Name: using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes
Uploaded: 2019-01-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

تسنى هذا العمل بالمنحة R01 المعاهد الوطنية للصحة (NS094721، K.A.J.).

1-في المختبر الشكل
ملاحظة: يتم تعديل البروتوكول من البروتوكول المنشورة1.
<ol><li>إعداد قالب الحمض النووي الريبي ملاحظة: وأمرت القالب للنسخ T7 اصطناعية مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (dsDNA) وتضخيمه بالإدراج أما إلى متجه كولاي<...

<ol>
	<li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+Quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>Trausch, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+diversity+in+the+SAM+clan+of+riboswitches.">Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).</li><li>Souliere, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+a+riboswitch+response+through+structural+extension+of+a+pseudoknot.">Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).</li><li>Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+Analysis+of+Small+RNAs+and+Riboswitches.">SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches.</a> Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+SHAPE+analysis+in+living+cells.">RNA SHAPE analysis in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).</li><li>Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+a+small-molecule+modulator+of+SMN2+splicing.">Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).</li><li>Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mn+2++-Sensing+Mechanisms+of+yybP-ykoY+Orphan+Riboswitches.">Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches.</a> Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).</li><li>Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+contacts+control+switching+of+the+SAM-I+riboswitch.">Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch.</a> Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).</li><li>Abulwerdi, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Small+Molecules+with+a+Noncanonical+Binding+Mode+to+HIV-1+Trans+Activation+Response+(TAR)+RNA.">Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).</li><li>Shortridge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrocyclic+Peptide+Ligand+Binds+the+Oncogenic+MicroRNA-21+Precursor+and+Suppresses+Dicer+Processing.">A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).</li><li>Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+targeting+RNA+with+drug-like+small+molecules.">Principles for targeting RNA with drug-like small molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+against+RNA+targets+attract+big+backers.">Small molecules against RNA targets attract big backers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).</li><li>Shortridge, M. D., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+based+approaches+for+targeting+non-coding+RNAs+with+small+molecules.">Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules.</a> Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).</li><li>Gallego, J., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RNA+with+Small-Molecule+Drugs:+Therapeutic+Promise+and+Chemical+Challenges.">Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).</li><li>Rizvi, N. F., Smith, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+small+molecule+druggable+target.">RNA as a small molecule druggable target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).</li><li>Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Role+of+RNA+as+a+Therapeutic+Target+for+Small+Molecules.">The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules.</a> Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).</li><li>Palacino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splice+modulators+enhance+U1-pre-mRNA+association+and+rescue+SMA+mice.">SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice.</a> Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).</li><li>Ratni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Risdiplam,+a+Selective+Survival+of+Motor+Neuron-2+(+SMN2+)+Gene+Splicing+Modifier+for+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy+(SMA).">Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA).</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).</li><li>Naryshkin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splicing+modifiers+improve+motor+function+and+longevity+in+mice+with+spinal+muscular+atrophy.">SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy.</a> Science. 345, (2014).</li><li>Chiriboga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+Evidence+for+Pharmacodynamics+Effects+of+RG7916+in+JEWELFISH,+a+Study+in+Patients+with+Spinal+Muscular+Atrophy+who+Previously+Participated+in+a+Study+with+Another+SMN2-Splicing+Targeting+Therapy+(S46.003).">Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003).</a> Neurology. 90, (2018).</li><li>Sivaramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+SMN2+pre-mRNA-protein+complex+elicits+specificity+for+small+molecule+splicing+modifiers.">Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SHAPE+reagents+for+mapping+RNA+structures+inside+living+cells.">Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells.</a> RNA. 23, 169-174 (2017).</li><li>Weeks, K. M., Mauger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+Structural+Codes+with+SHAPE+Chemistry.">Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).</li><li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+reveals+transcript-wide+interactions+,+complex+structural+domains+,+and+protein+interactions+across+the+Xist+lncRNA+in+living+cells.">SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).</li><li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+&#8242;+-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP)+for+direct+,+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis.">Selective 2 &#8242; -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes &amp; Development. 24, 1634-1644 (2010).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li><li>Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+SR+proteins+improves+SMN+expression+in+spinal+muscular+atrophy+cells.">Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells.</a> PloS One. 9, e115205 (2014).</li><li>Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+functional+implications+of+the+3D+architectures+of+viral+tRNA-like+structures.">Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures.</a> RNA. 15, 294-307 (2009).</li><li>Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+role+of+RNA+structure+in+alternative+splicing+of+a+critical+exon+in+the+spinal+muscular+atrophy+genes.">Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes.</a> Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).</li><li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy.">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).</li><li>Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+motif+discovery+by+SHAPE+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP).">RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP).</a> Nature Methods. 11, 959 (2014).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+Footprinting+to+Map+Sites+of+RNA-Protein+Interactions.">RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).</li><li>Velagapudi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+small+molecule+against+an+oncogenic+noncoding+RNA.">Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).</li><li>Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+NMR+to+structure+determination+of+RNAs+large+and+small.">Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).</li><li>Scott, L. G., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+determination+by+NMR.">RNA structure determination by NMR.</a> Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).</li></ol>

