Name: using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes
Uploaded: 2019-01-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

この作品は、NIH R01 グラント (NS094721、K.A.J.) によって可能になった。

1. 体外の形状
注:プロトコルは、公開されたプロトコル1から変更されます。
<ol><li>RNA テンプレートを準備してください。 注:T7 転写用のテンプレートには、合成二本鎖 DNA (dsDNA)、EcoRI/病原制限の endonuclease の部位、PCR、pET28a などの一意のペアを運ぶ大腸菌ベクトルどちらか挿入によって増幅を命じられま?...

<ol>
	<li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+Quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>Trausch, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+diversity+in+the+SAM+clan+of+riboswitches.">Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).</li><li>Souliere, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+a+riboswitch+response+through+structural+extension+of+a+pseudoknot.">Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).</li><li>Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+Analysis+of+Small+RNAs+and+Riboswitches.">SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches.</a> Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+SHAPE+analysis+in+living+cells.">RNA SHAPE analysis in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).</li><li>Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+a+small-molecule+modulator+of+SMN2+splicing.">Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).</li><li>Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mn+2++-Sensing+Mechanisms+of+yybP-ykoY+Orphan+Riboswitches.">Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches.</a> Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).</li><li>Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+contacts+control+switching+of+the+SAM-I+riboswitch.">Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch.</a> Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).</li><li>Abulwerdi, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Small+Molecules+with+a+Noncanonical+Binding+Mode+to+HIV-1+Trans+Activation+Response+(TAR)+RNA.">Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).</li><li>Shortridge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrocyclic+Peptide+Ligand+Binds+the+Oncogenic+MicroRNA-21+Precursor+and+Suppresses+Dicer+Processing.">A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).</li><li>Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+targeting+RNA+with+drug-like+small+molecules.">Principles for targeting RNA with drug-like small molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+against+RNA+targets+attract+big+backers.">Small molecules against RNA targets attract big backers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).</li><li>Shortridge, M. D., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+based+approaches+for+targeting+non-coding+RNAs+with+small+molecules.">Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules.</a> Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).</li><li>Gallego, J., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RNA+with+Small-Molecule+Drugs:+Therapeutic+Promise+and+Chemical+Challenges.">Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).</li><li>Rizvi, N. F., Smith, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+small+molecule+druggable+target.">RNA as a small molecule druggable target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).</li><li>Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Role+of+RNA+as+a+Therapeutic+Target+for+Small+Molecules.">The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules.</a> Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).</li><li>Palacino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splice+modulators+enhance+U1-pre-mRNA+association+and+rescue+SMA+mice.">SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice.</a> Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).</li><li>Ratni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Risdiplam,+a+Selective+Survival+of+Motor+Neuron-2+(+SMN2+)+Gene+Splicing+Modifier+for+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy+(SMA).">Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA).</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).</li><li>Naryshkin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splicing+modifiers+improve+motor+function+and+longevity+in+mice+with+spinal+muscular+atrophy.">SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy.</a> Science. 345, (2014).</li><li>Chiriboga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+Evidence+for+Pharmacodynamics+Effects+of+RG7916+in+JEWELFISH,+a+Study+in+Patients+with+Spinal+Muscular+Atrophy+who+Previously+Participated+in+a+Study+with+Another+SMN2-Splicing+Targeting+Therapy+(S46.003).">Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003).</a> Neurology. 90, (2018).</li><li>Sivaramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+SMN2+pre-mRNA-protein+complex+elicits+specificity+for+small+molecule+splicing+modifiers.">Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SHAPE+reagents+for+mapping+RNA+structures+inside+living+cells.">Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells.</a> RNA. 23, 169-174 (2017).</li><li>Weeks, K. M., Mauger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+Structural+Codes+with+SHAPE+Chemistry.">Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).</li><li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+reveals+transcript-wide+interactions+,+complex+structural+domains+,+and+protein+interactions+across+the+Xist+lncRNA+in+living+cells.">SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).</li><li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+&#8242;+-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP)+for+direct+,+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis.">Selective 2 &#8242; -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes &amp; Development. 24, 1634-1644 (2010).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li><li>Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+SR+proteins+improves+SMN+expression+in+spinal+muscular+atrophy+cells.">Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells.</a> PloS One. 9, e115205 (2014).</li><li>Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+functional+implications+of+the+3D+architectures+of+viral+tRNA-like+structures.">Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures.</a> RNA. 15, 294-307 (2009).</li><li>Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+role+of+RNA+structure+in+alternative+splicing+of+a+critical+exon+in+the+spinal+muscular+atrophy+genes.">Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes.</a> Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).</li><li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy.">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).</li><li>Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+motif+discovery+by+SHAPE+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP).">RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP).</a> Nature Methods. 11, 959 (2014).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+Footprinting+to+Map+Sites+of+RNA-Protein+Interactions.">RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).</li><li>Velagapudi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+small+molecule+against+an+oncogenic+noncoding+RNA.">Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).</li><li>Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+NMR+to+structure+determination+of+RNAs+large+and+small.">Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).</li><li>Scott, L. G., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+determination+by+NMR.">RNA structure determination by NMR.</a> Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).</li></ol>

