Name: longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography
Uploaded: 2019-02-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch NSF gewährt IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), NIH Zuschüsse, R21EY026380, R15EB019704 und R01EB025209 und Lehigh University Gründerfonds.

1. Vorbereitung der Zellen
<ol><li>Ein qualifizierter Lieferant Zelllinien einzuholen. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Zellen von der Zell-Linien von Interesse Sphäroid in den Kultur-Medien oder mit Hilfe eines Substrates (Basalmembran Matrix wie Matrigel) bilden können. Schauen Sie in der Literatur-9 oder durchführen Sie einer Runde eines Pre-Experiment für einen Check.</li>
	<li>Tauen Sie die gefrorenen Zellen nach dem spezifischen Verfahren von der Zelllinie Anbieter zur Verfügung g...

Tumor-Aktivität ist für seine morphologische Struktur äußerst relevant. Ähnlich wie bei der Überwachung der charakteristischen Wachstumskurve für 2D Zellkulturen, ist tracking die Wachstumskurve für 3D Tumor Sphäroide auch einen konventionellen Ansatz für das langfristige Sphäroid Wachstum Verhalten für verschiedene Zelllinien zu charakterisieren. Insbesondere können wir die Droge Antwort charakterisieren, durch die Analyse von Tumor-Abbau oder Tumor Regrowth spiegelt sich direkt in der Wachstumskurve. Quant...

