Name: using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes
Uploaded: 2019-01-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Este trabalho foi feito possível pela subvenção R01 NIH (NS094721, K.A.J.).

1. em forma de Vitro
Nota: O protocolo é modificado no protocolo publicado1.
<ol><li>Preparar o modelo de RNA Nota: O modelo para a transcrição de T7 foi ordenado como sintético double-stranded DNA (dsDNA) e amplificado por qualquer inserção em um vetor de Escherichia coli que carrega um único par de sites de endonuclease de restrição EcoRI/BamHI, tais como pET28a, ou pelo PCR. O protocolo para am...

<ol>
	<li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+Quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>Trausch, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+diversity+in+the+SAM+clan+of+riboswitches.">Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).</li><li>Souliere, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+a+riboswitch+response+through+structural+extension+of+a+pseudoknot.">Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).</li><li>Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+Analysis+of+Small+RNAs+and+Riboswitches.">SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches.</a> Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+SHAPE+analysis+in+living+cells.">RNA SHAPE analysis in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).</li><li>Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+a+small-molecule+modulator+of+SMN2+splicing.">Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).</li><li>Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mn+2++-Sensing+Mechanisms+of+yybP-ykoY+Orphan+Riboswitches.">Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches.</a> Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).</li><li>Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+contacts+control+switching+of+the+SAM-I+riboswitch.">Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch.</a> Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).</li><li>Abulwerdi, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Small+Molecules+with+a+Noncanonical+Binding+Mode+to+HIV-1+Trans+Activation+Response+(TAR)+RNA.">Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).</li><li>Shortridge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrocyclic+Peptide+Ligand+Binds+the+Oncogenic+MicroRNA-21+Precursor+and+Suppresses+Dicer+Processing.">A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).</li><li>Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+targeting+RNA+with+drug-like+small+molecules.">Principles for targeting RNA with drug-like small molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+against+RNA+targets+attract+big+backers.">Small molecules against RNA targets attract big backers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).</li><li>Shortridge, M. D., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+based+approaches+for+targeting+non-coding+RNAs+with+small+molecules.">Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules.</a> Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).</li><li>Gallego, J., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RNA+with+Small-Molecule+Drugs:+Therapeutic+Promise+and+Chemical+Challenges.">Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).</li><li>Rizvi, N. F., Smith, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+small+molecule+druggable+target.">RNA as a small molecule druggable target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).</li><li>Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Role+of+RNA+as+a+Therapeutic+Target+for+Small+Molecules.">The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules.</a> Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).</li><li>Palacino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splice+modulators+enhance+U1-pre-mRNA+association+and+rescue+SMA+mice.">SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice.</a> Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).</li><li>Ratni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Risdiplam,+a+Selective+Survival+of+Motor+Neuron-2+(+SMN2+)+Gene+Splicing+Modifier+for+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy+(SMA).">Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA).</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).</li><li>Naryshkin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splicing+modifiers+improve+motor+function+and+longevity+in+mice+with+spinal+muscular+atrophy.">SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy.</a> Science. 345, (2014).</li><li>Chiriboga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+Evidence+for+Pharmacodynamics+Effects+of+RG7916+in+JEWELFISH,+a+Study+in+Patients+with+Spinal+Muscular+Atrophy+who+Previously+Participated+in+a+Study+with+Another+SMN2-Splicing+Targeting+Therapy+(S46.003).">Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003).</a> Neurology. 90, (2018).</li><li>Sivaramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+SMN2+pre-mRNA-protein+complex+elicits+specificity+for+small+molecule+splicing+modifiers.">Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SHAPE+reagents+for+mapping+RNA+structures+inside+living+cells.">Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells.</a> RNA. 23, 169-174 (2017).</li><li>Weeks, K. M., Mauger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+Structural+Codes+with+SHAPE+Chemistry.">Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).</li><li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+reveals+transcript-wide+interactions+,+complex+structural+domains+,+and+protein+interactions+across+the+Xist+lncRNA+in+living+cells.">SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).</li><li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+&#8242;+-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP)+for+direct+,+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis.">Selective 2 &#8242; -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes &amp; Development. 24, 1634-1644 (2010).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li><li>Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+SR+proteins+improves+SMN+expression+in+spinal+muscular+atrophy+cells.">Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells.</a> PloS One. 9, e115205 (2014).</li><li>Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+functional+implications+of+the+3D+architectures+of+viral+tRNA-like+structures.">Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures.</a> RNA. 15, 294-307 (2009).</li><li>Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+role+of+RNA+structure+in+alternative+splicing+of+a+critical+exon+in+the+spinal+muscular+atrophy+genes.">Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes.</a> Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).</li><li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy.">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).</li><li>Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+motif+discovery+by+SHAPE+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP).">RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP).</a> Nature Methods. 11, 959 (2014).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+Footprinting+to+Map+Sites+of+RNA-Protein+Interactions.">RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).</li><li>Velagapudi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+small+molecule+against+an+oncogenic+noncoding+RNA.">Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).</li><li>Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+NMR+to+structure+determination+of+RNAs+large+and+small.">Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).</li><li>Scott, L. G., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+determination+by+NMR.">RNA structure determination by NMR.</a> Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).</li></ol>

