Name: using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes
Uploaded: 2019-01-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Dette arbejde blev muliggjort af NIH R01 grant (NS094721, K.A.J.).

1. in Vitro form
Bemærk: Protokollen er ændret fra den udgivne protokol1.
<ol><li>Forberede skabelonen RNA Bemærk: Skabelon for T7 transskription blev bestilt som en syntetisk dobbelt-strenget DNA (dsDNA) og forstærkes af enten indsættelse i en E. coli vektor der bærer en unik par af EcoRI/BamHI begrænsning liv1975 steder, såsom pET28a, eller ved PCR. Protokol til PCR-amplifikation er illustreret n...

<ol>
	<li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+Quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>Trausch, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+diversity+in+the+SAM+clan+of+riboswitches.">Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).</li><li>Souliere, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+a+riboswitch+response+through+structural+extension+of+a+pseudoknot.">Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).</li><li>Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+Analysis+of+Small+RNAs+and+Riboswitches.">SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches.</a> Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+SHAPE+analysis+in+living+cells.">RNA SHAPE analysis in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).</li><li>Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+a+small-molecule+modulator+of+SMN2+splicing.">Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).</li><li>Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mn+2++-Sensing+Mechanisms+of+yybP-ykoY+Orphan+Riboswitches.">Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches.</a> Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).</li><li>Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+contacts+control+switching+of+the+SAM-I+riboswitch.">Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch.</a> Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).</li><li>Abulwerdi, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Small+Molecules+with+a+Noncanonical+Binding+Mode+to+HIV-1+Trans+Activation+Response+(TAR)+RNA.">Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).</li><li>Shortridge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrocyclic+Peptide+Ligand+Binds+the+Oncogenic+MicroRNA-21+Precursor+and+Suppresses+Dicer+Processing.">A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).</li><li>Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+targeting+RNA+with+drug-like+small+molecules.">Principles for targeting RNA with drug-like small molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+against+RNA+targets+attract+big+backers.">Small molecules against RNA targets attract big backers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).</li><li>Shortridge, M. D., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+based+approaches+for+targeting+non-coding+RNAs+with+small+molecules.">Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules.</a> Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).</li><li>Gallego, J., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RNA+with+Small-Molecule+Drugs:+Therapeutic+Promise+and+Chemical+Challenges.">Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).</li><li>Rizvi, N. F., Smith, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+small+molecule+druggable+target.">RNA as a small molecule druggable target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).</li><li>Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Role+of+RNA+as+a+Therapeutic+Target+for+Small+Molecules.">The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules.</a> Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).</li><li>Palacino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splice+modulators+enhance+U1-pre-mRNA+association+and+rescue+SMA+mice.">SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice.</a> Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).</li><li>Ratni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Risdiplam,+a+Selective+Survival+of+Motor+Neuron-2+(+SMN2+)+Gene+Splicing+Modifier+for+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy+(SMA).">Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA).</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).</li><li>Naryshkin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splicing+modifiers+improve+motor+function+and+longevity+in+mice+with+spinal+muscular+atrophy.">SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy.</a> Science. 345, (2014).</li><li>Chiriboga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+Evidence+for+Pharmacodynamics+Effects+of+RG7916+in+JEWELFISH,+a+Study+in+Patients+with+Spinal+Muscular+Atrophy+who+Previously+Participated+in+a+Study+with+Another+SMN2-Splicing+Targeting+Therapy+(S46.003).">Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003).</a> Neurology. 90, (2018).</li><li>Sivaramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+SMN2+pre-mRNA-protein+complex+elicits+specificity+for+small+molecule+splicing+modifiers.">Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SHAPE+reagents+for+mapping+RNA+structures+inside+living+cells.">Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells.</a> RNA. 23, 169-174 (2017).</li><li>Weeks, K. M., Mauger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+Structural+Codes+with+SHAPE+Chemistry.">Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).</li><li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+reveals+transcript-wide+interactions+,+complex+structural+domains+,+and+protein+interactions+across+the+Xist+lncRNA+in+living+cells.">SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).</li><li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+&#8242;+-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP)+for+direct+,+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis.">Selective 2 &#8242; -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes &amp; Development. 24, 1634-1644 (2010).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li><li>Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+SR+proteins+improves+SMN+expression+in+spinal+muscular+atrophy+cells.">Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells.</a> PloS One. 9, e115205 (2014).</li><li>Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+functional+implications+of+the+3D+architectures+of+viral+tRNA-like+structures.">Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures.</a> RNA. 15, 294-307 (2009).</li><li>Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+role+of+RNA+structure+in+alternative+splicing+of+a+critical+exon+in+the+spinal+muscular+atrophy+genes.">Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes.</a> Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).</li><li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy.">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).</li><li>Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+motif+discovery+by+SHAPE+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP).">RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP).</a> Nature Methods. 11, 959 (2014).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+Footprinting+to+Map+Sites+of+RNA-Protein+Interactions.">RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).</li><li>Velagapudi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+small+molecule+against+an+oncogenic+noncoding+RNA.">Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).</li><li>Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+NMR+to+structure+determination+of+RNAs+large+and+small.">Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).</li><li>Scott, L. G., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+determination+by+NMR.">RNA structure determination by NMR.</a> Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).</li></ol>

