Name: primary culture of rat adrenocortical cells and assays of steroidogenic functions
Uploaded: 2019-03-12T12:30:00
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Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Taiwán de Consejo Nacional de ciencia (NSC102-2320-B-037-008-MY3) y una nacional Cheng Kung University Hospital beca de investigación (NCKUH-10102045).

Todos los procedimientos incluyendo temas animal han sido aprobados por institucional Animal cuidado y uso Comité de Kaohsiung Medical University.
1. experimental procedimiento
<ol><li>Sacrificio de las ratas de SD hembra/macho adulto (8 a 12 semanas de edad) por eutanasia de CO2 .</li>
	<li>Aplicar etanol al 70% y dejar ser absorbidos por la piel y luego limpie la piel con un papel de tejido.</li>
	<li>Colocar la rata en una placa de plástico en la posición supina.</li>
	<li>L...

<ol>
	<li>Frith, C. H., Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histology,+Adrenal+Gland,+Mouse.">Histology, Adrenal Gland, Mouse.</a> Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. , 8-12 (1983).</li><li>Keegan, C. E., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+organogenesis+of+the+adrenal+cortex.">Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex.</a> Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).</li><li>Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).</li><li>Chrousos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic-pituitary-adrenal+axis+and+immune-mediated+inflammation.">The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation.</a> New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).</li><li>Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+and+steroidogenesis.">Cytokines and steroidogenesis.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 135-141 (2004).</li><li>Bielohuby, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+analysis+of+the+mouse+adrenal+gland+from+weaning+to+adulthood:+time-+and+gender-dependent+alterations+of+cell+size+and+number+in+the+cortical+compartment.">Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).</li><li>van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenal+glands+of+mouse+and+rat+do+not+synthesize+androgens.">Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens.</a> Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).</li><li>Wang, T., Rainey, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adrenocortical+carcinoma+cell+lines.">Human adrenocortical carcinoma cell lines.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).</li><li>Payne, A. H., Hales, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+steroidogenic+enzymes+in+the+pathway+from+cholesterol+to+active+steroid+hormones.">Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones.</a> Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).</li><li>Ruggiero, C., Lalli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+ACTH+Signaling+on+Transcriptional+Regulation+of+Steroidogenic+Genes.">Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes.</a> Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).</li><li>Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Toona+sinensis-stimulated+adrenal+steroidogenesis+in+primary+rat+adrenal+cells.">Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells.</a> Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).</li><li>Rybak, S. M., Ramachandran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+normal+rat+adrenocortical+cells.+I.+Culture+conditions+for+optimal+growth+and+function.">Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function.</a> In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).</li><li>Rybak, S. M., Ramachandran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+normal+rat+adrenocortical+cells.+II.+Quantitation+of+steroid+dehydrogenase+stain.">Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain.</a> In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).</li><li>O'Hare, M. J., Neville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+metabolism+by+adult+rat+adrenocortical+cells+in+monolayer+culture.">Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture.</a> Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).</li><li>Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+cell+proliferation+and+steroidogenesis+in+cultured+human+fetal+adrenal+cells+chronically+exposed+to+adrenocorticotropic+hormone:+rationalization+of+in+vitro+and+in+vivo+findings.">Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings.</a> Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).</li><li>Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+adipocyte+biology.+The+perilipin+family+of+structural+lipid+droplet+proteins:+stabilization+of+lipid+droplets+and+control+of+lipolysis.">Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis.</a> Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).</li><li>Hoeflich, A., Bielohuby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+adrenal+gland+growth:+signal+integration+by+extracellular+signal+regulated+kinases1/2.">Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).</li><li>O'Hare, M. J., Neville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+responses+to+corticotrophin+and+cyclic+AMP+by+adult+rat+adrenocortical+cells+in+monolayer+culture.">Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture.</a> Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).</li></ol>

Las glándulas suprarrenales desempeñan un papel clave en la adaptación al medio3. La hormona que segrega la corteza suprarrenal puede regular y ajustar las funciones fisiológicas y homeostasis3. El modelo in vivo refleja los efectos fisiológicos reales en el cuerpo. Sin embargo, todavía está influenciada por muchos factores complejos, causando efectos inestables en experimentos. En contraste, el modelo de célula en vitro tiene ventajas que lo hace incomparable para ...