体外形で質の高い均一な RNA テンプレートを使用するが重要です。しかし、T7 転写、しばしば異種シーケンス36が得られます。特に、非取るにたらない利回り36と 3' 末端に ± 1 ヌクレオチドのシーケンスは、通常ポリアクリルアミド ゲルの浄化による除去が困難。異種の RNA テンプレートは、時々 難しく結果を解釈するプライマー拡張製品のシーケンス ゲ?...

プライマー拡張 (形状) を用いて選択 2'-水酸基のアシル化は、興味の RNA シーケンス中の各ヌクレオチドの動態を測定し、単一ヌクレオチド分解能1二次構造の解明の方法です。図形の方法論の in vitro 条件2,3,4 (定義されたバッファー システムで浄化された RNA) の両方生きている哺乳類セル5,6セカンダリを調査するために開発されています。中程度の長さの RNA シーケンスの構造 (通常 < セル内の図形の 1,000 ヌクレオチドと < 体外形の 200 のヌクレオチド)。これは RNA と相互作用する低分子代謝物2,4,7,8が結合する受容体 RNA の構造変化を評価し、機械的操作の研究特に便利RNA を対象とした薬剤開発9,10中分子。
RNA を対象とした創は、異なるアプローチと戦略13,14,15 を介して、大学の研究室で注目と製薬業界11,12を最近集めています。、16。臨床使用のための小さい分子の RNA を対象とした最近の例は、2 つの構造的に異なる実験薬、LMI 07017 , RG 791618,19、脊髄性筋萎縮症 (SMA)、約束を示したフェーズ II 臨床試験20の結果。両方の分子が 2 mRNA ターゲット生存運動ニューロン (SMN) の実証し、SMN2 遺伝子6,17,21のスプライシング プロセスを調節します。以前、体外との RG-7916 召 C26として知られているアナログの存在下で標的 RNA の構造変化の検討でセルに図形の応用を示した。
原則として、図形は公平な方法で過剰自己クエンチング アシル化試薬の存在下での RNA シーケンスの各ヌクレオチドの 2'-オハイオ州のアシル化率を測定します。アシル化試薬はの短い半減期の水で、安定しない (例えば、 T1/2 = 17; 1-メチル-7-nitroisatoic 無水または 1 M 7、2 methylnicotinic 酸 imidazolide 〜 20 分または NAI の s)22とのアイデンティティへの鈍感拠点23。各ヌクレオチドのダイナミクスの正確な評価に変換することができます柔軟な拠点の 2'-オハイオ州のグループのより有利なアシル化でこの結果します。具体的には、塩基対の塩基配列が通常ないなど 1 M 7 の 2'-ああ変更試薬に対になっていないものに比べて反応が弱い。
RNA テンプレートおよび 2'-オハイオ州のアシル化が起こるのソースを見て、形状一般的に in vitro およびセル内の図形に分類することができます。培養形状を使用して精製 T7 RNA の転写し、実験デザインで携帯電話コンテキストを欠いています。セルの形で RNA テンプレート転写と 2'-オハイオ州のアシル化の両方の生きている細胞内で発生します。したがって、結果は細胞における RNA の構造モデルを要約することができます。セルの形状生体形状のように文学24の生きているセルに図形の呼ばれています。この実験は動物では実行されない、ため精度のセルに図形としてこの実験私たちと呼ばれます。
In vitro およびセル内の図形のプライマー拡張段階の戦略も異なっています。体外形で逆のトランスクリプションは Mg2 +の存在下で 2'-オハイオ州のアシル化の位置で停止します。32P 標識プライマー拡張したがってポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) のバンドとして表示されます、バンドの強度はアシル化率1に比例します。セルの形で逆のトランスクリプションは、2'-オハイオ州でのランダムな突然変異を生成します Mn2 +の存在下での位置を付加します。各塩基の変異率は深さ次世代シーケンシングのでキャプチャできるし、塩基の分解能で形反応性が計算できます。
セル内の図形の潜在的な問題が低信号対雑音比 (すなわち、2'-オハイオ州のグループの大半は修正されていない、変更されていないシーケンスは、次世代シーケンシングの読み取りの大部分を占めている間)。最近、2' オハイオ州を豊かにする方法は、RNA を変更、生体内と同様に形状 (icSHAPE) をクリックすると呼ばれるチャン研究所25によって開発されました。この濃縮法は弱い小分子 RNA 相互作用、特にトランスクリプトーム尋問などの研究に有利であるかもしれない。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>gBlock for &#62; 200 bp DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin gel and PCR clean-up kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaScript T7 transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1333</td>
			<td>Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TBE-urea sample buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow&#8482; Filter Unit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Safe dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 % TBE-urea mini-gel</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperscreen&#8482; Intensifying Screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1669</td>
			<td>calcium tungstate phosphor screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphor storage screen</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>BAS-IP MS 3543 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Typhoon</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAI (2M)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>03-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Contains 5X RT buffer, SuperScript IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddNTP set (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE27-2045-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>GD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Also contains RNase A and protease K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMN2 minigene34</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpLE</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca/ Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Also contains RW1, RPE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Contains DNase I and RDD buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>random nonamer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11904-018</td>
			<td>Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime pfx DNA polymerse</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12344024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucAway column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM10070</td>
			<td>for desalting purpose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes

RNA を対象とした低分子化合物の医薬品開発の過程でターゲット RNA シーケンスとの相互作用によって構造変化の解明が望まれます。我々 ここの提供、詳細な体外とセルの選択 2' ヒドロキシル アシル化はプライマー拡張によって脊髄性筋萎縮症 (SMA) の生存の実験的な薬の存在下で RNA の構造変化を研究する (形状) プロトコル分析運動ニューロン (SMN)-C2 と SMN2 遺伝子の mRNA のエクソン 7。体外形 SMN2 エクソン 7 を含む 140 のヌクレオチドの RNA シーケンスは T7 RNA ポリメラーゼによる転写、召-C2 の存在下で折り返されているおよび軽度 2'-ああアシル化試薬 2-methylnicotinic 酸 imidazolide (NAI) によって後で変更します。この 2'-オハイオ-NAI 付加がさらに32P 標識プライマー拡張による、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) による解決。逆に、細胞の形で 2'-オハイオ州のアシル化では、細胞が召 C2 バインド細胞 RNA をその場で行われます。PCR と次世代シーケンスが、形状による突然変異のプライマー拡張と共に、SMN2 遺伝子のエクソン 7 の mRNA シーケンスはそれから増幅されます。2 つの手法を比較すると、体外の形状はよりコスト効果の高い方法で、結果を可視化する計算力を必要としません。ただし、in vitro RNA の SHAPE 派生モデルは、RNA 結合タンパク質とのすべての相互作用の損失の可能性が高いため、携帯電話のコンテキストの二次構造から逸脱するが時々。セルの形状は放射性物質職場を必要としないし、携帯電話のコンテキストでより正確な RNA 二次構造が得られます。さらに、細胞の形状は通常適用体外に比べると次世代シーケンサーを利用してより大きな範囲の RNA シーケンス (~ 1,000 ヌクレオチド) 形状 (~ 200 のヌクレオチド)、通常のページの分析に依存しています。SMN2 mRNA のエクソン 7 の in vitro およびセル内の図形が派生した場合に備えて RNA モデルは互いに似ています。

以前、変調器をスプライシング RNA、召 C2、SMN2 遺伝子の mRNA のエクソン 7 の AGGAAG をモチーフにした対話し、召 C26存在下で RNA の構造変化を評価するために図形を使用しました。召 C2 の結合部位は、FDA が承認したアンチセンス オリゴヌクレオチド (阿蘇) sma の nusinersen と縛りがイントロン 727,28 (<strong class...

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Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

RNA を対象とした小分子の存在下で興味の mRNA シーケンスの二次構造を決定するプライマー拡張 (形状) を用いて分析両方生体外でそして細胞の選択的 2'-水酸基のアシル化の詳細なプロトコルします。この記事で紹介しました。

