Name: primary culture of rat adrenocortical cells and assays of steroidogenic functions
Uploaded: 2019-03-12T12:30:00
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Este trabalho foi financiado por um subsídio da Taiwan Nacional de Conselho de ciência (NSC102-2320-B-037-008-MY3) e um Nacional Cheng Kung University Hospital Research Grant (NCKUH-10102045).

Todos os procedimentos, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê de Kaohsiung médica da Universidade.
1. procedimento experimental
<ol><li>Sacrifica os ratos de SD fêmea/macho adulto (8 a 12 semanas de idade) por eutanásia de CO2 .</li>
	<li>Aplicar o etanol a 70% e deixá-lo ser absorvido pela pele e em seguida, limpe a pele com um papel absorvente.</li>
	<li>Coloque o rato em um prato plástico limpo na posição supina.</l...

<ol>
	<li>Frith, C. H., Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histology,+Adrenal+Gland,+Mouse.">Histology, Adrenal Gland, Mouse.</a> Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. , 8-12 (1983).</li><li>Keegan, C. E., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+organogenesis+of+the+adrenal+cortex.">Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex.</a> Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).</li><li>Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).</li><li>Chrousos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic-pituitary-adrenal+axis+and+immune-mediated+inflammation.">The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation.</a> New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).</li><li>Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+and+steroidogenesis.">Cytokines and steroidogenesis.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 135-141 (2004).</li><li>Bielohuby, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+analysis+of+the+mouse+adrenal+gland+from+weaning+to+adulthood:+time-+and+gender-dependent+alterations+of+cell+size+and+number+in+the+cortical+compartment.">Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).</li><li>van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenal+glands+of+mouse+and+rat+do+not+synthesize+androgens.">Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens.</a> Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).</li><li>Wang, T., Rainey, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adrenocortical+carcinoma+cell+lines.">Human adrenocortical carcinoma cell lines.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).</li><li>Payne, A. H., Hales, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+steroidogenic+enzymes+in+the+pathway+from+cholesterol+to+active+steroid+hormones.">Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones.</a> Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).</li><li>Ruggiero, C., Lalli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+ACTH+Signaling+on+Transcriptional+Regulation+of+Steroidogenic+Genes.">Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes.</a> Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).</li><li>Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Toona+sinensis-stimulated+adrenal+steroidogenesis+in+primary+rat+adrenal+cells.">Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells.</a> Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).</li><li>Rybak, S. M., Ramachandran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+normal+rat+adrenocortical+cells.+I.+Culture+conditions+for+optimal+growth+and+function.">Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function.</a> In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).</li><li>Rybak, S. M., Ramachandran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+normal+rat+adrenocortical+cells.+II.+Quantitation+of+steroid+dehydrogenase+stain.">Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain.</a> In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).</li><li>O'Hare, M. J., Neville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+metabolism+by+adult+rat+adrenocortical+cells+in+monolayer+culture.">Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture.</a> Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).</li><li>Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+cell+proliferation+and+steroidogenesis+in+cultured+human+fetal+adrenal+cells+chronically+exposed+to+adrenocorticotropic+hormone:+rationalization+of+in+vitro+and+in+vivo+findings.">Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings.</a> Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).</li><li>Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+adipocyte+biology.+The+perilipin+family+of+structural+lipid+droplet+proteins:+stabilization+of+lipid+droplets+and+control+of+lipolysis.">Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis.</a> Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).</li><li>Hoeflich, A., Bielohuby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+adrenal+gland+growth:+signal+integration+by+extracellular+signal+regulated+kinases1/2.">Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).</li><li>O'Hare, M. J., Neville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+responses+to+corticotrophin+and+cyclic+AMP+by+adult+rat+adrenocortical+cells+in+monolayer+culture.">Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture.</a> Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).</li></ol>

Glândulas supra-renais desempenham um papel chave na adaptação ambiental3. O hormônio pelo qual o córtex adrenal secreta pode regular e ajustar as funções fisiológicas e homeostase3. O modelo in vivo reflete os efeitos fisiológicos real no corpo. No entanto, ainda é influenciado por muitos fatores complexos, causando efeitos instáveis em experimentos. Em contraste, o modelo de células in vitro tem vantagens que o torna incomparável para o modelo animal. Primeir...

