Name: using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes
Uploaded: 2019-01-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch den NIH R01-Zuschuss (NS094721, K.A.J.) möglich.

(1) in-vitro-Form
Hinweis: Das Protokoll ist von dem veröffentlichten Protokoll Nr.1geändert.
<ol><li>Vorbereitung der RNA-Vorlage Hinweis: Die Vorlage für T7 Transkription wurde bestellt, wie ein synthetisches doppelsträngige DNA (DsDNA) und verstärkt durch entweder Einschieben in einem E. Coli -Vektor, der trägt ein einzigartiges Paar EcoRI/BamHI Einschränkung Endonuklease Websites, wie pET28a ode...

<ol>
	<li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+Quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>Trausch, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+diversity+in+the+SAM+clan+of+riboswitches.">Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).</li><li>Souliere, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+a+riboswitch+response+through+structural+extension+of+a+pseudoknot.">Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).</li><li>Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+Analysis+of+Small+RNAs+and+Riboswitches.">SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches.</a> Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+SHAPE+analysis+in+living+cells.">RNA SHAPE analysis in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).</li><li>Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+a+small-molecule+modulator+of+SMN2+splicing.">Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).</li><li>Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mn+2++-Sensing+Mechanisms+of+yybP-ykoY+Orphan+Riboswitches.">Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches.</a> Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).</li><li>Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+contacts+control+switching+of+the+SAM-I+riboswitch.">Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch.</a> Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).</li><li>Abulwerdi, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Small+Molecules+with+a+Noncanonical+Binding+Mode+to+HIV-1+Trans+Activation+Response+(TAR)+RNA.">Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).</li><li>Shortridge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrocyclic+Peptide+Ligand+Binds+the+Oncogenic+MicroRNA-21+Precursor+and+Suppresses+Dicer+Processing.">A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).</li><li>Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+targeting+RNA+with+drug-like+small+molecules.">Principles for targeting RNA with drug-like small molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+against+RNA+targets+attract+big+backers.">Small molecules against RNA targets attract big backers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).</li><li>Shortridge, M. D., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+based+approaches+for+targeting+non-coding+RNAs+with+small+molecules.">Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules.</a> Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).</li><li>Gallego, J., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RNA+with+Small-Molecule+Drugs:+Therapeutic+Promise+and+Chemical+Challenges.">Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).</li><li>Rizvi, N. F., Smith, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+small+molecule+druggable+target.">RNA as a small molecule druggable target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).</li><li>Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Role+of+RNA+as+a+Therapeutic+Target+for+Small+Molecules.">The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules.</a> Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).</li><li>Palacino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splice+modulators+enhance+U1-pre-mRNA+association+and+rescue+SMA+mice.">SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice.</a> Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).</li><li>Ratni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Risdiplam,+a+Selective+Survival+of+Motor+Neuron-2+(+SMN2+)+Gene+Splicing+Modifier+for+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy+(SMA).">Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA).</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).</li><li>Naryshkin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splicing+modifiers+improve+motor+function+and+longevity+in+mice+with+spinal+muscular+atrophy.">SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy.</a> Science. 345, (2014).</li><li>Chiriboga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+Evidence+for+Pharmacodynamics+Effects+of+RG7916+in+JEWELFISH,+a+Study+in+Patients+with+Spinal+Muscular+Atrophy+who+Previously+Participated+in+a+Study+with+Another+SMN2-Splicing+Targeting+Therapy+(S46.003).">Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003).</a> Neurology. 90, (2018).