MRNA の構造変化を誘導培養と細胞の形で使用して小分子を調査するには

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

このビデオでは、小分子を標的とするRNAの存在下で目的のRNA配列の二次構造を決定するためのインビトロ形状実験のための詳細なプロトコルを提供します。in vitro形状は、通常200ヌクレオチド未満であるアミノサイズのRNA要素上の各ヌクレオチドのダイナミクスを理解するための費用対効果の高い方法である。原稿に記載されたRNAテンプレートを調製した後、ラジオラベル逆転写プライマーはγ32P ATPを添加することにより、逆転転写プライマーを添加する。10XPNK反応バッファー、ポリヌクレオチドキナーゼおよびRNAの遊離水を1.7ミリリットルマイクロ遠心分離チューブで合計容量20マイクロリットルで。その後、摂氏37度で1時間インキュベートします。その後、摂氏65度から20分間サンプルを活性化し、脱塩カラムと遠心分離機のサンプルを1000倍のG.2XTBE尿素サンプルバッファーとミックスで25マイクロリットルを加えて混合します。これらの標識された製品を10%アクリルアミドゲルに下げ、放射能を上の貯水池に出血させないようにしてください。ゲルを1時間20ワットで実行します。実行後、ゲルカセットのガラス板を取り外します。ラップの部分にゲルを置きます。プラスチックをゲルの上部に折り畳んで、気密サンドイッチを作ります。ゲルサンドイッチをカルシウムタングステン酸蛍光体スクリーンに置き、想像する器具で露出させます。ゲルのエッジがどこにあるかを知るために、規則的な光でゲルを再びイメージします。画像処理ソフトウェアを使用して 2 つのイメージをオーバーレイし、明るい画像と暗いイメージをオーバーレイします。次に、両方の画像を同時に表示するために、上の画像をわずかに不透明にします。印刷された画像のサイズが実際のゲルと同じであることを確認します。次に、印刷された画像にゲルを合わせます。最後に、滅菌されたカミソリの刃を使用して、ゲルから所望のベンドを切り取り、ゲルの各部分を別々の1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離管に入れる。受動溶出によりゲルスライスからDNAを回収するには、各1.7ミリリットルチューブに溶出沈殿ミックスを0.3ミリリットル加えます。摂氏4度の放射性安全容器にチューブを摂氏4度で16時間インキュベートします。インキュベーション後、液体を新しい1.7ミリリットルチューブに移します。2.5倍の氷冷200プルーフエタノールを加え、チューブを6回反転して液体を混ぜます。最低1時間はマイナス80°Cでチューブをインキュベートします。10,000gと摂氏4度で10分間遠心した後、ピペットで上清を慎重に取り除きます。80%エタノールを1ミリリットル加え、ペレットを洗浄します。渦は15秒間、遠心分離機は同じ条件下で再び。ピペット処理により上清を除去した後、DNAペレットを5分間空気乾燥する。50マイクロリットルのRNAのフリーウォーターを加え、上下に10回ピペットで混ぜます。シンチレーションカウンターで1マイクロリットル当たり約100,000カウントにDNA濃度を正規化します。化学修飾のために4つのサンプルを調製するには、0.5 XTEバッファーの32マイクロリットルにRNAの8ピコモールを1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離管に加えます。摂氏80度で2分間加熱し、氷の上で少なくとも1分間冷やします。次に、5倍の折りたたみミックスの8マイクロリットルを追加し、このRNA混合物の9マイクロリットルを4つのPCRチューブのそれぞれに割り当て、1から4まで標識します。10%DMSOの1マイクロリットルをチューブ1つとしてマークしたチューブに加え、濃縮された小分子溶液を1マイクロリットルのチューブ2に、希釈された小分子溶液をチューブ3に1マイクロリットル、チューブ4に1マイクロリットルの水を加えます。サーマルサイクラーで37°CのすべてのPCRチューブを30分間インキュベートします。2つの素数OH改質反応の直前に、2つのモルナイストック溶液の1マイクロリットルをDEPC処理水の3マイクロリットルで希釈し、0.5モル加工溶液を生成します。すぐにチューブ1、2、3にこの溶液の1マイクロリットルを追加します。チューブ4に25%DMSOの1マイクロリットルを加え、摂氏37度のサーマルサイクラーで15分間インキュベートします。新鮮な1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブを4個用意し、各チューブに100マイクロリットルの溶出沈殿ミックスと2マイクロリットルのグリコーゲンを加えます。次に、これらのチューブのそれぞれに、対応するPCRチューブからすべての液体を移動します。各チューブに0.34ミリリットルの氷冷200プルーフエタノールを加え、5秒間渦を混ぜて混ぜます。チューブをマイナス80度の冷凍庫に少なくとも1時間置きます。その後、チューブを摂氏4度で14,000倍Gで15分間遠心分離します。RNAペレットを邪魔することなく、各チューブから上清を除去します。