O sistema endócrino é responsável pela regulação de atividades fisiológicas e homeostase1. Glândulas supra-renais localizadas no polo cranial dos rins são os principais órgãos do sistema endócrino que segregam mineralocorticoides, glicocorticoides e androgênios2,3. Há duas partes distintas da glândula supra-renal: o córtex e a medula. O córtex adrenal consiste em três camadas: o exterior glomerulosa, fasciculada a intermediário e o reticular interno3. A zona glomerulosa é o site original secretando de aldosterona, um mineralocorticoide, que auxilia na reabsorvendo o íon de sódio e água nos rins3. A zona fasciculada principalmente produz um nível basal de glicocorticoides em condições fisiológicas normais3. Corticosteroides em roedores e cortisol em humanos agir para ajudar o corpo em lidar com o estresse, regulando a glicose de sangue3. Em certa medida, eles podem inibir respostas inflamatórias e regular o sistema imunológico4,5. Em contraste com outros mamíferos, camundongos e ratos não têm um funcional zona reticular devido à falta de uma expressão de 17α-hidroxilase na glândula adrenal6,7. Assim, as glândulas supra-renais de camundongos e ratos são desprovido de secreção de esteroides adrenais de C-19 (cortisol e andrógenos adrenais).
Culturas de células adrenocortical primárias foram mostradas para ser útil para investigar mecanismos controlando a fisiologia renal8. Como outros tecidos esteroidogênica, cada zona adrenal sintetiza seus esteroides de colesterol livre9. Após estimulação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), o colesterol livre é liberado de gotículas lipídicas de repartição e, assim, aumenta a produção de esteroides na10fasciculada e reticular.
Muitos grupos têm tentado estabelecer linhas de célula estável de carcinomas de adrenocortical. No entanto, várias preocupações têm limitado a utilização de linhas de célula adrenocortical, como na vitro modelos8. As respostas de esteroides de linhas celulares podem diferir entre passagens, número de lote do soro e a qualidade do soro, etc. Além disso, linhas de células adrenais comercial (Y1 e SW13) não secretam corticosterona, tornando mais difícil para estudar a esteroidogênese adrenal8. Bovinas e equinos supra-renais usando como ex vivo modelos podem ser uma boa escolha, mesmo que os tecidos de nesses mercados podem obscurecer alguns riscos desconhecidos. Comparado a eles, gerenciar as glândulas supra-renais do rato é mais fácil e a fonte é relativamente mais estável e isentos de agentes patogénicos. Tomados em conjunto, o presente método descrito aqui pode ser usado para investigar o mecanismo relacionado da síntese de corticosterona em células adrenais fasciculata de rato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>female/ male, SD/Wistar rats (8-12 wk)</td>
			<td>BioLASCO</td>
			<td></td>
			<td>male or femal rats are suitable for experiments. Female&#39;s adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6885</td>
			<td>isolation of adrenal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12800-017</td>
			<td>powder media for adrenal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21700-075</td>
			<td>powder media for adrenal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>JT.baker</td>
			<td>4018</td>
			<td>buffer (powder)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>JT.baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>16050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12103C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved forceps</td>
			<td>BRAUN</td>
			<td>BD343R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>BRAUN</td>
			<td>BD331R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>BRAUN</td>
			<td>BC224R</td>
			<td>cut rat skin and muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>delicate scissor</td>
			<td>BRAUN</td>
			<td>BC101R</td>
			<td>cut adrenal glands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adipose-differentiation related protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108323</td>
			<td>antibody for lipid droplet associated protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>corticosterone ELISA kit</td>
			<td>cayman</td>
			<td>500655</td>
			<td>assay for corticosterone synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted light microscopy</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>JT.baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td>for immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>for immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ADFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>108323</td>
			<td>for immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td>for immunofluorescence staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of rat adrenocortical cells and assays of steroidogenic functions

O hormônio que segrega o córtex adrenal é vital para os animais contra estresse e doenças. O método descrito aqui é o procedimento de células adrenais primários rato culta e relacionados ensaios funcionais (mancha da imunofluorescência de proteína gotículas lipídicas, bem como análise de corticosterona). Ao contrário de um modelo in vivo, a variação de interexperiments em culturas de monocamada adrenal é menor e a condição experimental é fácil de controlar. Além disso, a fonte de ratos também é mais estável do que outros animais, como bovinos ones. Existem também várias linhas de célula humana adrenal (NCI-H295 NCI-H295R, SW13, etc) que podem ser usadas em estudos de adrenais. No entanto, a produção de esteroides dessas linhas será ainda influenciada por inúmeros fatores, que incluem o número de lote de soro, número de passagem, mutante/perda de genes distintos, etc. Exceto por falta de 17α-hidroxilase, a cultura primária de células de rato adrenocortical é uma técnica melhor e mais conveniente para estudar fisiologia renal. Em resumo, culturas adrenal primária rato poderiam ser uma boa plataforma in vitro por pesquisadores investigar os mecanismos do reagente de interesse no sistema de glândula adrenal.

