Name: using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes
Uploaded: 2019-01-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Dette arbeidet ble gjort mulig ved NIH R01 tilskudd (NS094721, K.A.J.).

1. i Vitro figur
Merk: Protokollen er endret fra den publiserte protokollen1.
<ol><li>Forbereder malen RNA Merk: Malen for T7 transkripsjon ble bestilt som en syntetisk double-strandet DNA (dsDNA) og forsterket av enten innsetting en E. coli vektor som bærer en unik par av EcoRI/BamHI begrensning endonuclease nettsteder, som pET28a eller PCR. Protokollen for PCR forsterkning er illustrert nedenfor.<ol>
<l...

<ol>
	<li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+Quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>Trausch, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+diversity+in+the+SAM+clan+of+riboswitches.">Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).</li><li>Souliere, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+a+riboswitch+response+through+structural+extension+of+a+pseudoknot.">Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).</li><li>Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+Analysis+of+Small+RNAs+and+Riboswitches.">SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches.</a> Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+SHAPE+analysis+in+living+cells.">RNA SHAPE analysis in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).</li><li>Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+a+small-molecule+modulator+of+SMN2+splicing.">Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).</li><li>Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mn+2++-Sensing+Mechanisms+of+yybP-ykoY+Orphan+Riboswitches.">Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches.</a> Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).</li><li>Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+contacts+control+switching+of+the+SAM-I+riboswitch.">Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch.</a> Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).</li><li>Abulwerdi, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Small+Molecules+with+a+Noncanonical+Binding+Mode+to+HIV-1+Trans+Activation+Response+(TAR)+RNA.">Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).</li><li>Shortridge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrocyclic+Peptide+Ligand+Binds+the+Oncogenic+MicroRNA-21+Precursor+and+Suppresses+Dicer+Processing.">A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).</li><li>Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+targeting+RNA+with+drug-like+small+molecules.">Principles for targeting RNA with drug-like small molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+against+RNA+targets+attract+big+backers.">Small molecules against RNA targets attract big backers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).</li><li>Shortridge, M. D., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+based+approaches+for+targeting+non-coding+RNAs+with+small+molecules.">Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules.</a> Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).</li><li>Gallego, J., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RNA+with+Small-Molecule+Drugs:+Therapeutic+Promise+and+Chemical+Challenges.">Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).</li><li>Rizvi, N. F., Smith, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+small+molecule+druggable+target.">RNA as a small molecule druggable target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).</li><li>Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Role+of+RNA+as+a+Therapeutic+Target+for+Small+Molecules.">The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules.</a> Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).</li><li>Palacino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splice+modulators+enhance+U1-pre-mRNA+association+and+rescue+SMA+mice.">SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice.</a> Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).</li><li>Ratni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Risdiplam,+a+Selective+Survival+of+Motor+Neuron-2+(+SMN2+)+Gene+Splicing+Modifier+for+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy+(SMA).">Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA).</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).</li><li>Naryshkin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splicing+modifiers+improve+motor+function+and+longevity+in+mice+with+spinal+muscular+atrophy.">SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy.</a> Science. 345, (2014).</li><li>Chiriboga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+Evidence+for+Pharmacodynamics+Effects+of+RG7916+in+JEWELFISH,+a+Study+in+Patients+with+Spinal+Muscular+Atrophy+who+Previously+Participated+in+a+Study+with+Another+SMN2-Splicing+Targeting+Therapy+(S46.003).">Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003).</a> Neurology. 90, (2018).</li><li>Sivaramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+SMN2+pre-mRNA-protein+complex+elicits+specificity+for+small+molecule+splicing+modifiers.">Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SHAPE+reagents+for+mapping+RNA+structures+inside+living+cells.">Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells.</a> RNA. 23, 169-174 (2017).</li><li>Weeks, K. M., Mauger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+Structural+Codes+with+SHAPE+Chemistry.">Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).</li><li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+reveals+transcript-wide+interactions+,+complex+structural+domains+,+and+protein+interactions+across+the+Xist+lncRNA+in+living+cells.">SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).</li><li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+&#8242;+-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP)+for+direct+,+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis.">Selective 2 &#8242; -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes &amp; Development. 24, 1634-1644 (2010).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li><li>Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+SR+proteins+improves+SMN+expression+in+spinal+muscular+atrophy+cells.">Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells.</a> PloS One. 9, e115205 (2014).</li><li>Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+functional+implications+of+the+3D+architectures+of+viral+tRNA-like+structures.">Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures.</a> RNA. 15, 294-307 (2009).</li><li>Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+role+of+RNA+structure+in+alternative+splicing+of+a+critical+exon+in+the+spinal+muscular+atrophy+genes.">Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes.</a> Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).</li><li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy.">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).</li><li>Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+motif+discovery+by+SHAPE+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP).">RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP).</a> Nature Methods. 11, 959 (2014).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+Footprinting+to+Map+Sites+of+RNA-Protein+Interactions.">RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).</li><li>Velagapudi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+small+molecule+against+an+oncogenic+noncoding+RNA.">Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).</li><li>Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+NMR+to+structure+determination+of+RNAs+large+and+small.">Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).</li><li>Scott, L. G., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+determination+by+NMR.">RNA structure determination by NMR.</a> Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).</li></ol>

