Name: using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes
Uploaded: 2019-01-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Dit werk werd mogelijk gemaakt door de NIH R01 grant (NS094721, K.A.J.).

1. in Vitro vorm
Opmerking: Het protocol is uit de gepubliceerde protocol1gewijzigd.
<ol><li>Voorbereiding van de RNA-sjabloon Opmerking: De sjabloon voor de Transcriptie T7 verstaat als een synthetische double-stranded DNA (dsDNA) en versterkt door beide opneming in een vector van E. coli die een uniek paar EcoRI/BamHI beperking endonuclease sites, zoals pET28a, of door PCR draagt. Het protocol voor PCR v...

<ol>
	<li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+Quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>Trausch, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+diversity+in+the+SAM+clan+of+riboswitches.">Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).</li><li>Souliere, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+a+riboswitch+response+through+structural+extension+of+a+pseudoknot.">Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).</li><li>Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+Analysis+of+Small+RNAs+and+Riboswitches.">SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches.</a> Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+SHAPE+analysis+in+living+cells.">RNA SHAPE analysis in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).</li><li>Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+a+small-molecule+modulator+of+SMN2+splicing.">Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).</li><li>Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mn+2++-Sensing+Mechanisms+of+yybP-ykoY+Orphan+Riboswitches.">Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches.</a> Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).</li><li>Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+contacts+control+switching+of+the+SAM-I+riboswitch.">Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch.</a> Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).</li><li>Abulwerdi, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Small+Molecules+with+a+Noncanonical+Binding+Mode+to+HIV-1+Trans+Activation+Response+(TAR)+RNA.">Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).</li><li>Shortridge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrocyclic+Peptide+Ligand+Binds+the+Oncogenic+MicroRNA-21+Precursor+and+Suppresses+Dicer+Processing.">A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).</li><li>Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+targeting+RNA+with+drug-like+small+molecules.">Principles for targeting RNA with drug-like small molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+against+RNA+targets+attract+big+backers.">Small molecules against RNA targets attract big backers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).</li><li>Shortridge, M. D., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+based+approaches+for+targeting+non-coding+RNAs+with+small+molecules.">Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules.</a> Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).</li><li>Gallego, J., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RNA+with+Small-Molecule+Drugs:+Therapeutic+Promise+and+Chemical+Challenges.">Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).</li><li>Rizvi, N. F., Smith, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+small+molecule+druggable+target.">RNA as a small molecule druggable target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).</li><li>Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Role+of+RNA+as+a+Therapeutic+Target+for+Small+Molecules.">The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules.</a> Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).</li><li>Palacino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splice+modulators+enhance+U1-pre-mRNA+association+and+rescue+SMA+mice.">SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice.</a> Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).</li><li>Ratni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Risdiplam,+a+Selective+Survival+of+Motor+Neuron-2+(+SMN2+)+Gene+Splicing+Modifier+for+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy+(SMA).">Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA).</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).</li><li>Naryshkin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splicing+modifiers+improve+motor+function+and+longevity+in+mice+with+spinal+muscular+atrophy.">SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy.</a> Science. 345, (2014).</li><li>Chiriboga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+Evidence+for+Pharmacodynamics+Effects+of+RG7916+in+JEWELFISH,+a+Study+in+Patients+with+Spinal+Muscular+Atrophy+who+Previously+Participated+in+a+Study+with+Another+SMN2-Splicing+Targeting+Therapy+(S46.003).">Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003).</a> Neurology. 90, (2018).</li><li>Sivaramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+SMN2+pre-mRNA-protein+complex+elicits+specificity+for+small+molecule+splicing+modifiers.">Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SHAPE+reagents+for+mapping+RNA+structures+inside+living+cells.">Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells.</a> RNA. 23, 169-174 (2017).</li><li>Weeks, K. M., Mauger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+Structural+Codes+with+SHAPE+Chemistry.">Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).</li><li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+reveals+transcript-wide+interactions+,+complex+structural+domains+,+and+protein+interactions+across+the+Xist+lncRNA+in+living+cells.">SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).</li><li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+&#8242;+-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP)+for+direct+,+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis.">Selective 2 &#8242; -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes &amp; Development. 24, 1634-1644 (2010).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li><li>Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+SR+proteins+improves+SMN+expression+in+spinal+muscular+atrophy+cells.">Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells.</a> PloS One. 9, e115205 (2014).</li><li>Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+functional+implications+of+the+3D+architectures+of+viral+tRNA-like+structures.">Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures.</a> RNA. 15, 294-307 (2009).</li><li>Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+role+of+RNA+structure+in+alternative+splicing+of+a+critical+exon+in+the+spinal+muscular+atrophy+genes.">Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes.</a> Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).</li><li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy.">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).</li><li>Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+motif+discovery+by+SHAPE+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP).">RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP).</a> Nature Methods. 11, 959 (2014).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+Footprinting+to+Map+Sites+of+RNA-Protein+Interactions.">RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).</li><li>Velagapudi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+small+molecule+against+an+oncogenic+noncoding+RNA.">Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).</li><li>Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+NMR+to+structure+determination+of+RNAs+large+and+small.">Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).</li><li>Scott, L. G., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+determination+by+NMR.">RNA structure determination by NMR.</a> Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).</li></ol>