في الشكل في المختبر، من الضروري استخدام قالب الحمض النووي الريبي متجانسة ذات جودة عالية. ومع ذلك، غلة T7 النسخ، غالباً ما تسلسل غير متجانسة36. وبخاصة، تسلسل مع النوكليوتيدات ± 1 في 3 '-المحطة مع عائدات لا يستهان بها36 عادة من الصعب إزالتها بتنقية جل polyacrylamide. قالب الحمض...

أسيليشن انتقائية 2-هيدروكسيل تحليلها بواسطة الملحق التمهيدي (الشكل) أسلوب لقياس الحركية من كل النوكليوتيدات في تسلسل الحمض النووي الريبي للفائدة وتوضيح هيكل الثانوية في قرار واحد-النوكليوتيدات1. المنهجيات الشكل، سواء في الظروف المختبرية2،3،4 (تنقية الحمض النووي الريبي في نظام المخزن مؤقت معرفة) وفي خلايا الثدييات الحية5،6، وقد وضعت للتحقيق الثانوي هيكل تسلسل متوسط طول الحمض النووي الريبي (عادة < النيوكليوتيدات 1,000 للشكل في الخلية و < النيوكليوتيدات 200 للشكل الأنبوبي). أنها مفيدة بشكل خاص لتقييم التغيرات الهيكلية في مستقبلات الحمض النووي الريبي عليها ملزمة للتفاعل الحمض النووي الريبي جزيء صغير والايضات2،4،،من78 ودراسة الإجراءات آليا من جزيئات الحمض النووي الريبي استهداف خلال المخدرات التنمية9،10.
اكتشاف المخدرات تستهدف الجيش الملكي النيبالي مؤخرا لفت الانتباه في المختبرات الأكاديمية و الصناعة الصيدلانية11،12 عبر مختلف النهج والاستراتيجيات13،،من1415 ،16. وتشمل الأمثلة الأخيرة الجزيئات الصغيرة التي تستهدف الجيش الملكي النيبالي للاستخدام السريري العقاقير التجريبية هيكلياً متميزة LMI-07017 و RG-791618،19، لضمور العضلات الشوكي (SMA)، الذي أظهر واعدة النتائج في مرحلة التجارب السريرية الثاني20. كل الجزيئات وقد أثبت لبقاء الهدف من الخلايا العصبية الحركية (الجالي) قبل 2-مرناً وتنظيم عملية الربط SMN2 الجينات6،،من1721. أظهرنا سابقا التطبيق في المختبر والشكل في الخلية في دراسة التغيرات الهيكلية المستهدفة الحمض النووي الريبي حضور تمثيلي للنمو الحقيقي-7916 المعروفة باسم C2 الجالي6.
من حيث المبدأ، التدابير شكل معدل أسيليشن 2 '--يا كل نوكليوتيد تسلسل الحمض النووي الريبي حضور المبالغ الزائدة من كاشف أسيليشن التبريد الذاتي بطريقة غير متحيزة. الكاشف أسيلاتيون ليست مستقرة في الماء، وله فترة قصيرة (مثل، T1/2 = 17 s 1-الميثيل-7-نيترويساتويك الخل؛ أو 1 م 7، ~ 20 دقيقة إيميدازوليدي حمض 2-ميثيلنيكوتينيك، أو ناي)22 وعدم الاكتراث بالهوية قواعد23. هذه النتائج في أسيليشن مواتية أكثر المجموعات 2 '--أوه القواعد المرنة، التي يمكن أن تتحول إلى تقييم دقيق لديناميات كل النوكليوتيدات. على وجه التحديد، النوكليوتيدات في قاعدة زوج عادة أقل رد الفعل من أحد مزاوج إلى كاشف تعديل 2 '--أوه، مثل ناي و 1 م 7.
النظر في مصدر القالب الجيش الملكي النيبالي، والتي يجري فيها أسيليشن 2 '--يا، ويمكن عموما تصنيف الشكل في الشكل في المختبر وفي الخلية. في استخدامات الأنابيب الشكل T7 المنقي نسخها الجيش الملكي النيبالي ويفتقر إلى سياق خلوية في تصاميم تجريبية. في الشكل في الخلية، وتحدث كل من الجيش الملكي النيبالي قالب النسخ وأسيليشن 2 '--يا داخل الخلايا الحية؛ ولذلك، يمكن أن الخص النتائج النموذج الهيكلي الجيش الملكي النيبالي في سياق خلوية. قد أحيلت إلى الشكل في الخلية كما هو الحال في فيفو الشكل للشكل في الخلايا الحية في الأدب24. حيث لم يتم تنفيذ هذه التجربة في حيوان، نحن وصف هذه التجربة على الشكل في الخلية للتأكد من دقتها.