I in vitro-form er det kritisk at bruge høj kvalitet homogene RNA skabelon. T7 transskription, dog udbytter ofte heterogene sekvenser36. Især er sekvenser med ±1 nukleotid på 3'-terminalen med ikke-ubetydelig udbytter36 som regel vanskeligt at blive fjernet af polyacrylamid gel rensning. Heterogene RNA skabelon kan resultere i mere end ét sæt af signalet i sekventering gel profilering af primer forlængelse produkt, hvilket nogle gange gør det vanskeligt at fortolke ...

Selektiv 2'-hydroxyl acylation analyseret af primer forlængelse (form) er en metode til måling af kinetik af hver nukleotid i en RNA-sekvens af interesse og belyse sekundærstruktur på enkelt-nukleotid lÃ¸sning1. Figur metoder, både i in vitro betingelser2,3,4 (oprensede RNA i en defineret buffersystem) og i levende pattedyrceller5,6, er blevet udviklet for at undersøge sekundært struktur af medium længde RNA sekvenser (typisk < 1.000 nucleotider i celler form og < 200 nucleotider for in vitro-form). Det er især nyttig til at vurdere strukturelle ændringer i receptor RNA ved binding til RNA-interagere lille molekyle metabolitter2,4,7,8 og studere mekanistiske handlinger målretning af RNA molekyler under stof udvikling9,10.
RNA-targeting drug discovery har for nylig henledt opmærksomhed i akademiske laboratorier og medicinalindustrien11,12 via forskellige tilgange og strategier13,14,15 ,16. De seneste eksempler på målretning af RNA små molekyler til klinisk brug er to strukturelt forskellige eksperimentelle narkotika, LMI-07017 og RG-791618,19, for spinal muskelatrofi (SMA), som viste lovende resultater i fase II kliniske forsøg20. Begge molekyler blev demonstreret at målet overlevelse af motordrevne neuron (SMN) 2 pre-mRNA og regulere splejsning processen af SMN2 gen6,17,21. Vi viste tidligere anvendelse af in vitro og i celler form i en undersøgelse af mål RNA strukturelle ændringer i overværelse af en analog af RG-7916 kaldes SMN-C26.
I princippet måler figur 2'-OH acylation hastigheden på hver nukleotid i en RNA-sekvens i overværelse af overskydende beløb af en selvstændig quenching acylation reagens i en fordomsfri måde. Acylation reagens er ikke stabilt i vand, med en kort halveringstid på (f.eks. T1/2 = 17 s 1-methyl-7-nitroisatoic anhydrid; eller 1 M 7, ~ 20 min til 2-methylnicotinic acid imidazolide, eller NAI)22 og ufølsomhed over for identitet baser23. Dette resulterer i en mere gunstig acylation af 2'-OH-grupper af fleksible baser, som kan omdannes til en præcis vurdering af dynamikken i hver nukleotid. Specifikt, er et nukleotid i en basepar normalt mindre reaktivt end en uparret, til en 2 'er-OH modificerer reagens, såsom NAI og 1 M 7.
Ser man på kilden til skabelonen RNA og hvor 2'-OH acylation finder sted, kan figur generelt inddeles i in vitro og i celler form. I vitro form bruger renset T7 transskriberet RNA og mangler en cellulær kontekst, eksperimenterende design. I i celler form forekomme både RNA skabelon transskription og 2'-OH acylation i levende celler; Derfor kan resultaterne sammenfatte RNA strukturelle model i forbindelse med cellulære. I celle form er blevet henvist til som vivo form for FIGUREN i levende celler i litteratur24. Da dette eksperiment ikke er udført i et dyr, betegnes vi dette eksperiment som i celler form for nøjagtighed.
Strategier for den primer udvidelse fase af in vitro og i celler form er også forskellige. I in vitro form stopper reverse transkription ved 2'-OH acylation holdning i nærværelse af Mg2 +. Filtypenavnet 32P-mærket primer derfor vises som et band i polyacrylamid gelelektroforese (side) og intensiteten af bandet er proportional med acylation sats1. I i celler form, reverse transkription genererer tilfældige mutationer på 2'-OH addukt holdning i nærværelse af Mn2 +. Den mutationsmønstre sats af hver nukleotid kan blive fanget af i dybde næste generation sequencing, og figur reaktivitet med enkelt-nukleotid opløsning kan derefter beregnes.
Et potentielt problem for i celler form er det lavt signal / støj-forhold (dvs. et flertal af grupperne 2'-OH er uændret, mens de umodificerede sekvenser indtager de fleste af læse i næste generation sequencing). For nylig, en metode til at berige 2'-OH ændret RNA, nævnt som vivo Klik figur (icSHAPE), blev udviklet af Chang laboratorium25. Denne berigelse metode kan være fordelagtige i at studere svage små molekyler som RNA interaktion, især i en transkriptom-wide forhør.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>gBlock for &#62; 200 bp DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin gel and PCR clean-up kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaScript T7 transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1333</td>