In in vitro vorm is het cruciaal voor hoge kwaliteit homogene RNA sjabloon gebruiken. Transcriptie T7, levert echter vaak heterogene sequenties36. Vooral zijn sequenties met ±1 nucleotide in de 3'-terminus met niet te verwaarlozen opbrengsten36 meestal moeilijk te worden verwijderd door polyacrylamidegel zuivering. Heterogene RNA sjabloon kan resulteren in meer dan één set van het signaal in de sequencing gel profilering van de primer extensie product, waardoor het soms ...

Selectieve 2'-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie (SHAPE) is een methode voor het meten van de kinetiek van elk nucleotide in een opeenvolging van RNA van belang en het ophelderen van de secundaire structuur op single-nucleotide oplossing1. SHAPE methodologieën, zowel in in vitro voorwaarden2,3,4 (gezuiverde RNA in een gedefinieerde buffersysteem) en in levende cellen van zoogdieren5,6, hebben ontwikkeld om te onderzoeken van de secundaire structuur van halflang RNA-sequenties (meestal < 1000 nucleotiden in cel vorm en < 200 nucleotiden voor in vitro vorm). Het is met name handig om structurele veranderingen in de receptor RNA bij binding met RNA-interactie klein molecuul metabolieten2,4,7,8 en te bestuderen of mechanistische acties van RNA-targeting moleculen tijdens9,10van de ontwikkeling van de drug.
RNA-targeting drugontdekking heeft onlangs aandacht in academische laboratoria en de farmaceutische industrie11,12 getrokken via verschillende benaderingen en strategieën13,14,15 ,16. Recente voorbeelden van kleine moleculen RNA-targeting voor klinisch gebruik twee structureel verschillende experimentele drugs, LMI-07017 en RG-791618,19, voor spinale musculaire atrofie (SMA), waaruit veelbelovend blijkt resultaten in fase II klinische proeven20. Beide moleculen werden aangetoond voor doel voortbestaan van motor neuron (SMN) 2 pre-mRNA en reguleren de splicing proces van de SMN2 gen6,17,21. Wij eerder blijk gegeven van de toepassing van in vitro en in cel vorm in een onderzoek naar de structurele veranderingen van de target RNA in het bijzijn van een analoge van RG-7916 SMN-C26genoemd.
In principe meet vorm de 2'-OH acylering snelheid van elk nucleotide van een opeenvolging van RNA in aanwezigheid van overtollige hoeveelheden een zelf blussen acylering reagens op onpartijdige wijze. Het reagens acylering is niet stabiel in water, met een korte halfwaardetijd van (bv T1/2 = 17 s voor 1-methyl-7-nitroisatoic zwavelzuuranhydride; of 1 M 7, ~ 20 min. voor het 2-methylnicotinic zuur imidazolide, of INR)22 en ongevoeligheid voor de identiteit van de honken kwamen23. Dit resulteert in een gunstiger acylering van de 2'-OH-groepen van flexibele grondslagen, die kunnen worden omgezet in een nauwkeurige beoordeling van de dynamiek van elk nucleotide. Specifiek, is een nucleotide in een base-paar meestal minder reactief dan een ongepaard die een 2'-OH wijzigen reagens, zoals NAI en 1 M 7.
Als we kijken naar de bron van de RNA-sjabloon en waar 2'-OH acylering plaatsvindt, kan vorm over het algemeen worden onderverdeeld in in vitro en in cel vorm. In vitro vorm gebruik gezuiverde T7 Getranscribeerd RNA en mist een cellulaire context in experimentele designs. In cel vorm plaatsvinden zowel het RNA sjabloon transcriptie en 2'-OH acylering in levende cellen; de resultaten kunnen daarom het structurele model van RNA in een cellulaire context recapituleren. In cel vorm heeft voorgelegd aan zoals in vivo vorm voor de vorm in levende cellen in de literatuur24vervoerd. Aangezien dit experiment wordt niet uitgevoerd in een dier, wij dit experiment genoemd als in cel vorm voor nauwkeurigheid.
De strategieën voor de fase van de uitbreiding primer van in vitro en in cel vorm zijn ook verschillend. In de vorm van het in vitro stopt omgekeerde transcriptie op de 2'-OH acylering positie in aanwezigheid van Mg2 +. Extensie primer 32P-labelled daarom verschijnt als een band in polyacrylamide gelelektroforese (pagina), en de intensiteit van de band is evenredig aan de acylering tarief1. In cel vorm, omgekeerde transcriptie genereert willekeurige mutaties op de 2'-OH adduct positie in aanwezigheid van Mn2 +. Het vogelgriepvirus tarief van elk nucleotide kan worden onderschept door in het rangschikken van de volgende generatie van diepte en de reactiviteit van de SHAPE op single-nucleotide resolutie kan vervolgens worden berekend.
Een potentieel probleem voor in cel vorm is de lage signal-to-noise verhouding (dat wil zeggen, een meerderheid van de fracties 2'-OH is ongewijzigd, terwijl de ongewijzigde sequenties allermeest naar de lezen in de volgende-generatie sequencing bezetten). Onlangs, een methode om te verrijken de 2'-OH gemodificeerde RNA, bedoelde zoals in vivo klikt u op SHAPE (icSHAPE), werd ontwikkeld door de Chang laboratorium25. Deze verrijking methode kan nuttig zijn bij het bestuderen van zwakke kleine molecules zoals RNA interacties, vooral in een transcriptome bestrijkende ondervraging.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>gBlock for &#62; 200 bp DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin gel and PCR clean-up kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaScript T7 transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1333</td>
			<td>Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TBE-urea sample buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow&#8482; Filter Unit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Safe dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 % TBE-urea mini-gel</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperscreen&#8482; Intensifying Screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1669</td>
			<td>calcium tungstate phosphor screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphor storage screen</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>BAS-IP MS 3543 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Typhoon</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAI (2M)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>03-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Contains 5X RT buffer, SuperScript IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddNTP set (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE27-2045-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>GD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Also contains RNase A and protease K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMN2 minigene34</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpLE</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca/ Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Also contains RW1, RPE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Contains DNase I and RDD buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>random nonamer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11904-018</td>
			<td>Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime pfx DNA polymerse</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12344024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucAway column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM10070</td>
			<td>for desalting purpose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes

In het proces van de ontwikkeling van de drug van kleine moleculen RNA-targeting, is ophelderen van de structurele veranderingen op hun interacties met doel RNA-sequenties gewenst. Wij leveren hierin een gedetailleerde in vitro en in cel selectieve 2'-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie (SHAPE) protocol om te bestuderen van de structurele veranderingen van RNA in het bijzijn van een experimentele drug voor spinale musculaire atrofie (SMA), voortbestaan van motor neuron (SMN)-C2, inzonderheid exon 7 van de pre-mRNA van het gen SMN2. In in vitro vorm, is een RNA-volgorde van 140 nucleotiden met SMN2 exon 7 getranscribeerd door T7 RNA polymerase, gevouwen in aanwezigheid van SMN-C2 en vervolgens bewerkt door een milde 2'-OH acylering reagens, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). Deze 2'-OH-INR adduct is verder peilden door een 32P-geëtiketteerden primer extensie en opgelost door polyacrylamide gelelektroforese (pagina). Omgekeerd, 2'-OH acylering in in cel vorm plaatsvindt in situ met SMN-C2 gebonden cellulaire RNA in levende cellen. De volgorde van de pre-mRNA van exon 7 in het SMN2-gen, samen met SHAPE-geïnduceerde mutaties in de primer-extensie, werd vervolgens versterkt door PCR en onder voorbehoud van de volgende generatie sequencing. Vergelijken van de twee methoden, in vitro vorm is van een meer voordelige methode en vereist geen rekenkracht te visualiseren van de resultaten. De in vitro model van de SHAPE afkomstige RNA wijkt echter soms af van de secundaire structuur in een cellulaire context, waarschijnlijk als gevolg van het verlies van alle interacties met RNA-bindende proteÃ¯nen. In cel vorm hoeft niet een radioactief materiaal werkplek en levert een nauwkeuriger RNA secundaire structuur in de cellulaire context. Bovendien, in cel vorm meestal geldt voor een groter bereik van RNA-sequenties (~ 1000 nucleotiden) door gebruik te maken van volgende-generatie sequencing, in vergelijking met in vitro vorm (~ 200 nucleotiden) die gewoonlijk is gebaseerd op pagina-analyse. In het geval van exon 7 in SMN2 pre-mRNA, de vorm van in vitro en in cel afgeleid zijn RNA modellen op elkaar lijken.