I vitro form er det avgjørende å bruke høykvalitets homogen RNA mal. T7 transkripsjon, men gir ofte heterogene sekvenser36. Spesielt er sekvenser med ±1 nukleotid på 3-terminus med ikke-ubetydelig gir36 vanligvis vanskelig å bli fjernet av polyakrylamid gel rensing. Heterogen RNA mal kan resultere i mer enn ett sett av signalet i sekvensering gel profilering av primer utvidelse produktet, som noen ganger gjør det vanskelig å tolke resultatet. Ribozyme på begge 5'- ...

Selektiv 2-hydroksyl acylation analysert av primer (SHAPE) er en metode for å måle the kinetics av hver nucleotide i en RNA sekvens av interesse og Klargjørende sekundære strukturen på enkelt-nukleotid løsning1. FIGUR metoder, begge i i vitro forhold2,3,4 (renset RNA i et definert buffer system) og i levende pattedyrceller5,6, er utviklet for å undersøke sekundære strukturen til middels lengde RNA sekvenser (vanligvis < 1000 nukleotider for i celle figur og < 200 nukleotider for i vitro figur). Det er spesielt nyttig å evaluere strukturelle endringer i reseptor RNA ved binding til RNA-samspill små molekyl metabolitter2,4,7,8 og studere mekanistisk handlinger målretting RNA molekyler i narkotika utvikling9,10.
RNA målretting stoffet funnet har nylig trukket oppmerksomheten i akademiske laboratorier og farmasøytisk industri11,12 via ulike tilnærminger og strategier13,14,15 ,16. Siste eksempler RNA målretting små molekyler for klinisk bruk på to strukturelt distinkte eksperimentelle narkotika, LMI-07017 og RG-791618,19, for spinal muskel atrofi (SMA), som viste lovende resultater i fase II kliniske studier20. Begge molekyler ble demonstrert for målet overlevelse av motor neuron (SMN) 2 pre-mRNA og regulere skjøting prosessen SMN2 genet6,17,21. Vi viste tidligere anvendelse av i vitro og i celle figur i en undersøkelse av målet RNA strukturelle endringer i nærvær av en analog av RG-7916 kjent som SMN-C26.
I prinsippet måler figur 2-OH acylation hver nucleotide i en RNA sekvens i nærvær av overflødig mengder en selv slukke acylation reagens på en saklig måte. Acylation reagensen er ikke stabil i vann, med en kort halveringstid av (f.eks T1/2 = 17 s 1-methyl-7-nitroisatoic anhydride; eller 1 M 7 ~ 20 min til 2-methylnicotinic acid imidazolide eller NAI)22 og insensitivitet identitet baser23. Dette resulterer i en mer gunstige acylation av 2-OH gruppene med fleksible baser, som kan forvandles til en nøyaktig vurdering av dynamikken i hver nucleotide. Spesielt er en nucleotide i en base-par vanligvis mindre reaktiv enn et kort til en 2-OH endring reagens, som NAI og 1 M 7.
Ser på kilden til malen RNA og hvor 2-OH acylation foregår, kan figur generelt kategoriseres i in vitro og i celle form. I vitro FIGUREN bruker renset T7 transkribert RNA og mangler en mobilnettet sammenheng i eksperimentell design. I celle form forekommer både RNA mal transkripsjon og 2-OH acylation i levende celler. resultatene kan derfor recapitulate RNA strukturelle modellen i en mobilnettet sammenheng. I celle FIGUREN har blitt referert til som vivo form for FIGUREN i levende celler i litteratur24. Siden dette eksperimentet ikke utføres i en dyr, kalte vi dette eksperimentet som i celle figur for nøyaktighet.
Strategier for primer forlengelsen stadium av in vitro og i celle FIGUREN er også forskjellig. I vitro form stopper omvendt transkripsjon på 2-OH acylation posisjon i nærvær av Mg2 +. Filtypen 32P-merket primer derfor vises som et band i polyakrylamid gel geleelektroforese (side) og intensiteten av bandet er proporsjonal med den acylation rate1. I celle form, omvendt transkripsjon genererer tilfeldige mutasjoner på 2-OH adduct posisjon i nærvær av Mn2 +. Mutational frekvensen av hver nucleotide kan bli slått av i dybden neste generasjons sekvensering, og FIGUREN reaktivitet med enkelt-nukleotid oppløsning kan deretter beregnes.
Et problem for i celle figur er lav signal-til-støy forholdet (dvs. et flertall av de 2-OH er uendret, mens uforandret sekvensene opptar mesteparten av lese i neste generasjons sekvensering). Nylig en metode for å berike 2-OH endret RNA, referert til som vivo klikker figur (icSHAPE), ble utviklet av Chang laboratorium25. Denne berikelse metoden kan være en fordel i å studere svak små molekyler som RNA samspill, spesielt i en transcriptome hele avhør.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>gBlock for &#62; 200 bp DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin gel and PCR clean-up kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaScript T7 transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1333</td>