Em forma in vitro, é fundamental usar modelo de RNA homogêneo de alta qualidade. Transcrição de T7, no entanto, muitas vezes produz sequências heterogêneas36. Especialmente, sequências com ± 1 nucleotídeo no 3'-terminal com rendimentos não negligenciável36 são geralmente difícil de ser removido pela purificação do gel de polyacrylamide. Modelo de RNA heterogêneo pode resultar em mais de um conjunto do sinal no gel de sequenciamento perfil do produto extensã...

Seletiva 2'-hidroxila acilação analisada pela extensão da primeira demão (SHAPE) é um método de medir a cinética de cada nucleotídeo em uma sequência de RNA de interesse e elucidação da estrutura secundária em single-nucleotide resolução1. Metodologias de forma, tanto em condições in vitro2,3,4 (RNA purificado em um sistema de buffer definido) e em5,de células de mamíferos vivos6, foram desenvolvidos para investigar o secundário estrutura de sequências de comprimento médio do RNA (tipicamente < 1.000 nucleotídeos para a forma na célula e < 200 nucleotídeos para a forma in vitro). É particularmente útil para avaliar alterações estruturais no receptor RNA mediante ligação a RNA-interagindo pequena molécula metabolitos2,4,7,8 e estudar ações mecanicistas de moléculas de RNA-direcionamento durante o desenvolvimento de drogas9,10.
RNA-direcionamento de fármacos recentemente chamou a atenção nos laboratórios acadêmicos e a indústria farmacêutica11,12 através de diferentes abordagens e estratégias de14,13,15 ,16. Exemplos recentes de pequenas moléculas de RNA-direcionamento para uso clínico incluem duas drogas experimentais estruturalmente distintas, LMI-07017 e18,RG-791619, para a atrofia muscular espinhal (SMA), que mostrou-se promissora resultados na fase de ensaios clínicos II20. Ambas as moléculas foram demonstrou à sobrevivência de alvo de motor neuron (SMN) 2 pre-mRNA e regular o processo de emenda do SMN2 gene6,17,21. Temos demonstrado anteriormente a aplicação da in vitro e na célula forma um exame das mudanças estruturais na presença de um análogo de RG-7916 conhecido como SMN-C26alvo do RNA.
Em princípio, a forma mede a taxa de acilação de 2'-OH de cada nucleotídeo de uma sequência de RNA na presença de quantidades em excesso de um reagente de acilação Self têmpera de forma imparcial. O reagente de acilação não é estável em água, com uma meia-vida curta de (por exemplo, T1/2 = 17 s para anidrido de 1-metil-7-nitroisatoic; ou 1 M 7, ~ 20 min para imidazolide de ácido 2-methylnicotinic, ou NAI)22 e insensibilidade à identidade da as bases de23. Isso resulta em uma acilação mais favorável dos grupos de bases flexíveis, que podem ser transformados em uma avaliação correcta da dinâmica de cada nucleotídeo 2'-OH. Especificamente, um nucleotídeo em um par de base é geralmente menos reativo do que um não pareado com um reagente modificando 2'-OH, tais como NAI e 1 M 7.
Olhando para a fonte do modelo de RNA e onde ocorre a acilação de 2'-OH, forma geralmente pode ser categorizada em forma in vitro e na célula. Em usos de vitro forma purificada T7 transcrito de RNA e não possui um contexto celular em projetos experimentais. Em forma na célula, a transcrição de modelo de RNA e a acilação de 2'-OH ocorrerem dentro de células vivas; Portanto, os resultados podem recapitular o modelo estrutural de RNA em um contexto celular. Na célula forma tem sido referida como vivo de forma para forma transportada em células vivas, na literatura24. Desde que esta experiência não é executada em um animal, nós denominado esta experiência como forma na célula para a exatidão.
As estratégias para a fase de extensão da primeira demão de forma in vitro e na célula também são diferentes. Em forma in vitro, a transcrição reversa para na posição 2'-OH acilação, na presença de Mg2 +. Uma extensão da primeira demão de 32P-rotulados, portanto, aparece como uma banda em eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e a intensidade da banda é proporcional à taxa de acilação1. Em forma na célula, a transcrição reversa gera mutações aleatórias para o 2'-OH aduto posição na presença de Mn2 +. A taxa mutacional de cada nucleotídeo pode ser capturada no sequenciamento de próxima geração de profundidade, e a reatividade de forma em single-nucleotide resolução pode então ser calculada.