El sistema endocrino es responsable de la regulación de actividades fisiológicas y homeostasis1. Glándulas suprarrenales, situadas en el polo craneal de los riñones son uno de los principales órganos endocrinos que secretan mineralocorticoides, glucocorticoides y andrógenos2,3. Hay dos partes distintas de la glándula suprarrenal: la corteza y la médula. La corteza suprarrenal se compone de tres capas: la glomerulosa externa, fasciculada intermedia y los reticularis interno3. La zona glomerular es el sitio original de la secreción de la aldosterona, un mineralocorticoide, que ayuda en la reabsorción de iones de sodio y agua en los riñones3. La zona fasciculada produce principalmente un nivel basal de glucocorticoides en condiciones fisiológicas normales3. Corticosteroides en roedores y cortisol en los seres humanos actúan para ayudar al cuerpo para lidiar con el estrés mediante la regulación de la glucosa de sangre3. Hasta cierto punto, pueden inhibir las respuestas inflamatorias y regulan el sistema inmune4,5. A diferencia de otros mamíferos, ratones y ratas no tienen un reticularis de zona funcional debido a la falta de una expresión de 17α-hidroxilasa en la glándula suprarrenal6,7. Así, las glándulas suprarrenales de las ratas y ratones están desprovistas de la secreción de esteroides de C-19 suprarrenales (cortisol y andrógenos suprarrenales).
Primario las células adrenocorticales cultivadas han demostrado ser útiles para investigar los mecanismos que controlan la fisiología suprarrenal8. Como otros tejidos steroidogenic, cada zona suprarrenal sintetiza sus esteroides colesterol libre9. Sobre el estímulo de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH), el colesterol libre se libera de gotitas de lípidos de ruptura y, por lo tanto, mejora la producción de esteroides en el fasciculata y reticularis10.
Muchos grupos han tratado de establecer líneas celulares estables de carcinomas adrenocorticales. Sin embargo, varios problemas han limitado el uso de líneas de células adrenocorticales como en vitro modelos8. Las respuestas de esteroides de las líneas celulares pueden diferir entre pasajes, el número de lote de suero y la calidad del suero, etcetera. Por otra parte, líneas de células suprarrenales comercial (Y1 y SW13) no secretan de corticosterona, lo que es más difícil estudiar la esteroidogénesis suprarrenal8. Uso de bovinas y Equinas, las glándulas suprarrenales como ex vivo modelos pueden ser una buena opción, aunque los tejidos de estos mercados pueden ocultar algunos riesgos desconocidos. En comparación con ellos, dirigiendo las glándulas suprarrenales de rata es más fácil y la fuente es relativamente más estable y libre de patógenos. Tomados en conjunto, el presente método descrito aquí podría utilizarse para investigar el mecanismo relacionado de la síntesis de corticosterona en las células de fasciculada suprarrenal de rata.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>female/ male, SD/Wistar rats (8-12 wk)</td>
			<td>BioLASCO</td>
			<td></td>
			<td>male or femal rats are suitable for experiments. Female&#39;s adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6885</td>
			<td>isolation of adrenal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12800-017</td>
			<td>powder media for adrenal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21700-075</td>
			<td>powder media for adrenal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>JT.baker</td>
			<td>4018</td>
			<td>buffer (powder)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>JT.baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>16050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>12103C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved forceps</td>
			<td>BRAUN</td>
			<td>BD343R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>BRAUN</td>
			<td>BD331R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>BRAUN</td>
			<td>BC224R</td>
			<td>cut rat skin and muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>delicate scissor</td>
			<td>BRAUN</td>
			<td>BC101R</td>
			<td>cut adrenal glands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adipose-differentiation related protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108323</td>
			<td>antibody for lipid droplet associated protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>corticosterone ELISA kit</td>
			<td>cayman</td>
			<td>500655</td>
			<td>assay for corticosterone synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted light microscopy</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>JT.baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td>for immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>for immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ADFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>108323</td>
			<td>for immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td>for immunofluorescence staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of rat adrenocortical cells and assays of steroidogenic functions

La hormona que segrega la corteza suprarrenal es vital para los animales contra el estrés y enfermedades. El método descrito aquí es el procedimiento de células suprarrenales primarios de rata cultivadas y ensayos funcionales relacionados (tinción de inmunofluorescencia de proteína superficial de la gota de lípidos, así como análisis de corticosterona). A diferencia de un modelo in vivo, la variación del interexperiments en cultivos monocapa suprarrenal es inferior y la condición experimental es fácil de controlar. Además, la fuente de las ratas también es más estable que otros animales, como bovinos. También hay varias líneas de células suprarrenales humanas (NCI-aviones usados H295 NCI-H295R, SW13, etc.) que pueden utilizarse en estudios suprarrenales. Sin embargo, la producción de esteroides de estas líneas todavía se verá afectada por numerosos factores, que incluyen el número de lote de suero, pasaje número, mutante, pérdida de genes distintos, etcetera. Excepción de falta de 17α-hidroxilasa, el cultivo primario de células adrenocorticales de rata es una técnica mejor y más conveniente para el estudio de fisiología suprarrenal. En Resumen, culturas suprarrenal de la rata principal podrían ser una buena plataforma in vitro por investigadores investigar los mecanismos del reactivo de interés en el sistema de la glándula suprarrenal.