			<td>Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TBE-urea sample buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow&#8482; Filter Unit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Safe dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 % TBE-urea mini-gel</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperscreen&#8482; Intensifying Screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1669</td>
			<td>calcium tungstate phosphor screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphor storage screen</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>BAS-IP MS 3543 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Typhoon</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAI (2M)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>03-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Contains 5X RT buffer, SuperScript IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddNTP set (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE27-2045-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>GD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Also contains RNase A and protease K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMN2 minigene34</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpLE</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca/ Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Also contains RW1, RPE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Contains DNase I and RDD buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>random nonamer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11904-018</td>
			<td>Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime pfx DNA polymerse</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12344024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucAway column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM10070</td>
			<td>for desalting purpose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes

Under stoffet utviklingen av RNA målretting små molekyler, er Klargjørende strukturelle endringer på deres samhandling med målet RNA sekvenser ønsket. Vi gi her et detaljert i vitro og i celle selektiv 2-hydroksyl acylation analysert av primer (SHAPE) protokollen for å studere RNA strukturelle endringen i nærvær av en eksperimentell narkotikabruk for spinal muskel atrofi (SMA), overlevelse av motoriske nervecellen (SMN)-C2, og i ekson 7 av pre-mRNA av SMN2 genet. I vitro form, er en RNA sekvens av 140 nukleotider inneholder SMN2 ekson 7 transkribert av T7 RNA polymerase, foldet i nærvær av SMN-C2 og senere endret av en mild 2-OH acylation reagens, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). Denne 2-OH-NAI adduct er videre undersøkt av en 32P-merket primer utvidelse og løses av polyakrylamid gel geleelektroforese (side). Omvendt, 2-OH acylation i i celle form foregår i situ med SMN-C2 bundet mobilnettet RNA i levende celler. Pre-mRNA sekvensen av ekson 7 i SMN2 genet, sammen med form-indusert mutasjoner i primer forlengelsen, ble deretter forsterkes av PCR med neste generasjons sekvensering. Sammenligne de to metodikkene, i vitro FIGUREN er en mer kostnadseffektiv metode og krever ikke kraften til å visualisere resultatene. Men avviker i vitro figur-avledet RNA modellen noen ganger fra den sekundære strukturen i en mobilnettet sammenheng, sannsynligvis på grunn av alle interaksjoner med RNA-bindende proteiner. I celle FIGUREN trenger ikke en radioaktivt materiale arbeidsplass og gir en mer nøyaktig RNA sekundære struktur i mobilnettet sammenheng. Videre i celle FIGUREN er vanligvis tilgjengelig for et større utvalg av RNA sekvenser (~ 1000 nukleotider) ved å benytte neste generasjons sekvensering, sammenlignet med i vitro form (~ 200 nukleotider) som vanligvis er avhengig av side analyse. I tilfelle av ekson 7 i SMN2 pre-mRNA, in vitro og i celle FIGUREN avledet er RNA modeller lik hverandre.