Wij eerder bewezen dat een RNA splicing modulator, SMN-C2, samenwerkt met AGGAAG motief op exon 7 van het SMN2 gen van pre-mRNA en SHAPE gebruikt ter beoordeling van de structurele veranderingen van RNA in het bijzijn van SMN-C26. De bindende site van SMN-C2 is verschillend van de FDA-goedgekeurde antisense oligonucleotide (ASO) voor SMA, nusinersen, die bindt en blokkeert de intronic splicing silencer (ISS) op intron 727,<sup cla...

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Er zijn gedetailleerde protocollen voor beide in vitro en in cel selectieve 2'-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie (SHAPE) experimenten om de secundaire structuur van pre-mRNA opeenvolgingen van belang in de aanwezigheid van een kleine molecule van RNA-targeting in dit artikel wordt gepresenteerd.

Met behulp van In Vitro en In cel vorm te onderzoeken klein molecuul veroorzaakte structurele veranderingen van de Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Deze video zal gedetailleerde protocollen voor in vitro vorm experimenten om de secundaire structuur van RNA sequenties van belang in de aanwezigheid van een RNA gericht op kleine molecuul te bepalen. In vitro vorm is een kosteneffectieve methode om de dynamiek van elke nucleotide te begrijpen op een amino-sized RNA element dat meestal minder dan 200 nucleotiden. Na het voorbereiden van de RNA-sjabloon zoals beschreven in het manuscript, radio label reverse transcriptie primers door het toevoegen van een gamma 32P ATP, omgekeerde transcriptie primer.10XPNK reactiebuffer, polynucleotide kinase en RNA's gratis water in een 1,7 milliliter microcentrifugebuis in een totaal volume van 20 microliter. Dan broeden op 37 graden Celsius voor een uur. Vervolgens activeert u de monsters gedurende 20 minuten sinds 65 graden Celsius en filtert u de monsters vervolgens in een ontziltingskolom en centrifuge bij 1000 keer G.Voeg 25 microliters 2XTBE ureum monsterbuffer en mix toe.Verlaag deze gelabelde producten in een 10%acrylamide gel en zorg ervoor dat u het bloeden van de radioactiviteit in de bovenste reservoirs. Voer de gel op 20 watt voor een uur. Verwijder na de run de glasplaten van de gelcassette.Leg de gel op het stuk plastic folie. Vouw het plastic op de bovenkant van de gel om een luchtdichte sandwich te maken. Leg de gel sandwich op een calcium-tungstate fosfor scherm en bloot met een verbeeldend instrument.Beeld de gel opnieuw met regelmatig licht om te weten waar de randen van de gel zijn. Gebruik een software voor beeldverwerking om de twee afbeeldingen te bedekken en de lichte en donkere afbeeldingen te bedekken. Maak vervolgens het bovenste beeld enigszins ondoorzichtig om beide beelden tegelijkertijd te zien.Zorg ervoor dat de afgedrukte afbeelding dezelfde grootte heeft als de werkelijke gel. Vervolgens lijnt u de gel op de afgedrukte afbeelding uit. Gebruik ten slotte een gesteriliseerd scheermesje om de gewenste bochten uit de gel te snijden en plaats elk stuk gel in een aparte 1,7 milliliter microcentrifugebuis.Om het DNA te herstellen van de gel slice door passieve elutie, voeg 0,3 milliliter elution neerslag mix aan elke 1,7 milliliter buis. Broed de buizen in een radioactief-veilige container op een rotator op vier graden Celsius gedurende 16 uur. Breng de vloeistof na incubatie in een nieuwe buis van 1,7 milliliter.Voeg 2,5x ijskoude 200 proof ethanol toe en keer de buizen zes keer om om de vloeistof te mengen. Broed de buizen op min 80 graden Celsius voor een minimum van een uur. Na het centrifugeren op 10, 000g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten, verwijder de supernatant zorgvuldig door pipetteren.Voeg een milliliter van 80% ethanol toe om de pellet te wassen. Vortex gedurende 15 seconden en centrifuge opnieuw onder dezelfde omstandigheden. Na het verwijderen van de supernatant door pipetting, lucht-droog de DNA-pellet gedurende vijf minuten.Voeg 50 