كما تختلف أيضا استراتيجيات لمرحلة التمديد التمهيدي للشكل في المختبر وفي الخلية. في الشكل في المختبر، وتوقف النسخ العكسي في موقف أسيليشن 2 '--يا حضور Mg2 +. ولذلك يظهر ملحق التمهيدي 32فالمسمي كعصابة في جل polyacrylamide التفريد (صفحة) وكثافة الفرقة يكون متناسباً مع معدل أسيليشن1. في الشكل في الخلية، وينشئ النسخ العكسي الطفرات العشوائية في 2 '--أوه adduct موقف حضور Mn2 +. معدل كل النوكليوتيدات حيث يمكن التقاطها بواسطة في عمق الجيل التالي التسلسل، ويمكن ثم حساب مفاعليه الشكل في قرار واحد-النوكليوتيدات.
مشكلة محتملة للشكل في الخلية هو نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة (أي أغلبية المجموعات 2 '--يا معدلة، بينما تسلسل غير معدلة تحتل أكثر من القراءة في تسلسل الجيل القادم). في الآونة الأخيرة، طريقة لإثراء 2 '--أوه تعديل الحمض النووي الريبي، المشار إليها كما هو الحال في فيفو انقر فوق الشكل (إيكشابي)، وضعه مختبر تشانغ25. قد يكون هذا الأسلوب الإثراء مفيدة في دراسة الجزيئات الصغيرة ضعيفة مثل التفاعلات الحمض النووي الريبي، خاصة في استجواب على نطاق الترنسكربيتوم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>gBlock for &#62; 200 bp DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin gel and PCR clean-up kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaScript T7 transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1333</td>
			<td>Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TBE-urea sample buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow&#8482; Filter Unit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Safe dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 % TBE-urea mini-gel</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperscreen&#8482; Intensifying Screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1669</td>
			<td>calcium tungstate phosphor screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphor storage screen</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>BAS-IP MS 3543 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Typhoon</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAI (2M)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>03-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Contains 5X RT buffer, SuperScript IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddNTP set (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE27-2045-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>GD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Also contains RNase A and protease K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMN2 minigene34</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpLE</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca/ Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Also contains RW1, RPE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Contains DNase I and RDD buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>random nonamer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11904-018</td>
			<td>Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime pfx DNA polymerse</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12344024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucAway column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM10070</td>
			<td>for desalting purpose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes

عملية تطوير العقاقير للجزيئات الصغيرة التي تستهدف الجيش الملكي النيبالي، توضيح التغييرات الهيكلية على تفاعلها مع تسلسل الحمض النووي الريبي الهدف هو المطلوب. نحن نقدم هذه الوثيقة التفصيل في المختبر وانتقائية في الخلية 2-هيدروكسيل أسيلاتيون تحليلها من قبل تمديد التمهيدي البروتوكول (الشكل) لدراسة التغير الهيكلي حضور دواء تجريبي لضمور العضلات الشوكي (SMA)، البقاء على قيد الحياة من الجيش الملكي النيبالي الخلايا العصبية الحركية (العليا)-C2, وفي إكسون 7 من قبل-مرناً الجينات SMN2. في الشكل في المختبر، وهو تسلسل الحمض النووي الريبي من 140 النيوكليوتيدات التي تحتوي على SMN2 إكسون 7 نسخها من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 ومطوية بحضور الجالي-C2 وتعديله فيما بعد بكاشف أسيليشن خفيف 2 '--أوه، إيميدازوليدي حمض 2-ميثيلنيكوتينيك (ناي). هذا adduct 2 '--يا ناي هو كذلك سبر طريق 32تمديد التمهيدي المسمى ف وحلها بالتفريد جل polyacrylamide (صفحة). على العكس من ذلك، أسيليشن 2 '-OH في الشكل في الخلية يأخذ مكان في الموقع مع الجالي-C2 ملزمة الخلوية الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية. ثم اتسع نطاق تسلسل مرناً قبل إكسون 7 في الجينات SMN2، جنبا إلى جنب مع الطفرات المستحثة بالشكل في تمديد التمهيدي، بكر ويخضع لتسلسل الجيل القادم. المقارنة بين المنهجيتين، الشكل في المختبر هو وسيلة أكثر فعالية من حيث تكلفة ولا تتطلب الطاقة الحسابية لتصور النتائج. ومع ذلك، الطراز المستمدة من شكل الجيش الملكي النيبالي في المختبر أحياناً ينحرف عن هيكل الثانوي في سياق خلوية، يرجح أن سبب فقدان جميع التفاعلات مع الحمض النووي الريبي ملزم البروتينات. الشكل في الخلية لا تحتاج إلى مكان مواد مشعة وغلة بنية الحمض النووي الريبي ثانوي أكثر دقة في سياق الخلوية. وعلاوة على ذلك، الشكل في الخلية المطبقة عادة لتسلسل مجموعة من الجيش الملكي النيبالي أكبر (~ 1,000 النيوكليوتيدات) باستخدام تسلسل الجيل القادم، مقارنة في المختبر الشكل (~ 200 النيوكليوتيدات) التي عادة ما تعتمد على تحليل صفحة. في حالة المستمدة من إكسون 7 في SMN2 قبل-مرناً، الشكل في المختبر وفي خلايا الحمض النووي الريبي النماذج مشابهة لبعضها البعض.

أظهرنا سابقا أن الجيش الملكي النيبالي الربط المغير، الجالي-C2، يتفاعل مع فكرة أجاج على إكسون 7 من قبل-مرناً مورث SMN2، ويستخدم الشكل لتقييم التغيرات الهيكلية الحمض النووي الريبي حضور C2 الجالي6. موقع الربط الجالي-C2 يختلف عن وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير ال...

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

بروتوكولات مفصلة لكلا أسيليشن في المختبر وفي خلايا انتقائية 2-هيدروكسيل تحليلها بواسطة التمهيدي ملحق (الشكل) تجارب لتحديد هيكل تسلسل قبل مرناً لمصلحة حضور جزيء صغير استهداف الجيش الملكي النيبالي الثانوية المعروضة في هذه المقالة.

تستخدم في المختبر وفي خلايا الشكل للتحقيق في جزيء الصغيرة التي يسببها مرناً قبل إجراء تغييرات هيكلية

