Name: using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes
Uploaded: 2019-01-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Ce travail a été rendu possible par l’octroi de NIH R01 (NS094721, K.A.J.).

1. in Vitro forme
Remarque : Le protocole est modifié par le protocole publié1.
<ol><li>Préparer le descripteur d’ARN Remarque : Le modèle pour la transcription T7 a été condamné comme une synthèse ADN à double brin (dsDNA) et amplifié par une insertion dans un vecteur d’e. coli qui porte une paire unique de sites de l’endonucléase de restriction EcoRI/BamHI, tels que pET28a, ou par PCR....

<ol>
	<li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+Quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>Trausch, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+diversity+in+the+SAM+clan+of+riboswitches.">Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).</li><li>Souliere, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+a+riboswitch+response+through+structural+extension+of+a+pseudoknot.">Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).</li><li>Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+Analysis+of+Small+RNAs+and+Riboswitches.">SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches.</a> Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+SHAPE+analysis+in+living+cells.">RNA SHAPE analysis in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).</li><li>Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+a+small-molecule+modulator+of+SMN2+splicing.">Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).</li><li>Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mn+2++-Sensing+Mechanisms+of+yybP-ykoY+Orphan+Riboswitches.">Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches.</a> Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).</li><li>Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+contacts+control+switching+of+the+SAM-I+riboswitch.">Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch.</a> Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).</li><li>Abulwerdi, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Small+Molecules+with+a+Noncanonical+Binding+Mode+to+HIV-1+Trans+Activation+Response+(TAR)+RNA.">Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).</li><li>Shortridge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrocyclic+Peptide+Ligand+Binds+the+Oncogenic+MicroRNA-21+Precursor+and+Suppresses+Dicer+Processing.">A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).</li><li>Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+targeting+RNA+with+drug-like+small+molecules.">Principles for targeting RNA with drug-like small molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+against+RNA+targets+attract+big+backers.">Small molecules against RNA targets attract big backers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).</li><li>Shortridge, M. D., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+based+approaches+for+targeting+non-coding+RNAs+with+small+molecules.">Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules.</a> Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).</li><li>Gallego, J., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RNA+with+Small-Molecule+Drugs:+Therapeutic+Promise+and+Chemical+Challenges.">Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).</li><li>Rizvi, N. F., Smith, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+small+molecule+druggable+target.">RNA as a small molecule druggable target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).</li><li>Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Role+of+RNA+as+a+Therapeutic+Target+for+Small+Molecules.">The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules.</a> Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).</li><li>Palacino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splice+modulators+enhance+U1-pre-mRNA+association+and+rescue+SMA+mice.">SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice.</a> Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).</li><li>Ratni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Risdiplam,+a+Selective+Survival+of+Motor+Neuron-2+(+SMN2+)+Gene+Splicing+Modifier+for+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy+(SMA).">Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA).</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).</li><li>Naryshkin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splicing+modifiers+improve+motor+function+and+longevity+in+mice+with+spinal+muscular+atrophy.">SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy.</a> Science. 345, (2014).</li><li>Chiriboga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+Evidence+for+Pharmacodynamics+Effects+of+RG7916+in+JEWELFISH,+a+Study+in+Patients+with+Spinal+Muscular+Atrophy+who+Previously+Participated+in+a+Study+with+Another+SMN2-Splicing+Targeting+Therapy+(S46.003).">Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003).</a> Neurology. 90, (2018).</li><li>Sivaramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+SMN2+pre-mRNA-protein+complex+elicits+specificity+for+small+molecule+splicing+modifiers.">Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SHAPE+reagents+for+mapping+RNA+structures+inside+living+cells.">Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells.</a> RNA. 23, 169-174 (2017).</li><li>Weeks, K. M., Mauger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+Structural+Codes+with+SHAPE+Chemistry.">Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).