Vi viste tidligere at en RNA skjøting modulator, SMN-C2, samhandler med AGGAAG motiv på ekson 7 av SMN2 genet pre-mRNA, og brukte FORMEN for å vurdere RNA strukturelle endringer i nærvær av SMN-C26. Binding området av SMN-C2 er forskjellig fra den FDA-godkjent antisense oligonucleotide (ASO) for SMA, nusinersen, som binder og blokkerer intronic skjøting lyddemper (ISS) på intron 727,28 (<strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Detaljert protokoller for både in vitro og i celle selektiv 2-hydroksyl acylation analysert av primer forlengelsen (SHAPE) eksperimenter for å finne den sekundære strukturen i pre-mRNA sekvenser av interesse i nærvær av et RNA målretting små molekyl er presentert i denne artikkelen.

Bruke i Vitro og i celle form å undersøke små molekyl indusert Pre-mRNA strukturelle endringer

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Denne videoen vil gi detaljerte protokoller for in vitro-formeksperimenter for å bestemme den sekundære strukturen til RNA-sekvenser av interesse for tilstedeværelsen av et RNA-rettet mot lite molekyl. In vitro form er en kostnadseffektiv metode for å forstå dynamikken i hver nukleotid på en amino-størrelse RNA element som vanligvis er mindre enn 200 nukleotider. Etter å ha forberedt RNA-malen som beskrevet i manuskriptet, radioetikett omvendt transkripsjon primere ved å legge til en gamma 32P ATP, reversert transkripsjon primer.10XPNK reaksjonsbuffer, polynukleotidkinase og RNA's frie vann i et 1,7 milliliter mikrocentrifugerør i et totalt volum på 20 mikroliter. Deretter inkubere ved 37 grader Celsius i en time. Deretter aktiverer du prøvene i 20 minutter siden 65 grader Celsius og filtrerer deretter prøvene i en avsaltingskolonne og sentrifuge ved 1000 ganger G.Legg til 25 mikroliter 2XTBE urea prøvebuffer og blanding.Senk disse merkede produktene i en 10% akrylamidgel og sørg for å unngå blødning av radioaktiviteten i de øverste reservoarene. Kjør gelen på 20 watt i en time. Etter løpet, fjern glassplatene på gelkassetten.Legg gelen på plastfolie. Brett plasten på toppen av gelen for å lage en lufttett sandwich. Legg gelsmørbrødet på en kalsium-tungstate fosforskjerm og utsett med et innbilt instrument.Bilde gelen igjen med vanlig lys for å vite hvor kantene på gelen er. Bruk en bildebehandlingsprogramvare til å legge over de to bildene og legge over de lyse og mørke bildene. Gjør deretter det øverste bildet litt ugjennomsiktig for å se begge bildene samtidig.Kontroller at det trykte bildet har samme størrelse som den faktiske gelen. Juster deretter gelen på det trykte bildet. Til slutt, bruk et sterilisert barberblad for å kutte de ønskede svingene ut av gelen og legg hvert stykke gel i et separat 1,7 milliliter mikrocentrifugerør.For å gjenopprette DNA fra gelskiven ved passiv elitning, tilsett 0,3 milliliter elution nedbør blanding til hver 1,7 milliliter rør. Inkuber rørene i en radioaktiv-sikker beholder på en rotator ved fire grader Celsius i 16 timer. Etter inkubasjon, overfør væsken til et nytt 1,7 milliliter rør.Tilsett 2,5x iskald 200 bevis etanol og inverter rørene seks ganger for å blande væsken. Inkuber rørene ved minus 80 grader Celsius i minst en time. Etter sentrifugering på 10, 000g og fire grader Celsius i 10 minutter, fjern supernatanten nøye ved pipettering.Tilsett en milliliter 80% etanol for å vaske pelleten. Vortex i 15 sekunder og sentrifuge igjen under samme forhold. Etter å ha fjernet det overnaturlige ved å pipettering, lufttørke DNA-pelleten i fem minutter.Tilsett 50 mikroliter av RNA's frie vann og bland ved å pipetter opp og ned 10 ganger. Normaliser