Krebs ist die zweithäufigste Ursache des Todes in der Welt1. Medikamente gegen Krebs zu entwickeln, ist von entscheidender Bedeutung für die Patienten. Jedoch wird es geschätzt, dass mehr als 90 % der neue Anti-Krebs-Medikamente in der Entwicklungsphase wegen mangelnder Wirksamkeit und unerwartete Toxizität in klinischen Studien2scheitern. Der Teil des Grundes lässt sich zurückführen auf die Verwendung von einfachen zweidimensionalen (2D) Kultur Zellmodelle für zusammengesetzte Screening, die Ergebnisse mit begrenzten Vorhersagewerte der zusammengesetzten Wirksamkeit und Toxizität für die folgenden Phasen des Drug Discovery2 , 3 , 4. vor kurzem, dreidimensionale (3D) Tumor Sphäroid Modelle wurden entwickelt, um klinisch relevante physiologische und pharmakologische Daten vorsehen, Anti-Krebs-Medikament Entdeckung3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Da diese Sphäroide Gewebe-spezifische Eigenschaften von Tumoren in Vivonachahmen können, können wie Nährstoffe und Sauerstoff gradient, hypoxische Kern sowie Medikament Widerstand19, die Verwendung dieser Modelle potenziell Drug Discovery Fristen zu verkürzen, reduzieren Sie Investitionskosten zu, und bringen Sie neue Medikamente für Patienten noch effektiver. Ein kritischer Ansatz zur Bewertung zusammengesetzte Wirksamkeit in 3D Tumorentwicklung Sphäroid ist zur Überwachung der Sphäroid Wachstum und Wiederauftreten nach Behandlungen9,26. Um dies zu tun, sind quantitative Charakterisierung der Tumor Morphologie, mit seinen Durchmesser und Volumen, mit hochauflösender bildgebender Verfahren zwingend notwendig.
Konventionelle bildgebende Verfahren, z. B. Hellfeld Phase Kontrast7,9,22,24und Fluoreszenz-Mikroskopie8,9,16, 18,22 kann eine Messung des Durchmessers der Sphäroid bieten aber nicht die allgemeine Struktur der Sphäroid im 3D-Raum lösen. Viele Faktoren tragen zu dieser Beschränkungen, einschließlich Eindringen von bohrenden Licht in den Sphäroid; Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen in den Sphäroid; emittierenden Leuchtstoff Signale von aufgeregt fluoreszierende Farbstoffe im Inneren oder auf der gegenüberliegenden Fläche des Sphäroids aufgrund der starken Absorption und Streuung; und Tiefe-Abwicklungsfähigkeit dieser bildgebende Modalitäten. Dies führt häufig zu einer ungenauen Volumenmessung. Entwicklung des nekrotischen Kerns in Sphäroide imitiert Nekrose in in Vivo Tumoren6,10,15,19,25. Diese pathologische Funktion dürfte in 2D Zelle Kulturen19,25,27,28reproduziert. Sphäroid größer als 500 µm im Durchmesser, eine Dreischicht-konzentrische Struktur, einschließlich eine äußere Schicht der proliferierenden Zellen, eine mittlere Schicht von ruhenden Zellen und einem nekrotischen Kern in der Sphäroid6,10 zu beobachten ,15,19,25, aufgrund des Mangels an Sauerstoff und Nährstoffe. Lebende und tote Zelle Fluoreszenz-Bildgebung ist die Standardtherapie, die Grenze des nekrotischen Kern zu kennzeichnen. Allerdings behindern Durchdringungen dieser fluoreszierende Farbstoffe und sichtbares Licht wieder, das Potenzial, die Sonde in den nekrotischen Kern, seine Entwicklung in seiner eigentlichen Form zu überwachen.
Eine alternative 3D bildgebende Modalität, ist Optische Kohärenztomografie (OCT) eingeführt, um den Tumor Sphäroide charakterisieren. OCT ist eine biomedizinische bildgebendes Verfahren, die für den Erwerb markierungsfreie, zerstörungsfreie 3D-Daten von bis zu 1-2 mm Tiefe in biologischen Geweben29,30,31,32,33 ,34. OCT beschäftigt Low-Kohärenz Interferometrie zurückgestreute Signale aus verschiedenen Tiefen der Probe zu erkennen und rekonstruierten Tiefe gelöst Bilder bei Mikron-Ebene räumliche Auflösungen im lateralen und vertikalen Richtungen bietet. OCT ist weit verbreitet in der Augenheilkunde35,36,37 und Angiographie38,39angenommen worden. Frühere Studien haben OCT zu beobachten die Morphologie von in-vitro- Tumor Sphäroide Basalmembran Matrix (z.B.Matrigel) und evaluieren ihre Reaktionen auf die photodynamische Therapie40,41verwendet. Vor kurzem hat unsere Gruppe eine Hochdurchsatz-OCT Image Plattform, um systematisch zu überwachen und zu quantifizieren, die Wachstum Kinetik der 3D Tumor Sphäroide im Multi-well-Platten42. Präzise volumetrische Quantifizierung der 3D Tumor Sphäroide mit einem Voxel zählen Ansatz und markierungsfreie nekrotischen Gewebes Erkennung in der Sphäroide basierend auf intrinsische optische Dämpfung Kontrast wurden demonstriert. Dieses Papier beschreibt die Details wie die OCT-Bildgebung-Plattform wurde konstruiert und eingesetzt, um hochauflösende 3D-Bilder von Tumor Sphäroide zu erhalten. Schritt für Schritt Quantitative Analysen der Kinetik von 3D Tumor Sphäroide, genaue Messungen der Sphäroid Durchmesser und Volumen, einschließlich Wachstum wird beschrieben. Darüber hinaus wird die Methode der zerstörungsfreien Detektion des nekrotischen Gewebes Regionen mit OCT, basierend auf der inneren optische Dämpfung Kontrast präsentiert.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Custom Spectral Domain OCT imaging system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Developed in our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superluminescent Diode (SLD)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SLD1325</td>
			<td>light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215;2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio</td>
			<td>AC Photonics</td>
			<td>WP13500202B201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reference Arm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimating Lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC080-020-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focusing Lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic Mirror Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1D Translational Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Continuous neutral density filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pedestrial Post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping Fork</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Arm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimating Lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC080-020-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relay Lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-100-C</td>
			<td>two Relay lens to make a telescope setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangle Mirror Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pedestrial Post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping Fork</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarization Controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mm Cage Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Rod</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D motorized translation stage</td>
			<td>Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.</td>
			<td>JTH360XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D Tilting Stage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation Stage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimating Lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC080-020-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grating</td>
			<td>Wasatch</td>
			<td></td>
			<td>G = 1145 lpmm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-theta Lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FTH-1064-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InGaAs Line-scan Camera</td>
			<td>Sensor Unlimited</td>
			<td>SU1024-LDH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Component</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT 116 Cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flask</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>70025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14388100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Sorenson Bioscience</td>
			<td>10340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco GlutaMax DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10569044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, US origin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89428-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipets</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>138080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702 R</td>
			<td>To centrifuge the 15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>AWEL CF 48-R</td>
			<td>To centrifuge the 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology &#38; IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital slide scanner</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Aperio AT2</td>
			<td>Obtain high-resolution histological images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology Service</td>
			<td>Histowiz</td>
			<td></td>
			<td>Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>List of Commerical OCTs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-OCT system</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Telesto Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-OCT system</td>
			<td>Wasatch Photonics</td>
			<td>WP OCT 1300 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for Data Analyses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Image Analysis</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji also works.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Rendering</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Amira</td>
			<td>Commercial software. Option 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Rendering</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris</td>
			<td>Commercial software. Option 2. Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT acquisition software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>custom developed in C++.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Control</td>
			<td>Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.</td>
			<td>MRC_3</td>
			<td>Incorporated into the custom OCT acquisition code</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morphological and Physiological Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>custom developed in MATLAB</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography

Tumor-Sphäroide wurden als eine dreidimensionale (3D) Kultur Zellmodell in der Krebs-Forschung und Anti-Krebs-Wirkstoffforschung entwickelt. Jedoch Hochdurchsatz-bildgebende Modalitäten Verwendung von hellen Feld oder Fluoreszenz-Detektion, derzeit nicht in der Lage, die insgesamt 3D-Struktur des Tumor-Sphäroid aufgrund begrenzter Lichtdurchlässigkeit, Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen zu lösen und Tiefe-Abwicklungsfähigkeit. Vor kurzem, unser Labor demonstriert die Verwendung der optischen Kohärenztomographie (OCT), ein markierungsfreie und zerstörungsfreie 3D bildgebende Modalität, um längs Charakterisierung von mehrzelligen Tumor Sphäroide in eine 96-Well-Platte auszuführen. OCT war in der Lage, 3D morphologischen und physiologischen Informationsbeschaffung der Tumor Sphäroide wächst bis zu ca. 600 µm in der Höhe. In diesem Artikel zeigen wir eine Hochdurchsatz-Okt (HT-Okt) Image System, die scannt die gesamte Multi-well-Platte und OCT 3D-Daten der Tumor Sphäroide automatisch erhält. Wir beschreiben die Details der HT-OCT-System und Bau Richtlinien im Protokoll. Aus den 3D-Daten OCT einer visualisieren die Gesamtstruktur der Sphäroid mit 3D gerendert und orthogonale Scheiben Längenwachstums Kurve von der Tumor-Sphäroid morphologische anhand von Größe und Volumen zu charakterisieren und überwacht das Wachstum von die toten Zellen Regionen in der Tumor-Sphäroid basierend auf optische intrinsischen Dämpfung Kontrast. Wir zeigen, dass HT-OCT als Hochdurchsatz-bildgebende Modalität für Drug screening sowie die Charakterisierung von Biofabricated Proben verwendet werden kann.

Hoher Durchsatz optische Kohärenz Tomographie Bildgebung der Sphäroide in eine 96-Well-Platte
Abbildung 3 zeigt das Ergebnis der HT-OCT Abtastung einer 96-Well-Platte mit HCT-116 Tumor Sphäroide am 3. Tag. Sequentielle Scan der gesamten Platte beginnt aus dem rechten unteren Brunnen (H12). Abbildung 3 b zeigt das Flussdiagramm der Software-Implementierung des Systems de...

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Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Optische Kohärenztomografie (OCT), eine dreidimensionale imaging-Technologie, wurde verwendet, um zu überwachen und zu charakterisieren, die Wachstum Kinetik der vielzelligen Tumor Sphäroide. Präzise volumetrische Quantifizierung der Tumor Sphäroide mit einem Voxel zählen Ansatz und markierungsfreie abgestorbenes Gewebe-Erkennung in der Sphäroide basierend auf intrinsische optische Dämpfung dagegen wurden demonstriert.

Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der dreidimensionalen Tumor Sphäroide mit optischen Kohärenztomographie