microliter gratis water van RNA toe en meng door 10 keer op en neer te pipetten. Normaliseer de DNA-concentratie tot ongeveer 100.000 tellingen per minuut per microliter in een scintillatieteller. Om vier monsters voor te bereiden op chemische modificatie, voeg acht picomoles RNA in 32 microliter van 0,5 XTE buffer toe aan een 1,7 milliliter microcentrifuge buis.Verwarm op 80 graden Celsius gedurende twee minuten en snap koel op ijs voor ten minste een minuut. Voeg vervolgens acht microliters van 5x vouwmix, meng een toewijzen van negen microliters van dit RNA mengsel in elk van de vier PCR buizen, gelabeld van een tot vier. Voeg een microliter van 10% DMSO in de buis gemarkeerd als een, een microliter van geconcentreerde kleine molecuul oplossing in buis twee, een microliter van verdunde kleine molecuul oplossing in buis drie en een microliter van water in buis vier.Incubeer alle PCR-buizen bij 37 graden Celsius in een thermische cycler gedurende 30 minuten. Direct voor de twee eerste OH modificatiereactie verdun je een microliter van twee molaire NAI-voorraadoplossing in drie microliters met DEPC-behandeld water om een 0,5-molaire werkoplossing op te leveren. Voeg onmiddellijk een microliter van deze oplossing in buizen een, twee en drie.Voeg een microliter van 25%DMSO in buis vier en incubeer in een thermische cycler op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Bereid vier verse 1,7 milliliter microcentrifugebuizen en voeg 100 microliters elution neerslag mix en twee microliter glycogeen aan elke buis. Vervolgens in elk van deze buizen overdracht van alle vloeistof uit de bijbehorende PCR buizen.Voeg 0,34 milliliter ijskoude 200-proof ethanol in elke buis en meng door vijf seconden te vortexen. Plaats de buizen in een min 80 graden Celsius vriezer voor ten minste een uur. Dan centrifugeren de buizen gedurende 15 minuten op 14.000 keer G op vier graden Celsius.Zonder de RNA-pellet te storen, verwijder je de supernatant van elke buis. Voeg 0,5 milliliter van 80% ethanol per buis toe om de RNA-pellet en vortex gedurende 15 seconden te wassen. Na het centrifugeren onder dezelfde omstandigheden opnieuw, verwijder de supernatant en luchtdroog de RNA pellet gedurende vijf minuten.Voeg negen microliter van gratis water RNA's en pijp die op en neer 10 keer te mengen. Breng het gemodificeerde RNA over in vier nieuwe PCR-buizen en label ze één tot vier zoals in de vorige stap. Voeg twee picomolen RNA in zeven microliters van DEPC-behandeld water toe aan elk van de vier extra PCR-buizen en label ze met nummers vijf tot acht.Voeg twee microliters van de teruggewonnen radiogelabelde primer toe aan elk van de acht PCR-buizen die één tot acht zijn gemarkeerd. Na vijf minuten verwarmen bij 65 graden Celsius, koel dan onmiddellijk af tot vier graden Celsius in de thermische fietser. Voeg vier microliters van 5x RT buffer, een microliter van 0,1 molaire DTT en een microliter van DNTP mix aan elk van de buizen.Voeg vervolgens twee microliters van DEPC-behandeld water toe aan buizen van één tot vier. Voeg vier microliter van vijf millimolar ddATP toe aan buis vijf, vier microliters van vijf millimolar ddTTP aan buis zes en vier microliter van vijf millimolar ddCTP aan buis zeven en een microliter van vijf millimolar ddGTP en drie microliter desPC-behandeld water aan buis acht en pipet vier keer te mengen. Na het verwarmen van alle PCR buizen op 52 graden Celsius voor een minuut in een thermische cycler, voeg een microliter van omgekeerde transcriptase aan elke buis en pijp het op en neer vier keer te mengen.Broed de reacties op 52 graden Celsius gedurende 20 minuten in de thermische cycler. Om het RNA te hydrolyseren, voeg een microliter van vijf molaire natriumhydroxide toe aan elk van de buizen en verwarm ze vijf minuten lang bij 95 graden Celsius. Voeg vervolgens vijf microliters van één molair zoutzuur toe om de reactie te neutraliseren en de