</li><li>Sivaramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+SMN2+pre-mRNA-protein+complex+elicits+specificity+for+small+molecule+splicing+modifiers.">Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SHAPE+reagents+for+mapping+RNA+structures+inside+living+cells.">Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells.</a> RNA. 23, 169-174 (2017).</li><li>Weeks, K. M., Mauger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+Structural+Codes+with+SHAPE+Chemistry.">Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).</li><li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+reveals+transcript-wide+interactions+,+complex+structural+domains+,+and+protein+interactions+across+the+Xist+lncRNA+in+living+cells.">SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).</li><li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+&#8242;+-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP)+for+direct+,+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis.">Selective 2 &#8242; -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes &amp; Development. 24, 1634-1644 (2010).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li><li>Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+SR+proteins+improves+SMN+expression+in+spinal+muscular+atrophy+cells.">Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells.</a> PloS One. 9, e115205 (2014).</li><li>Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+functional+implications+of+the+3D+architectures+of+viral+tRNA-like+structures.">Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures.</a> RNA. 15, 294-307 (2009).</li><li>Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+role+of+RNA+structure+in+alternative+splicing+of+a+critical+exon+in+the+spinal+muscular+atrophy+genes.">Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes.</a> Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).</li><li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy.">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).</li><li>Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+motif+discovery+by+SHAPE+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP).">RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP).</a> Nature Methods. 11, 959 (2014).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+Footprinting+to+Map+Sites+of+RNA-Protein+Interactions.">RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).</li><li>Velagapudi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+small+molecule+against+an+oncogenic+noncoding+RNA.">Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).</li><li>Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+NMR+to+structure+determination+of+RNAs+large+and+small.">Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).</li><li>Scott, L. G., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+determination+by+NMR.">RNA structure determination by NMR.</a> Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).</li></ol>

In in-vitro-Form ist es wichtig, qualitativ hochwertige homogene RNA-Vorlage verwenden. T7-Transkription, liefert jedoch oft heterogenen Sequenzen36. Insbesondere sind Sequenzen mit ±1 Nukleotid am 3'-Terminus mit nicht zu vernachlässigenden Erträge36 in der Regel schwierig, durch Polyacrylamid-Gel Reinigung entfernt werden. Heterogene RNA-Vorlage kann dazu führen, dass mehr als ein Satz des Signals in die Sequenzierung Gel Profilierung der Grundierung Erweiterungsprodu...

Selektive 2'-Hydroxyl Acylation analysiert durch Primer Extension (Form) ist eine Methode zur Messung der Kinetics von jedem Nukleotid in einer RNA-Sequenz des Interesses und Aufklärung der Sekundärstruktur bei Einzel-Nukleotid-Auflösung1. Form-Methoden, sowohl im in-vitro-Bedingungen2,3,4 (gereinigte RNA in einem definierten Puffersystem) und im lebenden Säugetier-Zellen5,6, wurden entwickelt, um die sekundäre untersuchen Struktur von mittlerer Länge RNA-Sequenzen (in der Regel < 1.000 Nukleotide in der Zelle Form und < 200 Nukleotide für in-vitro-Form). Es ist besonders nützlich, um Strukturveränderungen im Rezeptor RNA nach Bindung an RNA-Interaktion niedermolekularer Metaboliten2,4,7,8 bewertet und mechanistische Aktionen studieren RNA-targeting Moleküle während Drug Development9,10.
RNA-targeting Arzneimittelforschung hat vor kurzem Aufmerksamkeit in wissenschaftlichen Labors und der pharmazeutischen Industrie11,12 über unterschiedliche Ansätze und Strategien13,14,15 gezogen ,16. Jüngste Beispiele für RNA-targeting kleine Moleküle für den klinischen Gebrauch zwei strukturell verschiedene experimentelle Medikamente, LMI-07017 und RG-791618,19, für spinale Muskelatrophie (SMA), der viel versprechende zeigte Ergebnisse in Phase II Studien20. Beide Moleküle wurden gezeigt, die Ziel-Überleben der Motoneuron (SMN) 2 Pre-mRNA und regulieren das Spleißen Verfahren des SMN2 gen6,17,21. Die Anwendung von in-vitro- und in der Zelle Form in einer Untersuchung der Ziel-RNA strukturellen Veränderungen in der Gegenwart ein Analogon der RG-7916 bekannt als SMN-C26zuvor gezeigt.