			<td>Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TBE-urea sample buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow&#8482; Filter Unit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Safe dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 % TBE-urea mini-gel</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperscreen&#8482; Intensifying Screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1669</td>
			<td>calcium tungstate phosphor screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphor storage screen</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>BAS-IP MS 3543 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Typhoon</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAI (2M)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>03-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Contains 5X RT buffer, SuperScript IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddNTP set (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE27-2045-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>GD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Also contains RNase A and protease K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMN2 minigene34</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpLE</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca/ Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Also contains RW1, RPE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Contains DNase I and RDD buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>random nonamer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11904-018</td>
			<td>Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime pfx DNA polymerse</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12344024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucAway column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM10070</td>
			<td>for desalting purpose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes

I forbindelse med udvikling af lægemidler af RNA-targeting små molekyler ønskes belyse de strukturelle ændringer på deres interaktioner med target RNA sekvenser. Vi giver heri en detaljeret i in vitro og i celle selektiv 2'-hydroxyl acylation analyseret af primer forlængelse (SHAPE) protokol for at studere RNA strukturændringer i overværelse af en eksperimentel stof for spinal muskelatrofi (SMA), overlevelse motor neuron (SMN)-C2, og i pre-mRNA af gen, SMN2 exon 7. I in vitro-form, er en RNA-sekvens af 140 nukleotider indeholdende SMN2 exon 7 transskriberet af T7 RNA-polymerase, foldet i overværelse af SMN-C2 og efterfølgende ændret af en mild 2'-OH acylation reagens, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). Denne 2'-OH-NAI adduct er yderligere aftestede af et 32P-mærket primer extension og løst af polyacrylamid gelelektroforese (side). Omvendt, 2'-OH acylation i i celler form finder sted på stedet med SMN-C2 bundet cellulære RNA i levende celler. Pre-mRNA-sekvensen af exon 7 i SMN2 gen, sammen med figur-induceret mutationer i filtypenavnet primer blev derefter forstærkes ved PCR og næste generation sequencing. Sammenligner de to metoder, in vitro-form er en mere omkostningseffektiv metode og kræver ikke datakraft til at visualisere resultater. Dog, modellens in vitro form-afledte RNA undertiden afviger fra sekundærstruktur i cellulære sammenhæng, sandsynligvis på grund af tabet af alle interaktioner med RNA-bindende proteiner. I celle form behøver ikke et radioaktivt materiale arbejdspladsen og giver en mere nøjagtig RNA sekundær struktur i den trådløse forbindelse. Desuden, i celle figur er normalt gældende for en større vifte af RNA sekvenser (~ 1.000 nucleotider) ved at udnytte næste generations sekventering, i forhold til in vitro-forme (~ 200 nucleotider), som regel afhængig af SIDERS analyse. I tilfælde af exon 7 i SMN2 pre-mRNA, FIGUREN in vitro og i celle afledte er RNA modeller lig hinanden.