</li><li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+reveals+transcript-wide+interactions+,+complex+structural+domains+,+and+protein+interactions+across+the+Xist+lncRNA+in+living+cells.">SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).</li><li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+&#8242;+-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP)+for+direct+,+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis.">Selective 2 &#8242; -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes &amp; Development. 24, 1634-1644 (2010).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li><li>Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+SR+proteins+improves+SMN+expression+in+spinal+muscular+atrophy+cells.">Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells.</a> PloS One. 9, e115205 (2014).</li><li>Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+functional+implications+of+the+3D+architectures+of+viral+tRNA-like+structures.">Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures.</a> RNA. 15, 294-307 (2009).</li><li>Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+role+of+RNA+structure+in+alternative+splicing+of+a+critical+exon+in+the+spinal+muscular+atrophy+genes.">Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes.</a> Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).</li><li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy.">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).</li><li>Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+motif+discovery+by+SHAPE+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP).">RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP).</a> Nature Methods. 11, 959 (2014).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+Footprinting+to+Map+Sites+of+RNA-Protein+Interactions.">RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).</li><li>Velagapudi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+small+molecule+against+an+oncogenic+noncoding+RNA.">Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).</li><li>Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+NMR+to+structure+determination+of+RNAs+large+and+small.">Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).</li><li>Scott, L. G., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+determination+by+NMR.">RNA structure determination by NMR.</a> Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).</li></ol>

En forme in vitro, il est essentiel d’utiliser le descripteur d’ARN homogène de haute qualité. T7 transcription, cependant, donne souvent des séquences hétérogènes36. Surtout, séquences avec ±1 nucléotides à l’extrémité 3' avec des rendements non négligeable36 sont généralement difficiles à enlever par purification sur gel de polyacrylamide. Descripteur d’ARN hétérogène peut entraîner plus d’un jeu du signal dans le profilage de gel de séquen?...

Acylation sélective 2'-hydroxyle analysée par extension d’amorce (SHAPE) est une méthode de mesure de la cinétique de chaque nucléotide dans une séquence d’ARN d’intérêt et élucider la structure secondaire à mononucléotidiques résolution1. Méthodologies de forme, tant en conditions in vitro2,3,4 (l’ARN purifié dans un système tampon définie) et dans la vie des cellules de mammifères5,6, ont été développées afin d’étudier l’enseignement secondaire structure des séquences de longueur moyenne RNA (typiquement < 1 000 nucléotides de forme dans les cellules et < 200 nucléotides pour forme in vitro). Il est particulièrement utile pour évaluer les changements structurels dans le récepteur RNA lors de la liaison à RNA-interaction petite molécule métabolites2,4,,7,8 et d’étudier les actions mécaniques des molécules ciblant les RNA au cours de la drogue le développement9,,10.
Découverte de médicaments ciblant les RNA a récemment attiré l’attention dans des laboratoires universitaires et l’industrie pharmaceutique11,12 via différentes approches et stratégies13,14,15 ,16. Exemples récents de ciblage RNA de petites molécules pour l’usage clinique notamment deux médicaments expérimentaux structurellement distinctes, LMI-07017 et18,RG-791619, pour l’atrophie musculaire spinale (SMA), qui a montré prometteur résultats de la phase II des essais cliniques20. Les deux molécules ont démontré que la survie des motoneurones (SMN) cible 2 pré-ARNm et réguler le processus d’épissage du gène SMN26,17,21. Nous avons démontré antérieurement à l’application de l’in vitro et forme dans les cellules par un examen des changements structurels en présence d’un analogue de RG-7916 appelée SMN-C26ARN cible.
En principe, forme mesure le taux de l’acylation de 2'-OH de chaque nucléotide d’une séquence d’ARN en présence de quantités excessives d’un réactif d’acylation auto extinction de manière impartiale. Le réactif d’acylation n’est pas stable dans l’eau, avec une courte demi-vie de (par exemple, T1/2 = 17 s 1-méthyl-7-nitroisatoic anhydride ; ou 1 M 7, environ 20 min pour 2-methylnicotinic acid imidazolide, NAI)22 et une insensibilité à l’identité de les bases23. Il en résulte une acylation plus favorable des groupes de base, souple, qui peut être transformé en une évaluation précise de la dynamique de chaque nucléotide 2'-OH. Plus précisément, un nucléotide dans une paire de base est généralement moins réactif qu’un non apparié à un réactif de modificateurs de 2'-OH, comme NAI et 1 M 7.