Im Prinzip misst Form die 2'-OH Acylation bei jedem Nukleotid eine RNA-Sequenz im Beisein von überschüssigen Mengen an ein selbst abschrecken Acylation Reagenz unvoreingenommen. Das Acylation Reagenz ist nicht stabil im Wasser, mit einer kurzen Halbwertszeit von (z. B. T1/2 = 17 s 1-Methyl-7-Nitroisatoic-Anhydrid; oder 1 M 7, ~ 20 min für 2-Methylnicotinic Säure Lithiumimidazolid, NAI)22 und Unempfindlichkeit gegen die Identität des die Basen-23. Dies führt zu einer günstigeren Acylation von 2'-OH-Gruppen der flexiblen Basen, die eine genaue Einschätzung der Dynamik der einzelnen Nukleotid umgewandelt werden können. Insbesondere ist ein Nukleotid in einem Base-paar in der Regel weniger reaktiv als eine ungepaarte man ein 2'-OH modifizierenden Reagenz, wie NAI und 1 M 7.
Mit Blick auf die Quelle der RNA-Vorlage und dem 2'-OH Acylation stattfindet, kann Form in der Regel in Form von in-vitro- und in-Cell kategorisiert werden. In Vitro Form verwendet gereinigtes T7 RNA transkribiert und es fehlt einen zellulären Kontext in experimentellen Designs. In ZELLFORM auftreten die RNA-Vorlage-Transkription und 2'-OH Acylation innerhalb lebender Zellen; Daher können die Ergebnisse der RNA Strukturmodell in einem zellulären Kontext rekapitulieren. In ZELLFORM wird für die Form, die in lebenden Zellen in der Literatur24durchgeführt wie in Vivo Form bezeichnet. Da dieses Experiment nicht in ein Tier durchgeführt wird, können wir dieses Experiment als ZELLFORM für Genauigkeit bezeichnet.
Auch unterscheiden sich die Strategien für die Grundierung Ausbaustufe von in-vitro- und in der Zelle Form. In in-vitro-Form hält reversen Transkription an die 2'-OH Acylation Position im Beisein von Mg2 +. Eine 32P-beschriftet-Grundierung-Erweiterung erscheint daher als eine Band in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und die Intensität der Band ist proportional zu der Acylation Satz1. In ZELLFORM, reversen Transkription generiert zufällige Mutationen bei der 2'-OH Addukt Position im Beisein von Mn2 +. Die Mutationszucht bei jedem Nukleotid durch in Tiefe Next Generation Sequencing erfasst werden kann, und die Form Reaktivität bei Einzel-Nukleotid-Auflösung kann dann berechnet werden.
Ein mögliches Problem für ZELLFORM ist die geringe Signal-Rausch-Verhältnis (d. h. ein Großteil der 2'-OH-Gruppen ist unverändert, während die unveränderten Sequenzen die meisten der Read in Next Generation Sequencing besetzen). Vor kurzem, eine Methode, um die 2'-OH anreichern RNA geändert, klicken Sie wie in Vivo Form (IcSHAPE) bezeichnet, entwickelte sich Chang Labor25. Diese Anreicherung-Methode kann bei der Untersuchung schwach kleine Moleküle wie RNA Interaktionen, vor allem in einem Verhör Transkriptom-weite vorteilhaft sein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>gBlock for &#62; 200 bp DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin gel and PCR clean-up kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaScript T7 transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1333</td>
			<td>Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TBE-urea sample buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow&#8482; Filter Unit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Safe dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 % TBE-urea mini-gel</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperscreen&#8482; Intensifying Screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1669</td>