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Dreidimensionale Tumorsphäride können gewebespezifische Eigenschaften von Tumoren in vivo imitieren und liefern mehr klinisch relevante Daten für die Entdeckung von Krebsmedikamenten als einfache 2D-Zellkultur. Unsere bildgebende Technik, die optische Kohärenztomographie, kann die 3D-Struktur eines einzelnen Tumornervs mit einer Größe von mehreren hundert Mikrometern leicht visualisieren und eine genauere Charakterisierung seiner Morphologie und des Jobbefestes ermöglichen, oft innerhalb weniger Sekunden. Mit 3D-Sphärischen Modell können wir potenziell verkürzen die Zeitleiste der Arzneimittelentdeckung, Kosten senken und neue Medikamente für Patienten effektiver bringen.Die Bildung der sphärischen Form eines Tumorclusters ist ein entscheidender Schritt in unserem Experiment. Es ist wichtig, die richtige ultra-niedrige Befestigungsplatte mit dem runden Boden und die richtige Zentrifugationsgeschwindigkeit nach der Zellaussaat zu wählen. Starten Sie dieses Experiment, indem Sie Zellen von interessanten in einem Kulturkolben wachsen, wie im Manuskript beschrieben.Pflegen Sie die Zellen in einem Inkubator unter Standardbedingungen, und überwachen Sie ihren Gesundheitsstatus jeden Tag. Aktualisieren Sie die Medien nach Bedarf. Um 3D-Zellkultur in Multi-Well-Platten durchzuführen, entfernen Sie zuerst das Medium aus dem Zellkulturkolben und waschen Sie die Zellen mit sterilisierten, 33 Grad Celsius vorgewärmten PBS.Fügen Sie dann einen Milliliter Trypsin-EDTA hinzu, um die Zellen wieder auszusetzen und drei Minuten bei 37 Grad Celsius zu brüten. Fügen Sie drei Milliliter Kulturmedium, um das Trypsin zu verdünnen. Übertragen Sie diese Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 500G und Raumtemperatur für fünf Minuten.Dann entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit vier Millilitern vorgewärmtem Kulturmedium wieder auf. Um die Zellkonzentration zu bestimmen, hypnotieren Sie einen Tropfen probe auf ein Hämozytometer, und zählen Sie die Zellen. Auf gewünschte Saatkonzentration verdünnen.Samen 200 Mikroliter Zellsuspension in jeden Brunnen einer ultra-niedrigen Aufsatz, runde Boden Multi-Well-Platte, mit einer Konzentration von 3.000 Zellen pro Milliliter, um etwa 600 Zellen pro Brunnen zu erreichen. Unmittelbar nach der Aussaat die gesamte Platte mit der niedrigsten verfügbaren Geschwindigkeit bei Raumtemperatur sieben Minuten zentrieren. Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5%Co2, stellen Sie sicher, dass das Medium alle drei Tage zu erfrischen.Erstellen Sie zunächst den Referenzarm und den Probenarm des OCT-Systems nach den Schaltplänen in diesem Manuskript. Dann konstruieren Sie das Spektrometer, einschließlich eines Kilometers, einer Benotung, eines F-Theta-Objektivs und einer Linienscankamera. Verwenden Sie einen Plattenadapter, um die Multi-Well-Platte in einer festen Position zu halten.Korrigieren Sie vor der Bildgebung das Kippen und Drehen der Multi-Well-Platte mit einer 2D-Kippstufe und einer Aufderlaufstufe, die auf der Übergangsstufe montiert ist, um die Variation der Brennebene von verschiedenen Brunnen zu minimieren. Passen Sie dann die Drehung an, um sicherzustellen, dass die Kanten der Platte parallel zur Richtung der Bühnenbewegung sind, so dass die Bohrungen an den gleichen horizontalen Positionen in den OCT-Bildern bleiben. Passen Sie dann die Kippstufe an, um sicherzustellen, dass die Platte parallel zum optischen Tisch ist, so dass die Bohrungen an den gleichen vertikalen Positionen für die Bildgebung bleiben.Entfernen Sie am Tag der Tumorsphäroide die Multi-Well-Platte aus dem Inkubator. Übertragen Sie es unter das OCT-Bildgebungssystem und legen Sie es auf den Plattenadapter. Um die Höhe der Platte anzupassen, bewegen Sie sie entlang der Z-Richtung der Übersetzungsstufe.Legen Sie in der benutzerdefinierten Bildverarbeitungssoftware einen gewünschten OCT-Scanbereich fest, um den gesamten Tumorsphäroid je nach Entwicklungsstadien abzudecken, und klicken Sie auf Speicherparameter, um die Einstellung zu speichern. Dann zeigen Sie die optimierte XZ und YZ OCT Vorschau von Tumorsphäroiden. Erfassen Sie 3D-OCT-Bilder von Tumorsphäroiden nacheinander für alle Brunnen der Platte, die Sphäroide enthalten.Um das Vorschaubild anzuzeigen, klicken Sie auf die Vorschauschaltfläche. Und um das OCT-Bild zu erfassen, klicken Sie auf die Schaltfläche "Acquire". Zeichnen Sie den gesamten Schrittverschiebungsprozess der OCT-Datenerfassung auf.Um die optimale Bildqualität für alle Tumorsphäroide zu gewährleisten, muss der Plattenadapter genau abgestimmt werden und