Vi viste tidligere at et RNA-splicing modulator, SMN-C2, interagerer med AGGAAG motiv på exon 7 af SMN2 gen pre-mRNA og brugt form for at vurdere RNA strukturelle ændringer i overværelse af SMN-C26. Bindingssted af SMN-C2 adskiller sig fra den FDA-godkendt antisense oligonukleotide (ASO) for SMA, nusinersen, som binder og blokerer intronic splejsning lyddæmperen (ISS) på intron 727,28 (<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Detaljerede protokoller for både in vitro og i celle selektiv 2'-hydroxyl acylation analyseret af primer forlængelse (SHAPE) forsøg at bestemme sekundær struktur af pre-mRNA sekvenser af interesse i overværelse af et RNA-targeting lille molekyle er præsenteret i denne artikel.

Ved hjælp af in Vitro og i celler form at undersøge lille molekyle induceret Pre-mRNA strukturelle ændringer

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Denne video vil give detaljerede protokoller for in vitro form eksperimenter til at bestemme den sekundære struktur af RNA sekvenser af interesse i tilstedeværelsen af et RNA rettet mod små molekyle. In vitro form er en omkostningseffektiv metode til at forstå dynamikken i hver nukleotid på en amino-størrelse RNA element, som normalt er mindre end 200 nukleotider. Efter udarbejdelsen af RNA-skabelonen som beskrevet i manuskriptet, radio label omvendt transskription primere ved at tilføje en gamma 32P ATP, vendt transskription primer.10XPNK-reaktionsbuffer, polynukleotidkinase og RNA's frie vand i et 1,7 milliliter mikrocentrifugerør i et samlet volumen på 20 mikroliter. Derefter inkuberes ved 37 grader Celsius i en time. Du aktiverer derefter prøverne i 20 minutter siden 65 grader Celsius og derefter filtrere prøverne i en afsaltning kolonne og centrifuge på 1000 gange G.Add 25 mikroliter af 2XTBE urea prøve buffer og mix.Sænk disse mærkede produkter i en 10% acrylamid gel og sørg for at undgå at bløde radioaktiviteten i de øverste reservoirer. Kør gelen ved 20 watt i en time. Efter kørslen fjernes glaspladerne på gelkassetten.Læg gelen på stykke plastfolie. Fold plast på toppen af gelen for at lave en lufttæt sandwich. Placer gel sandwich på en calcium-tungstate fosfor skærm og eksponere med en fantasi instrument.Billede gelen igen med almindeligt lys for at vide, hvor kanterne af gelen er. Brug en billedbehandlingssoftware til at overlejre de to billeder og overlejre de lyse og mørke billeder. Gør derefter det øverste billede lidt uigennemsigtigt for at se begge billeder samtidigt.Sørg for, at det udskrevne billede har samme størrelse som den faktiske gel. Juster derefter gelen på det udskrevne billede. Endelig skal du bruge et steriliseret barberblad til at skære de ønskede bøjninger ud af gelen og placere hvert stykke gel i et separat 1,7 milliliter mikrocentrifugerør.For at inddrive DNA fra gel skiven ved passiv eluering, tilsæt 0,3 milliliter elueringsblanding til hver 1,7 milliliter rør. Inkuber rørene i en radioaktivt sikker beholder på en rotator ved fire grader Celsius i 16 timer. Efter inkubation overføres væsken til et nyt 1,7 milliliterrør.Tilsæt 2,5 x iskold 200 bevis ethanol og invertere rørene seks gange for at blande væsken. Inkuber rørene ved minus 80 grader Celsius i mindst en time. Efter centrifugering ved 10, 000g og fire grader Celsius i 10 minutter, fjern supernatant omhyggeligt ved pipettering.Tilsæt en milliliter 80% ethanol til at vaske pellet. Vortex i 15 sekunder og centrifuge igen under de samme betingelser. Efter fjernelse af supernatant ved pipettering, lufttørre DNA-pellet i fem minutter.Tilsæt 50 mikroliter af RNA's frie vand og bland ved pipettering op og ned 10 gange. Normalisere DNA-koncentrationen til omkring 100, 