			<td>calcium tungstate phosphor screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphor storage screen</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>BAS-IP MS 3543 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Typhoon</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAI (2M)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>03-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Contains 5X RT buffer, SuperScript IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddNTP set (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE27-2045-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>GD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Also contains RNase A and protease K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMN2 minigene34</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpLE</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca/ Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Also contains RW1, RPE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Contains DNase I and RDD buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>random nonamer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11904-018</td>
			<td>Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime pfx DNA polymerse</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12344024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucAway column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM10070</td>
			<td>for desalting purpose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes

In den Prozess der Arzneimittelentwicklung kleiner Moleküle RNA-targeting wird Aufklärung der strukturellen Veränderungen auf ihre Interaktionen mit der Ziel-RNA-Sequenzen gewünscht. Wir bieten hier eine detaillierte in-vitro- und in der Zelle selektiv 2'-Hydroxyl Acylation von Grundierung Erweiterung (Form)-Protokoll, um die RNA Strukturwandel in der Gegenwart ein experimentelles Medikament für spinale Muskelatrophie (SMA), Überleben der Studie analysiert Motoneuron (SMN)-C2, und im Exon 7 des Pre-mRNA des SMN2 Gens. In in-vitro-Form eine RNA-Sequenz von 140 Nukleotide mit SMN2 Exon 7 von T7-RNA-Polymerase transkribiert, gefaltet in Anwesenheit von SMN-C2 und anschließend durch ein mildes 2'-OH Acylation Reagenz, 2-Methylnicotinic Säure Lithiumimidazolid (NAI) geändert. Diese 2'-OH-NAI-Addukt weiter sondiert durch einen 32P-Label Grundierung Erweiterung und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) behoben. Im Gegensatz dazu erfolgt 2'-OH Acylation in der Zelle Form an Ort und Stelle mit SMN-C2 gebunden zelluläre RNA in lebenden Zellen. Die Pre-mRNA-Sequenz von Exon 7 im SMN2-gen, zusammen mit Form-induzierte Mutationen in der Primer-Extension wurde dann mittels PCR und Sequenzierung der nächsten Generation verstärkt. Vergleicht man die beiden Methoden, in-vitro-Form ist eine kostengünstigere Methode und erfordert keine Rechenleistung, Ergebnisse zu visualisieren. Jedoch weicht die in vitro Modell der Form abgeleitet RNA manchmal von der Sekundärstruktur in einem zellulären Kontext, wahrscheinlich durch den Verlust aller Interaktionen mit RNA-bindende Proteine. In ZELLFORM braucht keinen radioaktiven Material Arbeitsplatz und ergibt eine genauere RNA Sekundärstruktur im Zusammenhang mit zellulären. Darüber hinaus in der ZELLFORM ist in der Regel für eine größere Palette von RNA-Sequenzen (~ 1.000 Nukleotide) durch die Verwendung von Next Generation Sequencing, im Vergleich zu in-vitro-(~ 200 Nukleotide), die in der Regel zu gestalten setzt auf Seitenanalyse. Für den Fall, dass der Exon 7 in SMN2 Pre-mRNA, die in-vitro- und in der Zelle Form abgeleitet sind RNA-Modelle einander ähnlich.

Wir bewiesen vorher, dass eine RNA-Spleißen Modulator, SMN-C2, interagiert mit AGGAAG Motiv auf Exon 7 des SMN2 Gens Pre-mRNA und Form verwendet, um die RNA strukturelle Änderungen im Beisein von SMN-C26zu beurteilen. Die Bindungsstelle des SMN-C2 unterscheidet sich von der FDA zugelassene antisense Oligonucleotide (ASO) für SMA, Nusinersen, die bindet und blockiert die intronischen Spleißen Schalldämpfer (ISS) Intron 727,<su...

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Detaillierte Protokolle für beide in vitro und in-Cell selektive 2'-Hydroxyl-Acylation von Primer Extension (Form) Experimente zur Bestimmung der sekundären Struktur der Pre-mRNA-Sequenzen von Interesse im Beisein einer RNA-targeting niedermolekularer analysiert werden in diesem Artikel vorgestellt.