Usando o procedimento descrito aqui, o principais culturas células adrenais poderiam ser distinguidas sob um microscópio de contraste de fase (figura 1A). Para confirmar que as vesículas no citoplasma são gotículas lipídicas, a mancha da imunofluorescência de proteínas relacionadas com diferenciação adiposa (ADRP) pode efectuar-se dia-3 culturas (figura 1B). As células foram cultivadas sobre as lamelas de vidro. As cé...

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Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

Cultura primária de células Adrenocortical rato e ensaios das funções reguladora

O hormônio secretado pelo córtex adrenal é vital para os animais contra doenças e estresse. Aqui, apresentamos um protocolo para cultura o rato primário células adrenais. Pode ser uma boa plataforma in-vitro para investigar os mecanismos do reagente de interesse na esteroidogênese adrenal e biossíntese de lipídios.

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

O protocolo apresentado é muito fácil e ajudará os pesquisadores a preparar culturas suprarrenais primárias. Ele fornece um procedimento fácil para iniciar a esterilnese adrenal. Esta técnica pode ser aplicada na triagem das doenças relacionadas ao estresse, todos os potenciais das respostas inflamatórias inibidas pelo agente.Demonstrando o procedimento estará Wei-Chang Lee, um estudante de mestrado do meu laboratório. Comece esterilizando o rato SD de tamanho eutanizado usando 70% de etanol e deixando-o ser absorvido na pele. Depois de limpar a pele com o papel de tecido, coloque o rato sobre uma placa de plástico limpa na posição supina.Em seguida, use fórceps curvos externos para levantar a pele na linha média. Use a tesoura para realizar uma dissecção contundente da pele, criando uma forma Y do nível da coxa até o ângulo subcostal. Depois de enxaguar a tesoura com 70% de etanol, corte o músculo, criando também uma forma Y.Localize a glândula suprarrenal esquerda atrás do estômago na direita atrás do fígado. Com um par de fórceps padrão e um par de fórceps curvos, levante o estômago e o fígado e, em seguida, isole as suprarrenais com outra fórceps curvas e coloque-as em um prato estéril. Use fórceps finos para mover cuidadosamente a cápsula adrenal de cada glândula.Agora, use um delicado par de tesouras para cortar as suprarrenais em pequenos pedaços em quantidade suficiente de meio DMEM F-12 sem soro para cobrir o tecido. Prepare três pipetas pasteur de tamanho de derramamento diferentes aquecendo-as sobre um queimador. Use a primeira pipeta com a maior abertura para transferir todas as peças suprarrenais em um tubo cônico de 50mL contendo meio com Collagenase II.Pipeta suavemente os pedaços de tecido para cima e para baixo cerca de 10 vezes.Em seguida, incubar o tubo em um banho de água a 37 graus Celsius por vinte minutos, e sacudi-lo a cada cinco minutos, quatro vezes no total. É muito crítico realizar adequadamente a dispersão tecidual durante a digestão da enzima. Use a segunda e, em seguida, a menor pipeta do tamanho de derramamento para repetir a pipetação e a incubação até que todos os pedaços de tecido se tornem menores.Em seguida, adicione o volume de seis vezes de bresh em quatro graus Celsius meio frio para parar a reação enzimática. Em seguida, centrafuge a 800 vezes G por 10 minutos, e descarte o supernatante em ambas as vezes. Adicione um volume adequado de meio e suspenda as células.Plante as células em pratos ou pratos desejados com meio cultivado durante a noite a 37 graus Celsius em 95% de umidade e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, lave cuidadosamente as células duas vezes com meio DMEM F-12 quente e sem soro. Adicione meio de crescimento fresco e mantenha as células a 37 graus Celsius e 95% de umidade e 5% de dióxido de carbono até o dia 3.Usando este protocolo, foram obtidas células suprarrenais de ratos cultivadas primárias. As células suprarrenais do dia 3 foram confirmadas sob um microscópio de contraste de fase. A coloração imunofluorescente da proteína relacionada à diferenciação adiposa realizada no dia 3 culturas confirmaram que vesículas dentro do citoplasma são gotículas lipídicas.Após a estimulação hormonal adrenocorticrópica de células suprarrenais de ratos, a capacidade de produção hormonal das células foi determinada pelo ensaio de corticosterona, mostrando aumento da liberação de corticosterona com maior concentração de ACTH. Este método pode ser aplicado a outros sistemas de cultura primária, como culturas cardíacas primárias, culturas de medula adrenal, etc. Esta técnica também pode ajudar a investigar a interação entre células adrenocorticas e células cromafinas.

Research

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Biology

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Viability Assays for Cells in Culture

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