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

هذا الفيديو سوف توفر بروتوكولات مفصلة للتجارب شكل في المختبر لتحديد الهيكل الثانوي لتسلسل الحمض النووي الريبي من الفائدة في وجود الجيش الملكي النيبالي استهداف جزيء صغير. في شكل المختبر هو وسيلة فعالة من حيث التكلفة لفهم ديناميات كل النيوكليوتيد على عنصر الحمض النووي الأمينية الحجم الذي عادة ما يكون أقل من 200 النيوكليوتيدات. بعد إعداد قالب RNA كما هو موضح في المخطوطة، فإنّ التسمية الراديوية تعكس الاعتياءات باضافة جهاز غاما 32P ATP، معكوسة النص التمهيدي.10XPNK العازلة التفاعل, كيناز متعدد النوكليوتيد والمياه RNA الحرة في أنبوب microcentuge 1.7 ملليلتر في حجم إجمالي قدره 20 ميكرولترات. ثم احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم تقوم بتنشيط العينات لمدة 20 دقيقة منذ 65 درجة مئوية ثم تصفية العينات في عمود إزالة التشبع والطرد المركزي في 1000 مرة G.Add 25 ميكرولترات من 2XTBE عينة العازلة ومزيج.خفض هذه المنتجات المسمى في هلام 10٪ الاكريلاميد وتأكد من تجنب نزيف النشاط الإشعاعي في الخزانات العليا. تشغيل الجل في 20 واط لمدة ساعة واحدة. بعد الركض، قم بإزالة اللوحات الزجاجية من الكاسيت الجل.وضع الجل على قطعة من البلاستيك التفاف. أضعاف البلاستيك على الجزء العلوي من هلام لجعل شطيرة الهواء ضيق. ضع شطيرة هلام على شاشة الفوسفور الكالسيوم tungstate وفضح مع أداة تخيل.صورة هلام مرة أخرى مع الضوء العادي لمعرفة أين حواف هلام هي. استخدم برنامج معالجة الصور لتراكب الصورتين وتراكب الصور الفاتحة والمظلمة. ثم جعل الصورة العليا معتمة قليلا من أجل رؤية كل من الصور في وقت واحد.تأكد من أن الصورة المطبوعة بنفس حجم الجل الفعلي. ثم قم بمحاذاة الجل على الصورة المطبوعة. وأخيرا، استخدام شفرة حلاقة معقمة لقطع الانحناءات المطلوبة من هلام ووضع كل قطعة من هلام في أنبوب منفصل 1.7 ملليلتر microcentrifuge.لاستعادة الحمض النووي من شريحة هلام عن طريق elution السلبي، إضافة 0.3 ملليلتر من مزيج هطول الأمطار elution إلى كل أنبوب 1.7 ملليلتر. احتضان الأنابيب في وعاء آمن بالإشعاع على دوار عند أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة. بعد الحضانة، نقل السائل إلى أنبوب جديد 1.7 ملليلتر.إضافة 2.5x الجليد البارد 200 الايثانول واقية وعكس الأنابيب ست مرات لخلط السائل. احتضان الأنابيب في ناقص 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد الطرد المركزي في 10، 000g وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق، وإزالة فائقة بعناية عن طريق الأنابيب.إضافة ملليلتر واحد من 80٪ الإيثانول لغسل بيليه. دوامة لمدة 15 ثانية والطرد المركزي مرة أخرى في ظل نفس الظروف. بعد إزالة المناط عن طريق الأنابيب، والهواء الجافة بيليه الحمض النووي لمدة خمس دقائق.إضافة 50 ميكرولترات من المياه RNA مجانا واخلط عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10 مرات. تطبيع تركيز الحمض النووي إلى حوالي 100،000 العد في الدقيقة لكل ميكرولتر في عداد التلألؤ. لإعداد أربع عينات للتعديل الكيميائي، إضافة ثمانية picomoles من الجيش الملكي النيبالي في 32 ميكرولترات من 0.5 XTE العازلة إلى أنبوب microcentuge 1.7 ملليلتر.سخني 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين واتئم بالبرد على الجليد لمدة دقيقة واحدة على الأقل. ثم إضافة ثمانية ميكرولترات من 5x المزيج للطي، مزيج تخصيص تسعة ميكرولترات من هذا الخليط الحمض النووي الريبي في كل من أنابيب PCR الأربعة، وصفت من واحد إلى أربعة. إضافة ميكرولتر واحد من 10٪ DMSO في أنبوب ملحوظ كواحد، ميكرولتر واحد من محلول جزيء صغير مركزة في أنبوب اثنين، ميكرولتر واحد من محلول جزيء صغير مخفف في أنبوب ثلاثة وميكر واحد من الماء في أنبوب أربعة.