Um problema potencial para a forma na célula é a baixa relação sinal-ruído (isto é, a maioria dos grupos 2'-OH é inalterada, enquanto as sequências não modificadas ocupam a maioria da leitura na próxima geração sequenciamento). Recentemente, um método para enriquecer o 2'-OH modificado do RNA, referidos como vivo clique em forma (icSHAPE), foi desenvolvido pelo laboratório Chang25. Este método de enriquecimento pode ser vantajoso no estudo fracas moléculas pequenas tais como interações RNA, especialmente em um interrogatório de transcriptoma-largo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>gBlock for &#62; 200 bp DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin gel and PCR clean-up kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaScript T7 transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1333</td>
			<td>Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TBE-urea sample buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow&#8482; Filter Unit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Safe dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 % TBE-urea mini-gel</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperscreen&#8482; Intensifying Screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1669</td>
			<td>calcium tungstate phosphor screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphor storage screen</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>BAS-IP MS 3543 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Typhoon</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAI (2M)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>03-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Contains 5X RT buffer, SuperScript IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddNTP set (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE27-2045-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>GD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Also contains RNase A and protease K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMN2 minigene34</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpLE</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca/ Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Also contains RW1, RPE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Contains DNase I and RDD buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>random nonamer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11904-018</td>
			<td>Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime pfx DNA polymerse</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12344024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucAway column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM10070</td>
			<td>for desalting purpose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes

No processo de desenvolvimento de drogas de RNA-direcionamento de pequenas moléculas, elucidar as mudanças estruturais em suas interações com sequências de RNA alvo é desejado. Aqui oferecemos uma detalhada em vitro e na célula seletiva 2'-hidroxila acilação analisados pela extensão da primeira demão protocolo (forma) para estudar a mudança estrutural de RNA na presença de uma droga experimental para a atrofia muscular espinhal (SMA), sobrevivência de motor neuron (SMN)-C2 e no exon 7 do pre-mRNA do gene SMN2. Em forma in vitro, uma sequência de RNA de 140 nucleotídeos contendo SMN2 exon 7 é transcrito por T7 RNA polimerase, dobrada na presença de SMN-C2 e posteriormente modificada por um reagente de acilação leve 2'-OH, imidazolide de ácido 2-methylnicotinic (NAI). Este aduto de 2'-OH-NAI é mais sondado por um 32extensão da primeira demão P-etiquetadas e resolvido por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Por outro lado, 2'-OH acilação em forma na célula ocorre in situ com RNA celular SMN-C2 vinculado em pilhas vivas. A sequência de pre-mRNA do exon 7 no gene SMN2, juntamente com mutações induzida por forma a extensão da primeira demão, então foi amplificada por PCR e sujeitos a próxima geração sequenciamento. Comparando as duas metodologias, forma in vitro é um método mais econômico e não exige poder computacional para visualizar os resultados. No entanto, o modelo de SHAPE-derivado de RNA in vitro às vezes difere da estrutura secundária em um contexto de celular, provavelmente devido à perda de todas as interações com proteínas RNA-obrigatórias. Na célula forma não precisa de um material radioativo no local de trabalho e produz uma estrutura secundária mais precisa de RNA no contexto celular. Além disso, a forma na célula é geralmente aplicável para uma maior sequências de gama de RNA (~ 1.000 nucleotídeos) utilizando o sequenciamento de próxima geração, em comparação com in vitro da forma (~ 200 nucleotídeos) que geralmente se baseia na análise de página. No caso do exon 7 em SMN2 pre-mRNA, a in vitro e na célula forma derivada modelos de RNA são semelhantes entre si.