En regardant la source du modèle RNA, et où s’effectue l’acylation de la 2'-OH, forme peut généralement être classé en forme in vitro et dans les cellules. Dans des utilisations de vitro forme purifiée T7 transcrit RNA et ne dispose pas d’un contexte cellulaire dans des modèles expérimentaux. En forme dans les cellules, la transcription de l’ARN modèle et acylation de la 2'-OH se produisent dans des cellules vivantes ; par conséquent, les résultats peuvent récapituler le modèle structurel de RNA dans un contexte cellulaire. FORME dans les cellules a été mentionnée comme dans vivo forme pour la forme dans les cellules vivantes dans la littérature24. Étant donné que cette expérience n’est pas effectuée chez un animal, nous avons appelé cette expérience forme dans les cellules pour une précision.
Les stratégies pour la phase d’extension amorce de forme in vitro et dans les cellules sont également différentes. En forme in vitro, transcription inverse s’arrête à la position 2'-OH de l’acylation en présence de Mg2 +. Une extension d’amorce de 32P-labled apparaît donc comme une bande dans l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) et l’intensité de la bande est proportionnelle à l’acylation taux1. En forme dans les cellules, transcription inverse génère des mutations aléatoires à la 2'-OH adduit position en présence de Mn2 +. Le taux de mutation de chaque nucléotide peut être capturé par séquençage de prochaine génération de profondeur, et la réactivité forme mononucléotidiques résolution peut alors être calculée.
Un problème potentiel pour la forme dans les cellules est le rapport signal-bruit faible (c.-à-d., une majorité des groupes 2'-OH est non modifiée, alors que les séquences non modifiées occupent la plupart de la lire dans le séquençage de nouvelle génération). Récemment, une méthode pour enrichir la 2'-OH modifié RNA, visé comme en vivo, cliquez sur la forme (icSHAPE), a été développée par le laboratoire de Chang25. Cette méthode d’enrichissement peut être avantageuse, dans l’étude de faibles petites molécules telles que les interactions de RNA, surtout dans un interrogatoire à l’échelle du transcriptome.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>gBlock for &#62; 200 bp DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin gel and PCR clean-up kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaScript T7 transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1333</td>
			<td>Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TBE-urea sample buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow&#8482; Filter Unit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Safe dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 % TBE-urea mini-gel</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperscreen&#8482; Intensifying Screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1669</td>
			<td>calcium tungstate phosphor screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphor storage screen</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>BAS-IP MS 3543 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Typhoon</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAI (2M)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>03-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Contains 5X RT buffer, SuperScript IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddNTP set (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE27-2045-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>GD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Also contains RNase A and protease K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMN2 minigene34</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpLE</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca/ Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Also contains RW1, RPE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Contains DNase I and RDD buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>random nonamer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11904-018</td>
			<td>Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime pfx DNA polymerse</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12344024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucAway column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM10070</td>
			<td>for desalting purpose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes

Dans le processus de développement de médicaments de RNA-ciblant les petites molécules, élucider les modifications structurelles lors de leurs interactions avec les séquences d’ARN cible est souhaitée. Nous fournissons ci-après une détaillées in vitro et dans les cellules sélectif 2'-hydroxyle acylation analysés par extension d’amorce protocole (forme) pour étudier le changement structurel de RNA en présence d’un médicament expérimental pour l’atrophie musculaire spinale (SMA), la survie de des motoneurones (SMN)-C2 et dans l’exon 7 du pré-ARNm du gène SMN2. En forme in vitro, une séquence d’ARN de 140 nucléotides contenant SMN2 exon 7 est transcrits par l’ARN polymérase T7, pliée en présence de SMN-C2 et modifiée par la suite par un réactif d’acylation doux 2'-OH, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). Cet adduit 2'-OH-NAI est encore sondé par un 32extension d’amorce marquée P et résolu par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE). À l’inverse, 2'-OH acylation en forme dans les cellules a lieu in situ avec SMN-C2 lié ARN cellulaire dans les cellules vivantes. La séquence de l’ARN pré-messager de l’exon 7 dans le gène SMN2, ainsi que des mutations dans l’extension de l’amorce, induite par la forme a été ensuite amplifiée par PCR et sous réserve de séquençage de prochaine génération. Si l'on compare les deux méthodes, forme in vitro est une méthode plus rentable et ne nécessite pas de puissance de calcul pour visualiser les résultats. Toutefois, le modèle in vitro de RNA dérivées de SHAPE s’écarte parfois de la structure secondaire dans un contexte cellulaire, probablement en raison de la perte de toutes les interactions avec les protéines de liaison à l’ARN. Dans les cellules forme n’a pas un milieu de travail matériel radioactif et donne une structure secondaire plus précise de RNA dans le contexte cellulaire. En outre, la forme dans les cellules est généralement applicable pour une plus grandes séquences de gamme de l’ARN (~ 1 000 nucléotides) en utilisant le séquençage de nouvelle génération, par rapport à in vitro façonnent (~ 200 nucléotides) qui habituellement s’appuie sur l’analyse de PAGE. Dans le cas de l’exon 7 SMN2 pre-mRNA, la forme in vitro et dans les cellules dérivées des modèles RNA sont semblables les uns aux autres.