Mit In-vitro- und In der Zelle Form zu untersuchen, kleines Molekül induzierte Pre-mRNA Strukturveränderungen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Dieses Video wird detaillierte Protokolle für In-vitro-Formexperimente liefern, um die sekundäre Struktur von RNA-Sequenzen zu bestimmen, die für das Vorhandensein einer RNA, die auf kleine Moleküle abzielt, von Interesse sind. In-vitro-Form ist eine kostengünstige Methode, um die Dynamik jedes Nukleotids auf einem aminogroßen RNA-Element zu verstehen, das in der Regel weniger als 200 Nukleotide ist. Nach der Vorbereitung der RNA-Vorlage, wie im Manuskript beschrieben, Radio-Label-Reverse-Transkriptionsprimer durch Hinzufügen einer Gamma 32P ATP, umgekehrte Transkriptionsprimer.10XPNK Reaktionspuffer, Polynukleotidkinase und das freie Wasser der RNA in einem 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr in einem Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern. Dann bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubieren. Sie aktivieren dann die Proben für 20 Minuten seit 65 Grad Celsius und filtern dann die Proben in einer Entsalzungssäule und Zentrifuge 1000 mal G.Add 25 Mikroliter 2XTBE Harnstoffprobenpuffer und mischen.Senken Sie diese gekennzeichneten Produkte in ein 10%acrylamid-Gel und vermeiden Sie das Ausbluten der Radioaktivität in die oberen Reservoirs. Führen Sie das Gel mit 20 Watt für eine Stunde. Entfernen Sie nach dem Lauf die Glasplatten der Gelkassette.Legen Sie das Gel auf das Stück Plastikfolie. Falten Sie den Kunststoff auf die Oberseite des Gels, um ein luftdichtes Sandwich zu machen. Legen Sie das Gel-Sandwich auf einen Calcium-Wolfram-Phosphor-Bildschirm und setzen Sie es mit einem imaginären Instrument aus.Stellen Sie das Gel erneut mit regelmäßigem Licht auf, um zu wissen, wo sich die Ränder des Gels befinden. Verwenden Sie eine Bildverarbeitungssoftware, um die beiden Bilder zu überlagern und die hellen und dunklen Bilder zu überlagern. Machen Sie dann das obere Bild etwas undurchsichtig, um beide Bilder gleichzeitig zu sehen.Stellen Sie sicher, dass das gedruckte Bild die gleiche Größe wie das eigentliche Gel hat. Richten Sie dann das Gel auf dem gedruckten Bild aus. Schließlich verwenden Sie eine sterilisierte Rasierklinge, um die gewünschten Biegungen aus dem Gel zu schneiden und jedes Stück Gel in einem separaten 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr zu platzieren.Um die DNA aus der Gelscheibe durch passive Elution zu gewinnen, fügen Sie 0,3 Milliliter Elutionsniederschlagsmischung zu jedem 1,7 Milliliter-Rohr hinzu. Inkubieren Sie die Rohre in einem radioaktiv-sicheren Behälter auf einem Rotator bei vier Grad Celsius für 16 Stunden. Nach der Inkubation die Flüssigkeit in ein neues 1,7-Milliliter-Rohr geben.2,5x eiskaltes 200-haltiges Ethanol hinzufügen und die Rohre sechsmal umkehren, um die Flüssigkeit zu mischen. Die Rohre mindestens eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius bebrüten. Nach der Zentrifugierung bei 10, 000g und vier Grad Celsius für 10 Minuten, entfernen Sie den Überstand sorgfältig durch Pipettieren.Fügen Sie einen Milliliter 80% Ethanol hinzu, um das Pellet zu waschen. Wirbel für 15 Sekunden und Zentrifuge wieder unter den gleichen Bedingungen. Nach dem Entfernen des Überstandes durch Pipettieren, trocknen Sie das DNA-Pellet fünf Minuten lang lufttrocken.Fügen Sie 50 Mikroliter des freien Wassers der RNA hinzu und mischen Sie es, indem Sie 10 Mal nach oben und unten pfeifen. Normalisieren Sie die DNA-Konzentration auf etwa 100.000 Zählungen pro Minute pro Mikroliter in einem Szintillationszähler. Um vier Proben für die chemische Modifikation vorzubereiten, fügen