Demonstramos anteriormente que um RNA splicing modulador, SMN-C2, interage com motivo AGGAAG no exon 7 do pre-mRNA do gene SMN2 e usado de forma a avaliar as alterações estruturais do RNA na presença de SMN-C26. O sítio de ligação do SMN-C2 é distinto do FDA-aprovado antisentido do oligonucleotide (ASO) para SMA, nusinersen, que se liga e bloqueia o silenciador emenda intrônicas (ISS) na intron 727,28</su...

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Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

São protocolos detalhados para ambos in vitro e na célula seletiva 2'-hidroxila acilação analisados por experiências de extensão (forma) da primeira demão para determinar a estrutura secundária das sequências pre-mRNA de interesse na presença de uma pequena molécula de RNA-direcionamento apresentada neste artigo.

Usando em forma de Vitro e na célula para investigar a pequena molécula induzida por alterações estruturais Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Este vídeo fornecerá protocolos detalhados para experimentos de forma in vitro para determinar a estrutura secundária de sequências de RNA de interesse na presença de um RNA direcionado a pequenas moléculas. A forma in vitro é um método econômico para entender a dinâmica de cada nucleotídeo em um elemento RNA do tamanho de amino, que geralmente é inferior a 200 nucleotídeos. Depois de preparar o modelo de RNA como descrito no manuscrito, primers de transcrição reversa de rótulo de rádio adicionando um ATP gama 32P, primer de transcrição invertida.Tampão de reação 10XPNK, quinase de polinucleotídeo e água livre do RNA em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro em um volume total de 20 microlitures. Em seguida, incubar a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, ative as amostras por 20 minutos a partir de 65 graus Celsius e, em seguida, filtrar as amostras em uma coluna de dessatar e centrífuga a 1000 vezes G.Adicione 25 microliters de 2XTBE ure sample buffer e mix.Abaixe esses produtos rotulados em um gel de acrilamida de 10% e certifique-se de evitar sangrar a radioatividade nos reservatórios superiores. Execute o gel a 20 watts por uma hora. Após a corrida, remova as placas de vidro do de gel.Coloque o gel no pedaço de plástico. Dobre o plástico na parte superior do gel para fazer um sanduíche com ar apertado. Coloque o sanduíche de gel em uma tela de fósforo de cálcio e exponha com um instrumento de imaginação.Imagem do gel novamente com luz regular para saber onde estão as bordas do gel. Use um software de processamento de imagem para sobrepor as duas imagens e sobrepor as imagens claras e escuras. Em seguida, faça a imagem superior ligeiramente opaca para ver ambas as imagens simultaneamente.Certifique-se de que a imagem impressa tenha o mesmo tamanho do gel real. Em seguida, alinhe o gel na imagem impressa. Por fim, use uma lâmina de barbear esterilizada para cortar as curvas desejadas do gel e coloque cada pedaço de gel em um tubo de microcentrifuge separado de 1,7 mililitro.Para recuperar o DNA da fatia de gel por eluição passiva, adicione 0,3 mililitros de mistura de precipitação de eluição a cada tubo de 1,7 mililitro. Incubar os tubos em um recipiente de segurança radioativa em uma rotadora a quatro graus Celsius por 16 horas. Após a incubação, transfira o líquido para um novo tubo de 1,7 mililitro.Adicione 2,5x de etanol gelado 200 à prova e inverta os tubos seis vezes para misturar o líquido. Incubar os tubos a menos 80 graus Celsius por um mínimo de uma hora. Depois de centrifugar a 10.000g e quatro graus Celsius por 10 minutos, remova o sobrenatante cuidadosamente por pipetação.Adicione um mililitro de 80% de etanol para lavar a pelota. Vórtice por 15 segundos e centrífuga novamente sob as mesmas condições. Depois de