000 tæller per minut pr microliter i en scintillation tæller. For at forberede fire prøver til kemisk modifikation, tilsættes otte picomoler RNA i 32 mikroliter af 0,5 XTE buffer til et 1,7 milliliter mikrocentrifugerør.Varm ved 80 grader Celsius i to minutter og snap køligt på is i mindst et minut. Derefter tilsættes otte mikroliter af 5x foldemix, bland en allokere ni mikroliter af denne RNA-blanding i hver af de fire PCR-rør, mærket fra en til fire. Der tilsættes en mikroliter på 10% DMSO i røret markeret som en, en mikroliter koncentreret lille molekyleopløsning i rør to, en mikroliter for fortyndet lille molekyleopløsning i rør tre og en mikroliter vand i rør fire.Inkuber alle PCR-rør ved 37 grader Celsius i en termisk cycler i 30 minutter. Umiddelbart før den to primære OH modifikation reaktion, fortyndes en mikroliter af to molar NAI lager opløsning i tre mikroliter AF DEPC-behandlet vand til at give en 0,5 molar arbejdsløsning. Umiddelbart tilføje en mikroliter af denne løsning i rør et, to og tre.Tilsæt en mikroliter på 25% DMSO i rør fire og inkuberes i en termisk cycler ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Forbered fire friske 1,7 milliliter mikrocentrifuge rør og tilsæt 100 mikroliter af elueringsblanding og to mikroliter af glykogen til hvert rør. Derefter i hver af disse rør overføre al væsken fra de tilsvarende PCR rør.Tilsæt 0,34 milliliter iskold 200 bevis ethanol i hvert rør og bland ved vortexing i fem sekunder. Placer rørene i en minus 80 grader Celsius fryser i mindst en time. Derefter centrifuge rørene i 15 minutter ved 14, 000 gange G ved fire grader Celsius.Fjern supernatanten fra hvert rør uden at forstyrre RNA-pelletet. Tilsæt 0,5 milliliter 80% ethanol pr. rør for at vaske RNA-pellet og vortex i 15 sekunder. Efter centrifugering på samme betingelser igen, fjerne supernatant og lufttørre RNA pellet i fem minutter.Tilføj ni mikroliter af RNA's frie vand og rør, der op og ned 10 gange for at blande. Overfør det modificerede RNA i fire nye PCR-rør, og mærg dem en til fire som i det foregående trin. Tilføj to picomoles af RNA i syv mikroliter AF DEPC-behandlet vand til hver af fire ekstra PCR-rør og mærke dem med nummer fem til otte.Tilføj to mikroliter af den genvundne radioaktivt mærkede primer til hver af de otte PCR-rør markeret en til otte. Efter opvarmning ved 65 grader Celsius i fem minutter, straks afkøles til fire grader Celsius i den termiske cycler. Der tilsættes fire mikroliter 5x RT-buffer, en mikroliter på 0,1 molar DTT og en mikroliter DNTP-blanding til hvert af rørene.Derefter tilsættes to mikroliter AFPC-behandlet vand til rør et til fire. Der tilsættes fire mikroliter på fem millimolar ddATP til rør fem, fire mikroliter på fem millimolar ddTTP til rør seks og fire mikroliter på fem millimolar ddCTP til rør syv og en mikroliter på fem millimolar ddGTP og tre mikroliter DEPC-behandlet vand til rør otte og pipette fire gange for at blande. Efter opvarmning af alle PCR rør ved 52 grader Celsius i et minut i en termisk cycler, tilsæt en microliter af omvendt transkriptase til hvert rør og rør det op og ned fire gange for at blande.Inkuber reaktionerne ved 52 grader Celsius i 20 minutter i den termiske cycler. For at hydrolysere RNA'et tilsættes en mikroliter af fem molarnatriumhydroxid i hvert af rørene og opvarmes ved 95 grader Celsius i fem minutter. Derefter tilsættes fem mikroliter af en molære saltsyre til at neutralisere reaktionen og gentage ethanol nedbør som tidligere beskrevet.Efter lufttørring af DNA-pellet i fem minutter tilsættes 10 mikroliter vand og 10 mikroliter af 2xTBE urea prøvebelastningsbuffer i 1,7 milliliterrør og rør den op og ned 10 gange for at