Name: using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes
Uploaded: 2019-01-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Эта работа стало возможным благодаря НИЗ R01 Грант (NS094721, K.A.J.).

1. в Vitro форму
Примечание: Протокол изменяется от опубликованного протокола1.
<ol><li>Подготовка шаблона РНК Примечание: Шаблон для транскрипции T7 было приказано как синтетическим двуцепочечной ДНК (dsDNA) и усиливается либо вставки в ...

<ol>
	<li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+Quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>Trausch, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+diversity+in+the+SAM+clan+of+riboswitches.">Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).</li><li>Souliere, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+a+riboswitch+response+through+structural+extension+of+a+pseudoknot.">Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).</li><li>Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+Analysis+of+Small+RNAs+and+Riboswitches.">SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches.</a> Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+SHAPE+analysis+in+living+cells.">RNA SHAPE analysis in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).</li><li>Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+a+small-molecule+modulator+of+SMN2+splicing.">Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).</li><li>Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mn+2++-Sensing+Mechanisms+of+yybP-ykoY+Orphan+Riboswitches.">Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches.</a> Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).</li><li>Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+contacts+control+switching+of+the+SAM-I+riboswitch.">Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch.</a> Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).</li><li>Abulwerdi, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Small+Molecules+with+a+Noncanonical+Binding+Mode+to+HIV-1+Trans+Activation+Response+(TAR)+RNA.">Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).</li><li>Shortridge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrocyclic+Peptide+Ligand+Binds+the+Oncogenic+MicroRNA-21+Precursor+and+Suppresses+Dicer+Processing.">A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).</li><li>Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+targeting+RNA+with+drug-like+small+molecules.">Principles for targeting RNA with drug-like small molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+against+RNA+targets+attract+big+backers.">Small molecules against RNA targets attract big backers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).</li><li>Shortridge, M. D., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+based+approaches+for+targeting+non-coding+RNAs+with+small+molecules.">Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules.</a> Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).</li><li>Gallego, J., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RNA+with+Small-Molecule+Drugs:+Therapeutic+Promise+and+Chemical+Challenges.">Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).</li><li>Rizvi, N. F., Smith, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+small+molecule+druggable+target.">RNA as a small molecule druggable target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).</li><li>Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Role+of+RNA+as+a+Therapeutic+Target+for+Small+Molecules.">The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules.</a> Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).</li><li>Palacino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splice+modulators+enhance+U1-pre-mRNA+association+and+rescue+SMA+mice.">SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice.</a> Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).</li><li>Ratni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Risdiplam,+a+Selective+Survival+of+Motor+Neuron-2+(+SMN2+)+Gene+Splicing+Modifier+for+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy+(SMA).">Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA).</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).</li><li>Naryshkin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splicing+modifiers+improve+motor+function+and+longevity+in+mice+with+spinal+muscular+atrophy.">SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy.</a> Science. 345, (2014).</li><li>Chiriboga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+Evidence+for+Pharmacodynamics+Effects+of+RG7916+in+JEWELFISH,+a+Study+in+Patients+with+Spinal+Muscular+Atrophy+who+Previously+Participated+in+a+Study+with+Another+SMN2-Splicing+Targeting+Therapy+(S46.003).">Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003).</a> Neurology. 90, (2018).</li><li>Sivaramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+SMN2+pre-mRNA-protein+complex+elicits+specificity+for+small+molecule+splicing+modifiers.">Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SHAPE+reagents+for+mapping+RNA+structures+inside+living+cells.">Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells.</a> RNA. 23, 169-174 (2017).</li><li>Weeks, K. M., Mauger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+Structural+Codes+with+SHAPE+Chemistry.">Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).</li><li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+reveals+transcript-wide+interactions+,+complex+structural+domains+,+and+protein+interactions+across+the+Xist+lncRNA+in+living+cells.">SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).</li><li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+&#8242;+-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP)+for+direct+,+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis.">Selective 2 &#8242; -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes &amp; Development. 24, 1634-1644 (2010).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li><li>Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+SR+proteins+improves+SMN+expression+in+spinal+muscular+atrophy+cells.">Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells.</a> PloS One. 9, e115205 (2014).</li><li>Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+functional+implications+of+the+3D+architectures+of+viral+tRNA-like+structures.">Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures.</a> RNA. 15, 294-307 (2009).</li><li>Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+role+of+RNA+structure+in+alternative+splicing+of+a+critical+exon+in+the+spinal+muscular+atrophy+genes.">Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes.</a> Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).</li><li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy.">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).</li><li>Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+motif+discovery+by+SHAPE+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP).">RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP).</a> Nature Methods. 11, 959 (2014).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+Footprinting+to+Map+Sites+of+RNA-Protein+Interactions.">RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).</li><li>Velagapudi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+small+molecule+against+an+oncogenic+noncoding+RNA.">Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).</li><li>Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+NMR+to+structure+determination+of+RNAs+large+and+small.">Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).</li><li>Scott, L. G., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+determination+by+NMR.">RNA structure determination by NMR.</a> Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).</li></ol>