remover o supernatante por pipetação, seque a pelota de DNA por cinco minutos.Adicione 50 microliters da água livre do RNA e misture por tubulação para cima e para baixo 10 vezes. Normalize a concentração de DNA para cerca de 100.000 contagens por minuto por microliter em um balcão de cintilação. Para preparar quatro amostras para modificação química, adicione oito picomoles de RNA em 32 microliters de 0,5 XTE tampão a um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro.Aqueça a 80 graus Celsius por dois minutos e esfrie no gelo por pelo menos um minuto. Em seguida, adicione oito microliters de mistura dobrável de 5x, misture nove microliters desta mistura de RNA em cada um dos quatro tubos PCR, rotulados de um a quatro. Adicione um microliter de 10% DMSO no tubo marcado como um, um microliter de solução concentrada de pequenas moléculas no tubo dois, um microliter de solução de molécula pequena diluída no tubo três e um microliter de água no tubo quatro.Incubar todos os tubos PCR a 37 graus Celsius em um cicloviário térmico por 30 minutos. Logo antes da reação de modificação oh principal, diluir um microliter de duas soluções molar nai em três microliters de água tratada com DEPC para produzir uma solução de trabalho molar 0,5. Adicione imediatamente um microliter desta solução nos tubos um, dois e três.Adicione um microliter de 25% DMSO no tubo quatro e incubar em um cicloviário térmico a 37 graus Celsius por 15 minutos. Prepare quatro tubos frescos de microcentrífa de 1,7 mililitro e adicione 100 microliters de mistura de precipitação de eluição e dois microliters de glicogênio a cada tubo. Em seguida, em cada um desses tubos transfira todo o líquido dos tubos PCR correspondentes.Adicione 0,34 mililitros de etanol à prova de gelo 200 em cada tubo e misture por vórtice por cinco segundos. Coloque os tubos em um congelador de menos 80 graus Celsius por pelo menos uma hora. Em seguida, centrifugar os tubos por 15 minutos a 14.000 vezes G a quatro graus Celsius.Sem perturbar a pelota de RNA, remova o supernatante de cada tubo. Adicione 0,5 mililitros de 80% de etanol por tubo para lavar a pelota de RNA e o vórtice por 15 segundos. Depois de centrifuging nas mesmas condições novamente, remova o sobrenasce e seque a pelota de RNA por cinco minutos.Adicione nove microliters de água livre do RNA e tubo que sobe e desce 10 vezes para misturar. Transfira o RNA modificado para quatro novos tubos PCR e rotule-os de um a quatro como na etapa anterior. Adicione dois picomoles de RNA em sete microliters de água tratada com DEPC a cada um dos quatro tubos pcr adicionais e rotule-os com números de cinco a oito.Adicione dois microliters do primer radiolabeled recuperado a cada um dos oito tubos PCR marcados de um a oito. Depois de aquecer a 65 graus Celsius por cinco minutos, esfrie imediatamente até quatro graus Celsius no cicloviário térmico. Adicione quatro microliters de tampão 5x RT, um microliter de 0,1 molar DTT e um microliter de mistura DNTP a cada um dos tubos.Em seguida, adicione dois microliters de água tratada com DEPC aos tubos de um a quatro. Adicione quatro microliters de cinco mililitros ddATP ao tubo cinco, quatro microliters de cinco mililitros ddTTP ao tubo seis e quatro microliters de cinco milimolar ddCTP ao tubo sete e um microliter de cinco mililitros ddGTP e três microliters de água tratada de DEPC para tubo oito e pipeta quatro vezes para misturar. Depois de aquecer todos os tubos PCR a 52 graus Celsius por um minuto em um ciclor térmico, adicione um microliter de transcriptase reversa a cada tubo e tubo-o para cima e para baixo quatro vezes para misturar.Incubar as reações a 52 graus Celsius por 20 minutos no cicloviário térmico. Para hidrolisar o RNA, adicione um microliter de cinco hidróxido de sódio molar em cada