DNA-konsentrasjonen til ca. 100 000 tellinger per minutt per mikroliter i en scintillasjonsteller. For å forberede fire prøver for kjemisk modifisering, tilsett åtte picomoler av RNA i 32 mikroliter på 0,5 XTE-buffer til et 1,7 milliliter mikrocentrifugerør.Varm på 80 grader Celsius i to minutter og klikk kjølig på is i minst ett minutt. Tilsett deretter åtte mikroliter med 5x foldeblanding, bland en tildele ni mikroliter av denne RNA-blandingen i hver av de fire PCR-rørene, merket fra en til fire. Tilsett en mikroliter på 10% DMSO i røret merket som en, en mikroliter konsentrert liten molekylløsning i rør to, en mikroliter fortynnet liten molekylløsning i rør tre og en mikroliter vann i rør fire.Inkuber alle PCR-rør ved 37 grader Celsius i en termisk cycler i 30 minutter. Rett før de to viktigste OH-modifikasjonsreaksjonene fortynnes en mikroliter med to molar NAI-lageroppløsning i tre mikroliter av DEPC-behandlet vann for å gi en 0,5 molararbeidsløsning. Legg umiddelbart til en mikroliter av denne løsningen i rør en, to og tre.Legg til en mikroliter på 25% DMSO i rør fire og inkuber i en termisk cycler ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Forbered fire friske 1,7 milliliter mikrocentrifuge rør og tilsett 100 mikroliter av elution nedbør blanding og to mikroliter glykogen til hvert rør. Deretter overføres deretter inn i hvert av disse rørene all væske fra de tilsvarende PCR-rørene.Tilsett 0,34 milliliter iskaldt 200-bevis etanol i hvert rør og bland ved å virvle i fem sekunder. Plasser rørene i en minus 80 grader Celsius fryser i minst en time. Deretter sentrifugere rørene i 15 minutter ved 14 000 ganger G ved fire grader Celsius.Uten å forstyrre RNA pellet, fjern supernatant fra hvert rør. Tilsett 0,5 milliliter med 80% etanol per rør for å vaske RNA pellet og vortex i 15 sekunder. Etter sentrifugering på samme forhold igjen, fjern supernatant og lufttørking RNA pellet i fem minutter.Tilsett ni mikroliter av RNA's frie vann og rør som opp og ned 10 ganger for å blande. Overfør den modifiserte RNA til fire nye PCR-rør og merk dem en til fire som i forrige trinn. Tilsett to picomoler av RNA i syv mikroliter dePC-behandlet vann til hver av fire ekstra PCR-rør og merk dem med tallene fem til åtte.Legg til to mikroliter av den gjenopprettede radiomerkede primeren til hver av de åtte PCR-rørene merket en til åtte. Etter oppvarming ved 65 grader Celsius i fem minutter, umiddelbart avkjøles til fire grader Celsius i termisk cycler. Legg til fire mikroliter med 5x RT-buffer, en mikroliter på 0,1 molar DTT og ett mikroliter DNTP-miks til hvert av rørene.Tilsett deretter to mikroliter dePC-behandlet vann til rørene en til fire. Tilsett fire mikroliter med fem millimolar ddATP til rør fem, fire mikroliter på fem millimolar ddTTP til rør seks og fire mikroliter på fem millimolar ddCTP til rør syv og en mikroliter på fem millimolar ddGTP og tre mikroliter depc-behandlet vann til rør åtte og pipette fire ganger for å blande. Etter oppvarming av alle PCR-rørene ved 52 grader Celsius i ett minutt i en termisk cycler, legg til en mikroliter omvendt transkripsjon til hvert rør og rør det opp og ned fire ganger for å blande.Inkuber reaksjonene ved 52 grader Celsius i 20 minutter i den termiske cycleren. For å hydrolysere RNA, tilsett en mikroliter med fem molarnatriumhydroksid i hvert av rørene og varme dem ved 95 grader Celsius i fem minutter. Tilsett deretter fem mikroliter av en molarsyre for å nøytralisere reaksjonen og gjenta etanolnedbøren som tidligere beskrevet.Etter lufttørking av DNA-pelleten i fem minutter, tilsett 10 mikroliter vann og 10 mikroliter 2xTBE