احتضان جميع أنابيب PCR في 37 درجة مئوية في دورة حرارية لمدة 30 دقيقة. مباشرة قبل اثنين من رئيس التفاعل تعديل OH، تمييع ميكرولتر واحد من اثنين من محلول الأسهم NAI المولار في ثلاثة microliters من المياه المعالجة DEPC لتحقيق حل العمل المول 0.5. على الفور إضافة ميكرولتر واحد من هذا الحل في أنابيب واحد واثنين وثلاثة.إضافة ميكرولتر واحد من 25٪ DMSO في أنبوب أربعة واحتضان في دورة حرارية في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. إعداد أربعة أنابيب 1.7 ملليلتر microcentuge الطازجة وإضافة 100 ميكرولترات من مزيج هطول الأمطار elution واثنين من microliters من الجليكوجين إلى كل أنبوب. ثم في كل من هذه الأنابيب نقل كل السائل من أنابيب PCR المقابلة.إضافة 0.34 ملليلتر من الجليد البارد 200 الايثانول واقية في كل أنبوب ومزيج من دوامة لمدة خمس ثوان. ضع الأنابيب في ثلاجة ناقص 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. ثم الطرد المركزي الأنابيب لمدة 15 دقيقة في 14،000 مرات G في أربع درجات مئوية.دون إزعاج بيليه RNA، وإزالة عظمى من كل أنبوب. إضافة 0.5 ملليلتر من 80٪ الإيثانول في أنبوب لغسل بيليه الحمض النووي الريبي ودوامة لمدة 15 ثانية. بعد الطرد المركزي في نفس الظروف مرة أخرى، وإزالة عظمى والهواء الجاف بيليه الجيش الملكي النيبالي لمدة خمس دقائق.إضافة تسعة ميكرولترات من المياه والبيب رنا مجانا أن صعودا وهبوطا 10 مرات لخلط. نقل الحمض النووي الريبي المعدلة إلى أربعة أنابيب PCR جديدة وتسمية لهم واحد إلى أربعة كما في الخطوة السابقة. إضافة اثنين picomoles من الحمض النووي الريبي في سبعة ميكرولترات من المياه المعالجة DEPC إلى كل من أربعة أنابيب PCR إضافية وتسمية لهم مع أرقام من خمسة إلى ثمانية.إضافة اثنين microliters من التمهيدي radiolabeled تعافى إلى كل من ثمانية أنابيب PCR ملحوظ واحد إلى ثمانية. بعد تسخين في 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، على الفور يبرد إلى أربع درجات مئوية في دورة الحرارية. إضافة أربعة ميكرولترات من 5x RT العازلة، وميكر واحد من 0.1 داتولير واحد microliter من مزيج DNTP إلى كل من الأنابيب.ثم إضافة اثنين من microliters من المياه المعالجة DEPC إلى أنابيب واحد إلى أربعة. إضافة أربعة microliters من خمسة ملليمولار ddATP إلى أنبوب خمسة, أربعة microliters من خمسة ملليمتر ddTTP إلى أنبوب ستة وأربعة ميكرولترات من خمسة الغمولار DdCTP إلى أنبوب سبعة وميكر واحد من خمسة ملليمتر ddGTP وثلاثة ميكرولترات من المياه المعالجة DEPC إلى أنبوب ثمانية وماصة أربع مرات لخلط. بعد تسخين جميع أنابيب PCR في 52 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة في دورة حرارية، إضافة ميكرولتر واحد من النسخ العكسي لكل أنبوب وأنابيبه صعودا وهبوطا أربع مرات لخلط.احتضان ردود الفعل في 52 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في دورة الحرارية. لhylyze الجيش الملكي النيبالي، إضافة ميكرولتر واحد من خمسة هيدروكسيد الصوديوم الضرس في كل من الأنابيب وتسخينها في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم إضافة خمسة ميكرولترات من حمض الهيدروكلوريك مولر واحد لتحييد التفاعل وتكرار هطول الأمطار الإيثانول كما هو موضح سابقا.بعد تجفيف الهواء بيليه الحمض النووي لمدة خمس دقائق، إضافة 10 ميكرولترات من الماء و 10 ميكرولترات من 2xTBE عينة اليوريا تحميل العازلة في أنابيب 1.7 ملليلتر والأنابيب عنه صعودا وهبوطا 10 مرات إلى redissolve. سخني العينات على حرارة 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، ثم ضع الأنابيب على الجليد، قبل تحميلها على الجل. تحميل 10 ميكرولترات من العينة التي تم وضعها على الجليد على 8٪ polyacrylamide التسلسل هلام.