um dos tubos e aqueça-os a 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione cinco microliters de um ácido clorídrico molar para neutralizar a reação e repetir a precipitação do etanol como descrito anteriormente.Depois de secar o dna por cinco minutos, adicione 10 microlitres de água e 10 microlitres de 2xTBE ureia amostra de 3000 em tubos de 1,7 mililitros e tubo-lo para cima e para baixo 10 vezes para redissolve. Aqueça as amostras a 70 graus Celsius por cinco minutos, depois coloque os tubos no gelo, antes de carregar no gel. Carregue 10 microliters da amostra que foi colocada no gelo em gel de sequenciamento de poliacrilamida de 8%.Execute o gel a 65 watts por duas horas ou até que o corante inferior atinja os 3/4 do gel. Remova o espaçador e insira delicadamente uma espátula para remover a placa de vidro silicone superior. Cubra o gel com um pedaço de papel filtro grande e pressione suavemente para permitir que o gel adere ao papel do filtro.A partir da extremidade inferior, levante o papel do filtro e remova o gel da placa de vidro junto com o papel. Depois de transferir o gel para um papel de embrulho como feito anteriormente, seque-o a 70 graus Celsius por uma hora com um vácuo, certificando-se de usar vários papéis de filtro entre o gel e a secadora. Transfira o sanduíche de gel para um de tela de armazenamento de fósforo foto-branqueado e exponha a radioatividade do gel para a tela por quatro a 16 horas.Por fim, coloque a tela de armazenamento de fósforo em um dispositivo de imagem e escaneie com resolução média por aproximadamente 30 minutos. Depois de expor o gel de sequenciamento de poliacrilamida à tela de armazenamento de fósforo, um experimento de forma bem sucedido mostrou uma única e mais intensa curva na parte superior do gel e dobra ao longo do gel em resolução de nucleotídeo único sem difamação. O gel também mostrou que a intensidade de algumas curvas mudou na presença de pequenas moléculas, indicando mudanças na força de emparelhamento da base.Um problema comum na análise da página é que uma região de difamação conhecida como frente de sal pode aparecer no meio do gel, provavelmente devido à alta concentração de sal, DMSO ou outra substância indesejada na amostra de carregamento. Isso pode ser evitado removendo a substância indesejada por precipitação de etanol. Um modelo de RNA homogêneo é preferível para forma in vitro.Usamos ribossomos em cinco prime e três extremidades primos para obter tal RNA. A forma em células também pode ser realizada para obter estrutura secundária de RNA no contexto celular. Lembre-se, a forma in vitro pode não recapitular interações proteicas de ligação vivo RNA.A forma in vitro é um método poderoso para detectar alterações na estrutura do RNA devido à presença de uma pequena molécula. Isso é feito quantificando mudanças na força de padronização das paradas de transcriptase reversa. Tenha cuidado para que todos os experimentos descritos neste vídeo sejam realizados em um local de trabalho radioativo autorizado com proteção pessoal adequada e blindagem de plexiglass.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Genética

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Análise da aberrações cromossômicas induzidas Matéria Ambient Particulate Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Ensaio de bioluminescência para caracterizar o ritmo circadiano em células epiteliais mamárias

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Um método de Optogenetic para controlar e analisar os padrões de expressão de Gene em interações de célula para célula

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissecação do Enhancer função usando interferência Multiplex Enhancer CRISPR-baseado em linhas de células

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...