Sie acht Picomole rna in 32 Mikroliter0,5 XTE Puffer zu einem 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr hinzu.Bei 80 Grad Celsius zwei Minuten erhitzen und mindestens eine Minute auf Eis abkühlen lassen. Dann fügen Sie acht Mikroliter 5x Faltmischung hinzu, mischen Sie neun Mikroliter dieser RNA-Mischung in jede der vier PCR-Röhren, die von eins bis vier beschriftet sind. Fügen Sie einen Mikroliter 10%DMSO in die als eine markierte Röhre, einen Mikroliter konzentrierter kleiner Moleküllösung in Tube zwei, einen Mikroliter verdünnter kleiner Moleküllösung in Tube drei und einen Mikroliter Wasser in Tube vier ein.Inkubieren Sie alle PCR-Röhren bei 37 Grad Celsius in einem thermischen Cycler für 30 Minuten. Direkt vor der beiden Prime OH Modifikationsreaktion einen Mikroliter zweier molarer NAI-Lagerlösung in drei Mikroliter DEPC-behandeltem Wasser verdünnen, um eine 0,5-Molaren-Arbeitslösung zu ergeben. Sofort einen Mikroliter dieser Lösung in die Röhren eins, zwei und drei geben.Fügen Sie einen Mikroliter 25%DMSO in Tube vier und in einem thermischen Cycler bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren. Bereiten Sie vier frische 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohre vor und fügen Sie 100 Mikroliter Elutionsniederschlagsmischung und zwei Mikroliter Glykogen in jede Röhre ein. Dann in jede dieser Rohre übertragen die gesamte Flüssigkeit aus den entsprechenden PCR-Röhren.0,34 Milliliter eiskaltes 200-proof-Ethanol in jedes Rohr geben und fünf Sekunden lang mischen. Legen Sie die Rohre mindestens eine Stunde lang in einen Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius. Dann zentrieren Sie die Rohre für 15 Minuten bei 14.000 mal G bei vier Grad Celsius.Ohne das RNA-Pellet zu stören, entfernen Sie den Überstand aus jedem Rohr. Fügen Sie 0,5 Milliliter 80% Ethanol pro Tube hinzu, um das RNA-Pellet und den Wirbel 15 Sekunden lang zu waschen. Nach der Zentrifugierung unter den gleichen Bedingungen wieder entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie das RNA-Pellet fünf Minuten lang lufttrocken.Fügen Sie neun Mikroliter des freien Wassers und der Pfeife der RNA hinzu, die zehnmal nach oben und unten gewirrt werden. Übertragen Sie die modifizierte RNA in vier neue PCR-Röhren und beschriften Sie sie eins bis vier wie im vorherigen Schritt. Fügen Sie jeweils zwei Pikomole RNA in sieben Mikroliter DEPC-behandeltem Wasser zu vier weiteren PCR-Röhren hinzu und kennzeichnen Sie sie mit den Zahlen fünf bis acht.Fügen Sie zwei Mikroliter der wiederhergestellten radioaktiv markierten Grundierung zu jedem der acht PCR-Röhren hinzu, die eins bis acht markiert sind. Nach dem Erhitzen bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten sofort auf vier Grad Celsius im Thermocycler abkühlen. Fügen Sie vier Mikroliter 5x RT Puffer, einen Mikroliter 0,1 Molar DTT und einen Mikroliter DNTP-Mix zu jedem der Rohre hinzu.Dann fügen Sie zwei Mikroliter DEPC-behandeltes Wasser in die Rohre eins bis vier. Fügen Sie vier Mikroliter von fünf Millimolar ddATP zu Tube fünf, vier Mikroliter von fünf Millimolar ddTTP zu Tube sechs und vier Mikroliter von fünf Millimolar ddCTP zu Rohr sieben und ein Mikroliter von fünf Millimolar ddGTP und drei Mikroliter DEPC-behandeltes Wasser zu Rohr acht und Pipette vier Mal zu mischen. Nachdem Sie alle PCR-Röhren bei 52 Grad Celsius für eine Minute in einem thermischen Cycler erhitzt haben, fügen Sie jedem Rohr einen Mikroliter Reverse-Transkriptase hinzu und pfeifen es viermal nach oben und unten, um es zu mischen.Inkubieren Sie die Reaktionen bei 52 Grad Celsius für 20 Minuten im thermischen Cycler. Um die RNA zu hydrolysieren, fügen Sie jedem der