Nous avons démontré précédemment qu’un ARN épissage modulateur, SMN-C2, interagit avec motif AGGAAG sur 7 d’exon du pré-ARNm du gène SMN2 et forme permettant d’évaluer les changements structurels de RNA en présence de SMN-C26. Le site de liaison du SMN-C2 se distingue par l’oligonucléotide antisens approuvé par la FDA (ASO) pour SMA, nusinersen, qui se lie et bloque le silencieux intronic épissage (ISS) sur intron 727<sup...

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Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Des protocoles détaillés pour les deux in vitro et dans les cellules sélectif 2'-hydroxyle acylation analysés par des expériences de primer extension (forme) pour déterminer la structure secondaire des séquences de l’ARN pré-messager d’intérêt en présence d’une petite molécule RNA ciblage sont présenté dans cet article.

En utilisant en forme in Vitro et dans les cellules d’enquêter sur petites molécules a induit des changements structurels de l’ARN pré-messager

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Cette vidéo fournira des protocoles détaillés pour les expériences de forme in vitro afin de déterminer la structure secondaire des séquences d’ARN d’intérêt en présence d’un ARN ciblant une petite molécule. La forme in vitro est une méthode rentable pour comprendre la dynamique de chaque nucléotide sur un élément arn de la taille d’un aminé qui est généralement inférieur à 200 nucléotides. Après avoir préparé le modèle d’ARN tel que décrit dans le manuscrit, l’étiquette radio amorce la transcription inverse en ajoutant un gamma 32P ATP, amorce de transcription inversée.Tampon de réaction 10XPNK, kinase polynucléotide et eau libre de l’ARN dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre dans un volume total de 20 microlitres. Puis incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Vous activez ensuite les échantillons pendant 20 minutes depuis 65 degrés Celsius, puis filtrez les échantillons dans une colonne de desalting et centrifugeuse à 1000 fois G.Ajouter 25 microlitres de tampon échantillon d’urée 2XTBE et mélanger.Abaissez ces produits étiquetés dans un gel d’acrylamide à 10 % et assurez-vous d’éviter de saigner la radioactivité dans les réservoirs du haut. Faire fonctionner le gel à 20 watts pendant une heure. Après la course, retirer les plaques de verre de la cassette de gel.Déposer le gel sur le morceau de pellicule plastique. Pliez le plastique sur le dessus du gel pour faire un sandwich étanche à l’air. Déposer le sandwich au gel sur un écran de phosphore calcium-tungstate et exposer à l’aide d’un instrument d’imagination.Imagez le gel à nouveau avec la lumière régulière pour savoir où sont les bords du gel. Utilisez un logiciel de traitement d’image pour superposer les deux images et superposer les images claires et sombres. Ensuite, rendre l’image supérieure légèrement opaque afin de voir les deux images simultanément.Assurez-vous que l’image imprimée a la même taille que le gel réel. Alignez ensuite le gel sur l’image imprimée. Enfin, utilisez une lame de rasoir stérilisée pour couper les plis désirés du gel et placer chaque morceau de gel dans un tube de microcentrifugeuse séparé de 1,7 millilitre.Pour récupérer l’ADN de la tranche de gel par elution passive, ajoutez 0,3 millilitres de mélange de précipitations d’élitution à chaque tube de 1,7 millilitre. Incuber les tubes dans un récipient radioactif sûr sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Après l’incubation, transférer le liquide dans un nouveau tube de 1,7 millilitre.Ajouter 2,5 x de glace froide 200 éthanol à l’épreuve et inverser les tubes six fois pour mélanger le liquide. Incuber les tubes à moins 80 degrés Celsius pendant au moins une heure. Après avoir centrifugé à 10 000 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, retirez soigneusement le supernatant