تشغيل الجل في 65 واط لمدة ساعتين أو حتى صبغة أسفل تصل إلى 3/4ths من هلام. إزالة المسافة وإدراج بلطف ملعقة لإزالة لوحة الزجاج السيليكون العلوي. غطّي الجل بقطعة من ورق التصفية الكبير واضغط بلطف للسماح للجل بالتمسك بورق التصفية.بدءا من نهاية أسفل، ورفع ورقة تصفية وإزالة هلام من لوحة زجاجية جنبا إلى جنب مع ورقة. بعد نقل الجل إلى ورق التغليف كما كان يحدث من قبل، جففه عند درجة 70 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع فراغ، مع التأكد من استخدام العديد من أوراق التصفية بين الجل والمجفف. نقل شطيرة هلام على كاسيت تخزين الفوسفور الصورة المبيضة وفضح النشاط الإشعاعي من هلام إلى الشاشة لمدة أربع إلى 16 ساعة.وأخيرًا، ضع شاشة تخزين الفوسفور على جهاز تصوير وامسح ضوئيًا بدقة متوسطة لمدة 30 دقيقة تقريبًا. بعد تعريض هلام تسلسل البولي أكريلاميد إلى شاشة تخزين الفوسفور، وأظهرت تجربة شكل ناجحة منحنى واحد وأشد كثافة في الجزء العلوي من هلام والانحناءات في جميع أنحاء هلام في قرار النيوكليوتيد واحد دون مسحة. كما أظهر الجل أن شدة بعض الانحناءات تغيرت في وجود جزيئات صغيرة ، مما يشير إلى تغييرات في قوة الاقتران الأساسي.مشكلة شائعة في تحليل الصفحة هي أن منطقة مسحة تعرف باسم جبهة الملح قد تظهر في منتصف الجل، ربما بسبب تركيز عال من الملح، DMSO أو غيرها من المواد غير المرغوب فيها في عينة التحميل. يمكن تجنب ذلك عن طريق إزالة المادة غير المرغوب فيها عن طريق هطول الإيثانول. يفضل قالب الحمض النووي الريبي المتجانس للشكل في المختبر.نحن نستخدم الريبوسومات في كل من خمسة رئيس الوزراء وثلاثة نهايات رئيس للحصول على مثل هذا الحمض النووي الريبي. يمكن أيضاً أن يتم تنفيذ شكل الخلية للحصول على بنية ثانوية RNA في سياق الخلوي. تذكر, في شكل المختبر قد لا تتكخي في التفاعلات البروتين الربط الحمض النووي الريبي في الجسم الحي.في شكل المختبر هو وسيلة قوية للكشف عن التغيرات في بنية الحمض النووي الريبي بسبب وجود جزيء صغير. ويتم ذلك عن طريق قياس التغيرات في قوة النقش من توقف النسخ العكسي. كن حذراً من أن جميع التجارب الموصوفة في هذا الفيديو يتم إجراؤها في مكان عمل مشع معتمد مع الحماية الشخصية المناسبة والتدريع الزجاجي.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في<em&gt; C. ايليجانس</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

تحليل الكروموسومات الزيغ الناجم عن المواد-المحيط الجسيمات باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; النظام

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

في المختبر فحص الإضاءة الحيوية تميز إيقاع سيركاديان في الخلايا الظهارية الثديية

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

أسلوب أوبتوجينيتيك لمراقبة وتحليل أنماط التعبير الجيني في تفاعلات الخلية للخلية

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

التهجين في الموقع Fluorescence جزيء واحد (سمفيش) التحليل في مهدها الخميرة النمو الخضري والانقسام الاختزالي

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

تشريح للدالة محسن باستخدام محسن متعدد المستندة إلى كريسبر التدخل في خطوط الخلايا

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

التحليل الكمي للربط مرناً قبل البديلة في أقسام الدماغ الماوس باستخدام الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين المقايسة

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...