gensolive. Varm prøverne ved 70 grader Celsius i fem minutter, og placer derefter rørene på is, før de læsses på gelen. Der indlæses 10 mikroliter af prøven, som er placeret på is, på 8% polyarylamidsekventeringsgel.Kør gelen ved 65 watt i to timer, eller indtil det nederste farvestof når 3/4ths af gelen. Fjern afstandsfraen og sæt forsigtigt en spatel ind for at fjerne den øverste silikonerede glasplade. Dæk gelen med et stykke stort filterpapir, og tryk forsigtigt på, så gelen kan klæbe til filterpapiret.Løft filterpapiret fra den nederste ende, og fjern gelen fra glaspladen sammen med papiret. Efter overførsel af gelen til et indpakningspapir som tidligere gjort, tør den ved 70 grader Celsius i en time med et vakuum, og sørg for at bruge flere filterpapir mellem gelen og tørretumbleren. Overfør gelsandwichen på en fotobleget fosforlagringsskærmkassette, og udsæt gelens radioaktivitet på skærmen i fire til 16 timer.Endelig skal fosforlagringsskærmen sættes på en billedbehandlingsenhed og scannes med mellemopløsning i ca. 30 minutter. Efter at have udsat polyarylamid sekventering gel til fosfor opbevaring skærmen, en vellykket form eksperiment viste en enkelt og mest intense bøje i toppen af gelen og bøjninger i hele gelen ved enkelt nukleotid opløsning uden smøre. Gelen viste også, at intensiteten af nogle bøjninger ændret sig i overværelse af små molekyler, hvilket indikerer ændringer af base parringsstyrke.Et almindeligt problem i sideanalyse er, at en smæderegion kendt som saltfronten kan forekomme midt i gelen, sandsynligvis på grund af høj koncentration af salt, DMSO eller andet uønsket stof i belastningsprøven. Det kan undgås ved at fjerne det uønskede stof ved ethanolfældning. En homogen RNA-skabelon er at foretrække for in vitro form.Vi bruger ribosomer i både fem prime og tre prime ender for at opnå et sådant RNA. In-celle form kan også udføres for at opnå RNA sekundær struktur i den cellulære sammenhæng. Husk, in vitro form kan ikke opsummere in vivo RNA bindende protein interaktioner.In vitro form er en kraftfuld metode til at opdage ændringer i RNA struktur på grund af tilstedeværelsen af et lille molekyle. Dette gøres ved at kvantificere ændringer i mønsterstyrken af omvendt transskription stopper. Vær forsigtig med, at alle eksperimenter, der er beskrevet i denne video, udføres på en autoriseret radioaktiv arbejdsplads med passende personlig beskyttelse og plexiglas afskærmning.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Tilfældig mutagenese ved anvendelse histon-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analyse af partikler i luften-induceret kromosomafvigelser Brug af en<em&gt; In vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescens Assay at karakterisere døgnrytme i Brystkirtlerne epitelceller

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Real-time analyse af transskription faktor bindende, transskription, Translation og omsætning skal vises Global begivenheder under aktivering af cellulære

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

En Optogenetic metode til at styre og analysere gen Expression mønstre i celle-til-celle interaktioner

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enkelt molekyle fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyser i spirende gær vegetativ vækst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissektion af Enhancer funktion ved hjælp af Multiplex CRISPR-baserede forstærker interferens i cellelinjer

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse af Alternative Pre-mRNA-Splicing i mus hjernen sektioner ved hjælp af RNA In Situ hybridisering Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...