par pipetting.Ajouter un millilitre de 80 % d’éthanol pour laver la pastille. Vortex pendant 15 secondes et centrifugeuse à nouveau dans les mêmes conditions. Après avoir enlevé le supernatant par pipetting, sécher à l’air la pastille d’ADN pendant cinq minutes.Ajouter 50 microlitres d’eau libre de l’ARN et mélanger en pipetting de haut en bas 10 fois. Normaliser la concentration d’ADN à environ 100 000 dénombrements par minute par microlitre dans un compteur de scintillation. Pour préparer quatre échantillons à la modification chimique, ajouter huit picomoles d’ARN dans 32 microlitres de tampon de 0,5 XTE à un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre.Chauffer à 80 degrés Celsius pendant deux minutes et laisser refroidir sur la glace pendant au moins une minute. Ajouter ensuite huit microlitres de mélange pliant 5x, mélanger un allouer neuf microlitres de ce mélange d’ARN dans chacun des quatre tubes PCR, étiquetés de un à quatre. Ajouter un microlitre de 10% DMSO dans le tube marqué comme un, un microlitre de solution concentrée de petite molécule dans le tube deux, un microlitre de solution diluée de petite molécule dans le tube trois et un microlitre d’eau dans le tube quatre.Incuber tous les tubes PCR à 37 degrés Celsius dans un cycleur thermique pendant 30 minutes. Directement avant la réaction de modification de deux oh premier, diluer un microlitre de deux solution molaire de stock de NAI dans trois microlitres de l’eau DEPC-traitée pour produire une solution de travail molaire de 0,5. Ajoutez immédiatement un microlitre de cette solution dans les tubes un, deux et trois.Ajouter un microlitre de 25% DMSO dans le tube quatre et incuber dans un cycleur thermique à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Préparer quatre tubes de microcentrifugeuse frais de 1,7 millilitre et ajouter 100 microlitres de mélange de précipitations d’élitution et deux microlitres de glycogène à chaque tube. Puis dans chacun de ces tubes transférer tout le liquide à partir des tubes PCR correspondants.Ajouter 0,34 millilitres d’éthanol glacé à l’épreuve 200 dans chaque tube et mélanger en tourbillonnant pendant cinq secondes. Placez les tubes dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius pendant au moins une heure. Puis centrifuger les tubes pendant 15 minutes à 14 000 fois G à quatre degrés Celsius.Sans déranger la pastille d’ARN, retirez le surnatant de chaque tube. Ajouter 0,5 millilitres de 80 % d’éthanol par tube pour laver la pastille d’ARN et le vortex pendant 15 secondes. Après avoir centrifugé à nouveau dans les mêmes conditions, retirer le supernatant et sécher à l’air la pastille d’ARN pendant cinq minutes.Ajouter neuf microlitres d’eau libre et de tuyaux d’ARN qui montent et descendent 10 fois pour mélanger. Transférez l’ARN modifié dans quatre nouveaux tubes PCR et étiquetez-les un à quatre comme dans l’étape précédente. Ajoutez deux picomoles d’ARN dans sept microlitres d’eau traitée par DEPC à chacun des quatre tubes PCR supplémentaires et étiquetez-les avec des nombres cinq à huit.Ajouter deux microlitres de l’amorce radioétique récupérée à chacun des huit tubes PCR marqués un à huit. Après avoir chauffage à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes, refroidir immédiatement à quatre degrés Celsius dans le cycleur thermique. Ajouter quatre microlitres de tampon RT 5x, un microlitre de 0,1 molaire DTT et un microlitre de mélange DNTP à chacun des tubes.Ajouter ensuite deux microlitres d’eau traitée par DEPC aux tubes un à quatre. Ajouter quatre microlitres de cinq millimolaires ddATP au tube cinq, quatre microlitres de cinq millimolaires ddTTP au tube six et quatre microlitres de cinq millimolaires ddCTP au tube sept et un microlitre de cinq millimolaires ddGTP et trois microlitres d’eau traitée par DEPC à tube huit et pipette quatre fois à mélanger. Après