1チューブあたり80%エタノールの0.5ミリリットルを加え、RNAペレットと渦を15秒間洗浄します。同じ条件で再び遠心分離した後、上清を取り除き、RNAペレットを5分間空気乾燥させます。RNAの無料の水とパイプの9マイクロリットルを加え、上下に10回混ぜます。変更したRNAを4つの新しいPCRチューブに移し、前のステップのように1~4個のラベルを付けます。7マイクロリットルのDEPC処理水にRNAの2つのピコモールを4つの追加PCRチューブのそれぞれに追加し、5〜8の番号でそれらをラベル付けします。回収された放射性標識プライマーの2マイクロリットルを、1~8個のPCRチューブのそれぞれに加えます。摂氏65度で5分間加熱した後、サーマルサイクラーですぐに摂氏4度まで冷却します。5x RTバッファーの4マイクロリットル、0.1モルDTTの1マイクロリットル、および各チューブにDNTPミックスの1マイクロリットルを追加します。その後、チューブ1〜4にDEPC処理水の2マイクロリットルを追加します。チューブ5に5ミリモルddATPの4マイクロリットル、5ミリモルddTTPの4マイクロリットルをチューブ7と5ミリモルddGTPの1マイクロリットルに加え、5ミリモルdGTPの1マイクロリットルとDEPC処理水の3マイクロリットルをチューブ8とピペットを4回混合します。サーマルサイクラーでPCRチューブをすべて摂氏52度で1分間加熱した後、各チューブに1マイクロリットルの逆転写酵素を加え、上下に4回パイプして混合します。サーマルサイクラーで20分間摂氏52度で反応をインキュベートします。RNAを加水分解するには、5つの水酸化モルナトリウムのマイクロリットルを各チューブに加え、摂氏95度で5分間加熱します。次に、1モル塩酸の5マイクロリットルを加えて反応を中和し、先に述べたようにエタノール沈殿を繰り返す。DNAペレットを5分間空気乾燥させた後、1.7ミリリットルチューブに10マイクロリットルの水と10マイクロリットルの2xTBE尿素サンプルローディングバッファーを加え、10回上下して再溶解します。サンプルを摂氏70度で5分間加熱し、チューブを氷の上に置いてからゲルにセットします。氷上に置かれたサンプルの10マイクロリットルを8%ポリアクリルアミドシーケンシングゲルにロードします。65ワットで2時間、または底染料がゲルの3/4に達するまでゲルを実行します。スペーサーを取り外し、ヘラをそっと挿入して、上のシリコンガラス板を取り外します。大きなフィルターペーパーでゲルを覆い、ゲルが濾紙に付着するように軽く押します。下端から始めて、フィルターペーパーを持ち上げ、紙と一緒にガラス板からゲルを取り除きます。以前のようにゲルを包装紙に移した後、真空で摂氏70度で1時間乾燥し、ゲルと乾燥機の間に複数のフィルターペーパーを使用してください。ゲルサンドイッチを写真漂白蛍光体保存スクリーンカセットに移し、ゲルの放射能を4~16時間画面に露出させます。最後に、蛍光体記憶装置を撮像装置に設置し、約30分間、中解像度でスキャンします。ポリアクリルアミドシーケンシングゲルを蛍光体貯蔵画面に露出させた後、成功した形状実験はゲルの上部に単一かつ最も強い曲げを示し、スミアなしの一塩基分解能でゲル全体に曲がった。ゲルはまた、いくつかの曲げの強度が小分子の存在下で変化したことを示し、塩基対強度の変化を示した。ページ分析の一般的な問題は、塩の前部として知られているスミア領域がゲルの真ん中に現れる可能性があり、おそらく高濃度の塩、DMSOまたは負荷サンプル内の他の不要な物質が原因である。すなわち、エタノール沈殿により不要物質を除去することで回避できる。同種のRNAテンプレートは、インビトロ形状に好ましい。5つの素数と3つの素端の両方でリボソームを使用して、そのようなRNAを得る。細胞内の形状はまた、細胞コンテキストにおけるRNA二次構造を得るために行うことができる。インビトロ形状は、生体内RNA結合タンパク質相互作用を再現しない場合があります。インビトロ形状は、低分子の存在によるRNA構造の変化を検出するための強力な方法です。これは、逆転写酵素停止のパターニング強度の変化を定量化することによって行われる。このビデオに記載されているすべての実験は、適切な個人保護とプレキシガラスシールドを備えた認可された放射性職場で行われることに注意してください。

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発<em&gt; C。エレガンス</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

使用周囲粒子状物質によって誘発される染色体異常の解析<em&gt;インビトロ</em&gt;システム

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

体外乳腺上皮細胞の概日リズムを特徴付ける生物発光アッセイ

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

細胞を用いた多重 CRISPR ベース エンハンサー干渉エンハンサー機能の解剖

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...