Röhren einen Mikroliter von fünf Mol-Natriumhydroxid hinzu und erhitzen Sie sie fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Fügen Sie dann fünf Mikroliter einer Molsalzsäure hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren und die Ethanolausfällung wie zuvor beschrieben zu wiederholen.Nach der Lufttrocknung des DNA-Pellets für fünf Minuten 10 Mikroliter Wasser und 10 Mikroliter 2xTBE Harnstoffproben-Ladepuffer in 1,7 Milliliter-Rohre hinzufügen und 10 Mal nach oben und unten pfeifen, um wieder aufzulösen. Erhitzen Sie die Proben bei 70 Grad Celsius für fünf Minuten, dann legen Sie die Rohre auf Eis, bevor Sie auf das Gel. 10 Mikroliter der Probe, die auf Eis gelegt wurde, auf 8%Polyacrylamid-Sequenzierungsgel laden.Führen Sie das Gel mit 65 Watt für zwei Stunden oder bis der Bodenfarbstoff die 3/4ths des Gels erreicht. Entfernen Sie den Abstandsraum und legen Sie vorsichtig einen Spachtel ein, um die obere silikonisierte Glasplatte zu entfernen. Bedecken Sie das Gel mit einem Stück großem Filterpapier und drücken Sie vorsichtig, damit das Gel am Filterpapier haften kann.Vom unteren Ende aus heben Sie das Filterpapier an und entfernen Sie das Gel zusammen mit dem Papier von der Glasplatte. Nachdem Sie das Gel wie bisher auf ein Packpapier übertragen haben, trocknen Sie es bei 70 Grad Celsius für eine Stunde mit einem Vakuum, wobei sie sicherstellen, dass mehrere Filterpapiere zwischen dem Gel und dem Trockner verwendet werden. Übertragen Sie das Gel-Sandwich auf eine fotogebleichte Phosphor-Speicherbildschirmkassette und setzen Sie die Radioaktivität des Gels für vier bis 16 Stunden auf den Bildschirm aus.Schließlich den Phosphor-Speicherbildschirm auf einem Bildverarbeitungsgerät platzieren und mit mittlerer Auflösung ca. 30 Minuten scannen. Nachdem Polyacrylamid-Sequenzierungsgel dem Phosphorspeichersieb ausgesetzt wurde, zeigte ein erfolgreiches Formexperiment eine einzige und intensivste Biegung an der Oberseite des Gels und biegt sich im gesamten Gel bei einer einzigen Nukleotidauflösung ohne Abstrich. Das Gel zeigte auch, dass sich die Intensität einiger Biegungen in Gegenwart kleiner Moleküle änderte, was auf Veränderungen der Basispaarungsstärke hindeutet.Ein häufiges Problem in der Seitenanalyse ist, dass ein Abstrichbereich, der als Salzfront bekannt ist, in der Mitte des Gels auftreten kann, wahrscheinlich aufgrund einer hohen Konzentration von Salz, DMSO oder einer anderen unerwünschten Substanz in der Belastungsprobe. Dies kann vermieden werden, indem die unerwünschte Substanz durch Ethanolfällung entfernt wird. Eine homogene RNA-Vorlage ist für in vitro Form vorzuziehen.Wir verwenden Ribosomen an fünf Prime- und drei Prime-Enden, um eine solche RNA zu erhalten. In-Zell-Form kann auch durchgeführt werden, um RNA sekundäre Struktur im zellulären Kontext zu erhalten. Denken Sie daran, in vitro Form kann nicht rekapitulieren in vivo RNA bindende Protein-Wechselwirkungen.In-vitro-Form ist eine leistungsfähige Methode zum Nachweis von Veränderungen in der RNA-Struktur aufgrund der Anwesenheit eines kleinen Moleküls. Dies geschieht durch Quantifizierung von Änderungen in der Musterstärke von Reverse-Transkriptase-Stopps. Seien Sie vorsichtig, dass alle in diesem Video beschriebenen Experimente an einem autorisierten radioaktiven Arbeitsplatz mit entsprechendem Personenschutz und Plexiglasabschirmung durchgeführt werden.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Forschung

Genetik

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissektion der Enhancer-Funktion mit Multiplex CRISPR-basierte Enhancer Einmischung in Zell-Linien

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...