ethanolneerslag te herhalen zoals eerder beschreven.Voeg na het drogen van de DNA-pellet gedurende vijf minuten 10 microliter water en 10 microliter 2xTBE ureum monster laadbuffer toe in 1,7 milliliter buizen en pijp het 10 keer op en neer om te herdooien. Verwarm de monsters op 70 graden Celsius gedurende vijf minuten, dan plaats de buizen op ijs, alvorens te laden op de gel. Laad 10 microliter van het monster dat op ijs is geplaatst op 8%polyacrylamide sequencing gel.Voer de gel op 65 watt gedurende twee uur of totdat de bodem kleurstof bereikt de 3/4ths van de gel. Verwijder de afstandsaar en steek voorzichtig een spatel in om de bovenste siliconen glasplaat te verwijderen. Bedek de gel met een stuk groot filterpapier en druk voorzichtig op om de gel aan het filterpapier te laten hechten.Begin vanaf de onderkant, til het filterpapier en verwijder de gel van de glasplaat samen met het papier. Na het overbrengen van de gel naar een inpakpapier zoals eerder gedaan, droog het op 70 graden Celsius voor een uur met een vacuüm, zorg ervoor dat verschillende filterpapieren tussen de gel en de droger te gebruiken. Breng de gel sandwich op een foto-gebleekte fosfor opslag scherm cassette en bloot de radioactiviteit van de gel op het scherm voor vier tot 16 uur.Plaats ten slotte het fosforopslagscherm op een beeldverwerkingsapparaat en scan ongeveer 30 minuten met een gemiddelde resolutie. Na het blootstellen van polyacrylamide sequencing gel aan de fosfor opslag scherm, een succesvolle vorm experiment toonde een enkele en meest intense bocht aan de bovenkant van de gel en bochten in de gel op enkele nucleotide resolutie zonder uitstrijkje. De gel toonde ook aan dat de intensiteit van sommige bochten veranderde in de aanwezigheid van kleine moleculen, wat wijst op veranderingen van de basiskoppelsterkte.Een veel voorkomend probleem in de pagina-analyse is dat een uitstrijkje gebied bekend als de zout front kan verschijnen in het midden van de gel, waarschijnlijk te wijten aan een hoge concentratie van zout, DMSO of andere ongewenste stof in het laden monster. Dat kan worden vermeden door het verwijderen van de ongewenste stof door ethanol neerslag. Een homogene RNA-sjabloon heeft de voorkeur voor in vitro vorm.We gebruiken ribosomen op zowel vijf prime als drie prime ends om zo'n RNA te verkrijgen. In-cell vorm kan ook worden uitgevoerd om RNA secundaire structuur te verkrijgen in de cellulaire context. Vergeet niet dat in vitro vorm niet kan recapituleren in vivo RNA bindende eiwit interacties.In vitro vorm is een krachtige methode voor het detecteren van veranderingen in RNA structuur als gevolg van de aanwezigheid van een klein molecuul. Dit wordt gedaan door veranderingen in de patroonsterkte van omgekeerde transcriptase stops te kwantificeren. Wees voorzichtig dat alle experimenten beschreven in deze video worden uitgevoerd in een geautoriseerde radioactieve werkplek met de juiste persoonlijke bescherming en plexiglas afscherming.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetische willekeurige mutagenese met behulp van histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analyse van de Ambient Particulate Matter-geïnduceerde chromosomale afwijkingen met behulp van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Systeem

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescentie Assay te karakteriseren Circadian Rhythm in borstklier epitheliale cellen

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Een Optogenetic methode te controleren en analyseren van gen expressiepatronen in cel-naar-cel interacties

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (smFISH) analyse in Budding vegetatieve groei van gist en meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissectie van Enhancer functie met behulp van Multiplex CRISPR gebaseerde Enhancer inmenging in cellijnen

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...