Utilizando el procedimiento descrito aquí, las células suprarrenales cultivadas primarias podían distinguirse bajo el microscopio de contraste de fase (figura 1A). Para confirmar aún más que las vesículas dentro del citoplasma son gotitas del lípido, la tinción de inmunofluorescencia de proteína relacionada con la diferenciación adiposa (ADRP) podría llevarse a cabo en día 3 culturas (figura 1B). Las células fueron c...

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Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

Cultivo primario de células adrenocorticales rata y análisis de funciones Steroidogenic

La hormona secretada por la corteza suprarrenal es vital para los animales contra el estrés y enfermedades. Aquí, presentamos un protocolo a la cultura la principal rata células suprarrenales. Podría ser una buena plataforma in vitro para investigar los mecanismos del reactivo de intereses de la esteroidogénesis suprarrenal y biosíntesis de lípidos.

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

El protocolo presentado es muy fácil y ayudará a los investigadores a preparar cultivos suprarrenales primarios. Proporciona un procedimiento fácil para iniciar la esteterogénesis suprarrenal. Esta técnica se puede aplicar en el cribado de las enfermedades relacionadas con el estrés, todas las potencialidades de las respuestas inflamatorias inhibidas por el agente.Demostrando el procedimiento estará Wei-Chang Lee, un estudiante de maestría de mi laboratorio. Comience por esterilizar rata SD eutanizada usando 70%etanol y dejando que se absorba en la piel. Después de limpiar la piel con el papel tisú, coloque la rata en una placa de plástico limpia en la posición supina.A continuación, utilice fórceps curvos externos para levantar la piel en la línea media. Utilice tijeras para realizar una disección contundente de la piel mediante la creación de una forma Y desde el nivel del muslo hasta el ángulo subcostal. Después de enjuagar las tijeras con 70%etanol, cortar el músculo, también creando una forma Y.Localice la glándula suprarrenal izquierda detrás del estómago en la derecha detrás del hígado. Con un par de fórceps estándar y un par de fórceps curvos, levante el estómago y el hígado y luego aísle las suprarrenales con otros fórceps curvos y colóquelos en un plato estéril. Utilice fórceps finos para mover cuidadosamente la cápsula suprarrenal de cada glándula.Ahora, usa un delicado par de tijeras para cortar las glándulas suprarrenales en trozos pequeños en suficiente cantidad de medio DMEM F-12 libre de suero para cubrir el tejido. Prepare tres pipetas pasteur de diferentes tamaños de vertido calentándolas sobre un quemador. Utilice la primera pipeta con la abertura más grande para transferir todas las piezas suprarrenales a un tubo cónico de 50 ml que contenga un medio con Colagenasa II.Pipetear suavemente las piezas de tejido hacia arriba y hacia abajo unas 10 veces.Luego incuba el tubo en un baño de agua a 37 grados celsius durante veinte minutos, y agitarlo cada cinco minutos, cuatro veces en total. Es muy crítico realizar correctamente la dispersión del tejido durante la digestión enzimática. Utilice la segunda y luego la pipeta de tamaño vertido más pequeña para repetir la pipeteo y la incubación hasta que todas las piezas de tejido se vuelvan más pequeñas.A continuación, agregue seis veces el volumen de bresh en cuatro grados Celsius medio frío para detener la reacción enzimática. A continuación, centrafuge a 800 veces G durante 10 minutos, y desechar el sobrenadante ambas veces. Agregue un volumen adecuado de medio y vuelva a suspender las celdas.Plantar las células en platos o platos deseados con medio cultivado durante la noche a 37 grados celsius en 95% de humedad y 5% dióxido de carbono. Al día siguiente, lave cuidadosamente las células dos veces con un medio DMEM F-12 cálido y sin suero. Añadir medio de crecimiento fresco y mantener las células a 37 grados celsius y 95% de humedad y 5% dióxido de carbono hasta el día 3.Usando este protocolo, se obtuvieron células suprarrenales de ratas cultivadas primarias. Las células suprarrenales del día 3 se confirmaron bajo un microscopio de contraste de fase. La tinción inmunofluorescente de la proteína relacionada con la diferenciación adiposa realizada en el día 3 los cultivos confirmaron que las vesículas dentro del citoplasma son gotas de lípidos.Después de la estimulación de la hormona adrenocorticotrópica de las células suprarrenales de rata, la capacidad de producción hormonal de las células se determinó mediante un ensayo de corticosterona, mostrando una mayor liberación de corticosterona con mayor concentración de ACTH. Este método se puede aplicar a otros sistemas de cultivo primario, como cultivos cardíacos primarios, cultivos de médula suprarrenal, etc. Esta técnica también puede ayudar a investigar la interacción entre las células adrenocorticales y las células de la cromafina.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

Biología

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