das Mittlere Volumen muss gleich sein. Verwenden Sie einen benutzerdefinierten C+-Verarbeitungscode, um 3D-OCT-Datensätze von Tumorsphäroiden zu verarbeiten, um OCT-Strukturbilder zu generieren. Verwenden Sie 2D-OCT-Bilder in drei Querschnitts-, XY-, XZ- und YZ-Ebenen über den Schwerpunkt des Sphäroids, um die Collage von Sphäroidbildern zu erzeugen.Um 3D-Rendering des Sphäroids mit einer gewünschten Software zu erhalten, laden Sie zuerst die SD-OCT-Daten in die Software. Klicken Sie auf das Übersteigen-Bedienfeld, fügen Sie dann ein neues Volume hinzu, und wählen Sie den Mischmodus aus, der für das 3D-Rendering verwendet werden soll. Um den Betrachtungswinkel anzupassen, ziehen Sie mit dem Mauszeiger das Bild und fahren Sie mit der Quantifizierung fort, wie im Manuskript beschrieben.Aus den verarbeiteten Daten wurde eine Collage aus unfazierten OCT-Bildern von HCT116-Zellliniensphäroiden erzeugt, deren Ergebnisse mit Bildern aus anderen 2D-Hochdurchsatz-Bildgebungssystemen vergleichbar sind. Darüber hinaus wurde die Collage aus 2D-Querschnittsphäroidbildern aus 96 Brunnen erzeugt, um Sphäroidhöhen zu überwachen und Sphäroid-Inhomogenität in vertikaler Richtung zu visualisieren. Eine Collage aus 3D-gerenderten Sphäroidbildern kann aus jedem vordefinierten Winkel erzeugt werden, um die gesamte 3D-Form zu visualisieren und die Rundheit des Sphäroids auszuwerten.Nach der allgemeinen OCT-Nachbearbeitung wurden 3D-OCT-Strukturbilder eines Tumorsphäroids erhalten. Aus den OCT-Daten wurden ein 3D-Oberflächenpfosten und XZ-, YZ- und XY-Orthogonalscheiben generiert, um die Struktur des Tumorsphäroids in jede Richtung zu visualisieren. Die Längsüberwachung eines einzelnen Tumorsphäroids wurde durchgeführt, um seinen Durchmesser, seine Höhe und sein voxelbasiertes Volumen zu charakterisieren und die Wachstumskurven in Größe und Volumen während der 21-tägigen Entwicklung zu erzeugen.Hier wurde das Sphäroid am 11. Tag gestört und brach am 21. Tag vollständig zusammen. Längsspuren zeigten die Zunahme der toten Zellbereiche im Tumorsphäroid. 3D-gerenderte Bilder des Tumorsphäroids zeigten das Aussehen und Wachstum von toten Zellregionen vom siebten bis zum 14. Tag, wie die Zunahme der rot hervorgehobenen nekrotischen Bereiche zeigt.Als der Prozentsatz der nekrotischen Bereiche zunahm, konnte das Tumorsphäroid seine perfekte Form nicht beibehalten und brach daher zusammen. Mit dieser Bildgebungsplattform können wir weitere komplexe Tumorsphärenmodelle erforschen, wie 3D-Bildgebungsmodell, riesige Kreaturenmodelle und Co-Kultur-Modelle, um In-vivo-Tumoren besser zu simulieren. Unser OCT-Bildgebungssystem mit hohem Durchsatz kann einen alterativen Ansatz für das Arzneimittelscreening bei der Entdeckung von Krebsmedikamenten bieten.Dies ist etwas, das auch charakterisiert ist, 3D-Biofabrikatierte Proben für verschiedene biomedizinische Anwendungen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation von Hochdurchsatz-dreidimensionale Tumor Sphäroide für Drogen-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Forschung

Krebsforschung

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Dreidimensionale extrazelluläre Matrix Knochenmodell für Osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Voll menschliche Tumor-basierte Matrix im dreidimensionalen Spheroid-Invasions-Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablierung und Charakterisierung von kleinen Darm Neuroendokrinen Tumor Sphäriden

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Ein dreidimensionales Modell von Sphäroiden zur Untersuchung von Darmkrebs-Stammzellen

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Dreidimensionales biomimetisches In-vitro-Modell des Neuroblastoms unter Verwendung von kollagenbasierten Gerüsten

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Ein dreidimensionales Sphäroidmodell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Wechselwirkung bei hepatozellulären Karzinomen

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Erhaltung der zellulären Vielfalt des menschlichen Glioblastoms ex vivo unter Verwendung dreidimensionaler Organoidkultur

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Combining Reflectance Confocal Microscopy with Optical Coherence Tomography for Noninvasive Diagnosis of Skin Cancers via Image Acquisition

Kombination von konfokaler Reflexionsmikroskopie mit optischer Kohärenztomographie zur nicht-invasiven Diagnose von Hautkrebs mittels Bildaufnahme

Skin cancer is one of the most common cancers worldwide. Diagnosis relies on visual inspection and dermoscopy followed by biopsy for histopathological ...