avoir chauffage tous les tubes PCR à 52 degrés Celsius pendant une minute dans un cycleur thermique, ajouter un microlitre de transcriptase inverse à chaque tube et le pipe de haut en bas quatre fois pour mélanger.Incuber les réactions à 52 degrés Celsius pendant 20 minutes dans le cycleur thermique. Pour hydrolyser l’ARN, ajouter un microlitre de cinq hydroxyde de sodium molaire dans chacun des tubes et les chauffer à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite cinq microlitres d’un acide chlorhydrique molaire pour neutraliser la réaction et répéter les précipitations d’éthanol comme décrit précédemment.Après séchage à l’air de la pastille d’ADN pendant cinq minutes, ajouter 10 microlitres d’eau et 10 microlitres de tampon de chargement de l’échantillon d’urée 2xTBE dans des tubes de 1,7 millilitre et le pipe de haut en bas 10 fois pour redissolent. Chauffer les échantillons à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis placer les tubes sur la glace, avant de les charger sur le gel. Chargez 10 microlitres de l’échantillon qui a été placé sur la glace sur le gel de séquençage en polyacrylamide à 8 %.Faire fonctionner le gel à 65 watts pendant deux heures ou jusqu’à ce que le colorant inférieur atteigne les 3/4èmes du gel. Retirez l’espaceur et insérez doucement une spatule pour enlever la plaque de verre siliconée supérieure. Couvrir le gel d’un morceau de papier filtre grand et presser doucement pour permettre au gel d’adhérer au papier filtre.À partir de l’extrémité inférieure, soulevez le papier filtre et retirez le gel de la plaque de verre avec le papier. Après avoir transféré le gel sur un papier d’emballage comme précédemment fait, le sécher à 70 degrés Celsius pendant une heure avec un vide, en s’assurant d’utiliser plusieurs papiers filtre entre le gel et la sécheuse. Transférez le sandwich au gel sur une cassette d’écran de stockage de phosphore blanchie par photo et exposez la radioactivité du gel à l’écran pendant quatre à 16 heures.Enfin, placez l’écran de stockage du phosphore sur un appareil d’imagerie et numérisez à résolution moyenne pendant environ 30 minutes. Après avoir exposé le gel de séquençage de polyacrylamide à l’écran de stockage de phosphore, une expérience réussie de forme a montré une courbure simple et la plus intense au dessus du gel et se plie tout au long du gel à la résolution simple de nucléotide sans frottis. Le gel a également montré que l’intensité de certains virages a changé en présence de petites molécules, ce qui indique des changements de la force d’appariement de base.Un problème courant dans l’analyse de page est qu’une région de frottis connue sous le nom de front de sel peut apparaître au milieu du gel, probablement en raison de la concentration élevée de sel, de DMSO ou d’autre substance indésirable dans l’échantillon de chargement. Cela peut être évité en enlevant la substance indésirable par précipitation d’éthanol. Un modèle d’ARN homogène est préférable pour la forme in vitro.Nous utilisons des ribosomes à la fois à cinq extrémités principales et trois extrémités principales pour obtenir un tel ARN. La forme dans la cellule peut également être exécutée pour obtenir la structure secondaire d’ARN dans le contexte cellulaire. N’oubliez pas que la forme in vitro peut ne pas récapituler les interactions protéiques liant l’ARN vivo.La forme in vitro est une méthode puissante pour détecter les changements dans la structure de l’ARN en raison de la présence d’une petite molécule. Ceci est fait en quantifiant les changements dans la force de modelage des arrêts de transcriptase inverse. Soyez prudent que toutes les expériences décrites dans cette vidéo soient effectuées dans un lieu de travail radioactif autorisé avec une protection personnelle appropriée et un blindage en plexiglas.

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