urea prøvelastbuffer i 1,7 milliliter rør og rør den opp og ned 10 ganger for å pusse opp. Varm prøvene ved 70 grader Celsius i fem minutter, og plasser deretter rørene på is, før du laster på gelen. Legg 10 mikroliter av prøven som er plassert på is på 8% polyakrylamid sekvensering gel.Kjør gelen på 65 watt i to timer eller til det nederste fargestoffet når 3/4ths av gelen. Fjern avstandssylet og sett forsiktig inn en slikkepott for å fjerne den øverste silikoniserte glassplaten. Dekk gelen med et stykke stort filterpapir og trykk forsiktig for å la gelen feste seg til filterpapiret.Fra bunnen av løfter du filterpapiret og fjerner gelen fra glassplaten sammen med papiret. Etter å ha overført gelen til et innpakningspapir som tidligere gjort, tørk den ved 70 grader Celsius i en time med vakuum, og sørg for å bruke flere filterpapirer mellom gelen og tørketrommelen. Overfør gelsmørbrødet til en fotobleket fosforlagringsskjermkassett og utsett gelens radioaktivitet til skjermen i fire til 16 timer.Til slutt plasserer du fosforlagringsskjermen på en bildeenhet og skanner med middels oppløsning i ca. 30 minutter. Etter å ha eksponert polyakrylamidsekvenseringsgelen til fosforlagringsskjermen, viste et vellykket figureksperiment en enkelt og mest intens bøyning på toppen av gelen og bøyer seg gjennom gelen ved enkelt nukleotidoppløsning uten smøring. Gelen viste også at intensiteten av noen svinger endret seg i nærvær av små molekyler, noe som indikerer endringer av baseparingsstyrke.Et vanlig problem i sideanalyse er at et smøreområde kjent som saltfronten kan vises midt i gelen, sannsynligvis på grunn av høy konsentrasjon av salt, DMSO eller annet uønsket stoff i lasteprøven. Det kan unngås ved å fjerne det uønskede stoffet ved etanolnedbør. En homogen RNA-mal er å foretrekke for in vitro-form.Vi bruker ribosomer på både fem prime og tre prime ender for å oppnå en slik RNA. In-cell form kan også utføres for å få RNA sekundær struktur i mobilkonteksten. Husk at in vitro-formen ikke kan rekafulere in vivo RNA-bindingsproteininteraksjoner.In vitro form er en kraftig metode for å oppdage endringer i RNA struktur på grunn av tilstedeværelsen av et lite molekyl. Dette gjøres ved å kvantifisere endringer i mønsterstyrken til omvendt transkripsjonsstopp. Vær forsiktig med at alle eksperimenter som er beskrevet i denne videoen, utføres på en autorisert radioaktiv arbeidsplass med passende personlig beskyttelse og plexiglassskjerming.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenese Bruke Histone-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analyse av Ambient Svevestøv-indusert kromosomavvik ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescens analysen som karakteriserer døgnrytmen i Mammary epitelceller

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Analyse i sanntid av transkripsjon faktor bindende, transkripsjon, oversettelse og omsetning vise globale hendelser under aktivering

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

En Optogenetic metode for å styre og analysere Gene Expression mønstre i celle til celle interaksjoner

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Ett molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyse i spirende gjær vegetativ vekst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Disseksjon Enhancer funksjon med Multiplex CRISPR-baserte Enhancer forstyrrelser i linjer

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse av Alternative Pre-mRNA skjøting i musen hjernen inndelinger ved hjelp av RNA i Situ hybridisering analysen

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...