스틱 접시에 놓습니다.다음으로, 외부 곡선 포셉을 사용하여 중간선에서 피부를 들어 올립니다. 가위를 사용하여 허벅지 수준에서 서브코스트 각도까지 Y 모양을 만들어 피부의 무딘 해부를 수행합니다. 70%에탄올로 가위를 헹구고 근육을 자르고 Y 모양을 만듭니다.간 오른쪽에서 위장 뒤에 왼쪽 부신을 찾습니다. 표준 집게 와 곡선 집게 한 켤레로 위와 간을 들어 올린 다음 부신을 다른 곡선 집게로 분리하고 멸균 접시에 넣습니다. 미세한 집게를 사용하여 각 선에서 부신 캡슐을 조심스럽게 이동시보도록 합니다.이제 섬세한 가위를 사용하여 부신을 충분한 양의 혈청 없는 DMEM F-12 배지로 작은 조각으로 잘라 조직을 덮습니다. 버너 위에 가열하여 세 가지 다른 붓는 크기의 저스티스 파이펫을 준비합니다. 콜라게나세 II.Gently 피펫과 함께 배지를 함유한 50mL 원전 튜브로 모든 부신 조각을 10회 위아래로 옮기는 가장 큰 개구부가 있는 첫 번째 파이펫을 사용하십시오.그런 다음 20 분 동안 섭씨 37도에서 수조에서 튜브를 배양하고 5 분마다 총 4 번 흔들어줍니다. 효소 소화 중 조직 분산을 제대로 수행하는 것이 매우 중요합니다. 두 번째 및 가장 작은 붓는 크기의 파이펫을 사용하여 모든 조직 조각이 작아질 때까지 파이펫팅과 인큐베이션을 반복합니다.그런 다음 4섭씨 차가운 매체에 6배의 브레시를 추가하여 효소 반응을 멈춥시다. 그런 다음 10 분 동안 800 회 G에서 센트라푸징을 하고 두 번 상퍼를 폐기하십시오. 적절한 양의 매체를 추가하고 셀을 다시 일시 중단합니다.원하는 접시 또는 요리에 세포를 심고 중간 하룻밤 에서 성장 중간 37 섭씨 에서 섭다 95%와 5% 이산화탄소. 다음 날, 세럼이 없고 따뜻한 DMEM F-12 배지로 셀을 두 번 조심스럽게 씻으시다. 신선한 성장 매체를 추가하고 3 일까지 섭씨 37도, 습도 95 %, 이산화탄소 5 %로 세포를 유지합니다.이 프로토콜을 사용하여, 1차 배양 쥐 부신 세포가 얻어졌다. 3일부신세포는 상대비 현미경으로 확인되었다. 3일째에 수행된 지방 분화 관련 단백질의 면역형염색은 세포질 내의 소포가 지질 방울임을 확인했습니다.쥐 부신 세포의 아드레날린 호르몬 자극 후, 세포의 호르몬 생산 능력은 코르티코스테론 분석에 의해 결정되었다, 더 높은 ACTH 농도와 증가 코르티코스테론 방출을 보여주는. 이 방법은 1 차적인 심장 배양, 부신 수질 배양, 등 세테라와 같은 그밖 1 차적인 배양 시스템에 적용될 수 있습니다. 이 기술은 또한 부뇌관세포와 크로마핀 세포 사이의 상호 작용을 조사하는 데 도움이 될 수 있다.

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