В форме в лабораторных условиях важно использовать высокое качество однородной РНК шаблон. Однако, транскрипции T7, часто дает разнородные последовательности36. Особенно последовательности нуклеотидов ±1 на 3'-Отель terminus с не ничтожно малый урожайности36 обычно ...

Селективный 2'-гидроксильные Ацилирование анализируемой выдвижение праймера (SHAPE) — это метод измерения кинетики каждого нуклеотидов РНК последовательности интерес и выяснения вторичная структура единого нуклеотидом резолюция1. ФОРМУ методологии, оба в vitro условий2,3,4 (очищенная РНК в системе определенного буфера) и в живых клетках млекопитающих5,6, были разработаны для расследования на вторичном Структура средней длины РНК последовательности (обычно < 1000 нуклеотидов в ячейке фигуры и < 200 нуклеотидов в пробирке фигуры). Это особенно полезно для оценки структурных изменений в рецептор РНК после привязки к взаимодействующих РНК малые молекулы метаболиты2,4,,78 и учиться механистический действия молекул РНК ориентации во время наркотиков развития9,10.
РНК таргетинг лекарств недавно обращено внимание в научных лабораториях и в фармацевтической промышленности11,12 через различные подходы и стратегии13,14,15 ,16. Недавние примеры малых молекул РНК таргетинг для клинического использования двух структурно различных экспериментальных наркотиков, LMI-07017 и RG-791618,19, для спинальной мышечной атрофии (SMA), которые показали многообещающие результаты в фазе II клинических испытаний20. Обе молекулы были продемонстрированы цели выживания мотонейрона (SMN) 2 пре мРНК и регулировать процесс сращивания SMN2 ген6,17,21. Ранее мы продемонстрировали применение в пробирке и в клеток формы в рассмотрении целевой РНК структурных изменений в присутствии аналог RG-7916, известный как SMN-C26.
В принципе форма измеряет уровень 2'-OH Ацилирование каждого нуклеотидов РНК последовательности при наличии избыточного количества самостоятельно тушения Ацилирование реагента в непредвзято. Ацилирование реагент не является стабильным в воде, с коротким периодом полураспада (например, T1/2 = 17 s 1-метил-7-nitroisatoic ангидрид; или 1 M 7, ~ 20 мин на 2-methylnicotinic кислоты imidazolide, или Най)22 и нечувствительность к личности баз-23. Это приводит к более благоприятным Ацилирование 2'-OH-групп гибких оснований, которые могут быть преобразованы в точной оценки динамики Каждый нуклеотид. В частности нуклеотидов в паре базы обычно менее реактивно, чем один неспаренный для модификации реагента 2'-OH, Най и 1 M 7.
Глядя на источник шаблона РНК и где происходит 2'-OH ацилирование, форма обычно можно подразделить на форму in vitro и в клеток. В vitro формы использует очищенный T7 транскрипции РНК и не хватает сотовой связи в экспериментальные проекты. В-клеток форму шаблон транскрипции РНК и 2'-OH Ацилирование происходят в живых клеток; Таким образом результаты можно резюмировать структурная модель РНК в сотовой связи. В клеточной формы был передан как в естественных условиях формы для формы, в живых клетках в литературе24. Поскольку этот эксперимент выполняется не в животное, мы назвать этот эксперимент как форму в ячейке для точности.
Стратегии для этапа расширения грунт в пробирке и в клеток формы также отличаются. В пробирке форму обратной транскрипции останавливается в позиции Ацилирование 2'-OH присутствии мг2 +. Выдвижение праймера 32P-помечены таким образом появляется как группу в электрофореза геля полиакриламида (страница) и интенсивность группы пропорциональна Ацилирование скорость1. В-клеточной формы, обратная транскрипция генерирует случайные мутации в 2'-OH аддукт позиции присутствии Mn2 +. Мутационного скорость каждого нуклеотидов может быть захвачено в глубину секвенирование нового поколения, и форма реактивности в резолюции единого нуклеотидом затем может быть рассчитана.
Потенциальная проблема для фигуры в ячейке является низкое соотношение сигнал шум (то есть, большинство 2'-OH-групп неизмененным, в то время как неизмененное последовательности занимают большую часть read в последовательности следующего поколения). Недавно метод обогатить 2'-OH изменения РНК, упоминаемый как в естественных условиях щелкните ФИГУРУ (icSHAPE), был разработан в Чанг Лаборатория25. Этот метод обогащения может быть выгодным в изучении слабых малых молекул, таких как РНК взаимодействия, особенно в ходе допросов транскриптом широкий.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>gBlock for &#62; 200 bp DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin gel and PCR clean-up kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaScript T7 transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1333</td>
			<td>Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TBE-urea sample buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow&#8482; Filter Unit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Safe dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 % TBE-urea mini-gel</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperscreen&#8482; Intensifying Screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1669</td>
			<td>calcium tungstate phosphor screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphor storage screen</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>BAS-IP MS 3543 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Typhoon</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAI (2M)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>03-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Contains 5X RT buffer, SuperScript IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddNTP set (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE27-2045-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>GD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Also contains RNase A and protease K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMN2 minigene34</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpLE</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca/ Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Also contains RW1, RPE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Contains DNase I and RDD buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>random nonamer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11904-018</td>
			<td>Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime pfx DNA polymerse</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12344024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucAway column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM10070</td>
			<td>for desalting purpose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes

В процессе разработки лекарственных средств малых молекул РНК таргетинг желательно изучение структурных изменений после их взаимодействия с РНК последовательности. Здесь мы предоставляем подробный в пробирке и в клеток селективного 2'-гидроксильные Ацилирование анализируемой выдвижение праймера (SHAPE) протокол для изучения структурных изменений РНК в присутствии экспериментальный препарат для спинальной мышечной атрофии (SMA), выживание двигательных нейронов (SMN)-C2 и в экзона 7 пре мРНК гена SMN2. В пробирке формы последовательности РНК 140 нуклеотидов, содержащие SMN2 экзона 7 трансляции, полимераза T7 RNA, сложить в присутствии SMN-C2 и впоследствии изменена мягкая 2'-OH Ацилирование реагент, imidazolide 2-methylnicotinic кислота (NAI). Это 2'-OH-Най adduct далее зондируемой 32P-меченых грунтовка расширение и решены путем электрофореза геля полиакриламида (страница). И наоборот Ацилирование 2'-OH-элементная формы происходит на месте с SMN-C2 связаны клеточной РНК в живых клетках. Пре мРНК последовательность экзона 7 гена SMN2, наряду с формы индуцированной мутации в выдвижение праймера, затем был усиленный PCR и при условии соблюдения следующего поколения последовательности. Сравнение двух методологий, в пробирке форма является более экономически эффективным методом и не требуют вычислительной мощности для визуализации результатов. Однако в пробирке модель формы производные РНК иногда отличается от вторичной структуры в сотовой связи, вероятно из-за потери всех взаимодействий с RNA-связывая протеинов. В клеточной формы не нужно радиоактивного материала на рабочем месте и дает более точные вторичной структуры РНК в сотовой связи. Кроме того, форма в клеток обычно применяется для большего круга РНК последовательности (~ 1000 нуклеотидов) путем использования виртуализации нового поколения, по сравнению с в пробирке формы (~ 200 нуклеотидов), которая обычно основывается на анализе страницы. В случае, если экзона 7 в SMN2 пре мРНК, полученных in vitro и в клеток форму РНК модели схожи друг с другом.

Мы ранее показало, что РНК сплайсинга модулятор, SMN-C2, взаимодействует с AGGAAG мотив на экзона 7 SMN2 ген пре мРНК и использовать форму для оценки структурных изменений РНК в присутствии SMN-C26. Привязка сайта SMN-C2 отличается от FDA утвержденных антисмысловых олигон...

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Подробные протоколы для обоих в пробирке и в клеток селективного 2'-гидроксильные Ацилирование анализируемой грунтовка расширение (SHAPE) экспериментов для определения вторичную структуру пре мРНК последовательностей интерес присутствии малых молекул РНК таргетинг представленные в этой статье.

Использование в пробирке и в клеток форму расследовать малые молекулы индуцированной пре мРНК структурные изменения

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Это видео предоставит подробные протоколы для экспериментов в форме in vitro, чтобы определить вторичную структуру РНК последовательностей, представляющих интерес в присутствии РНК ориентации малых молекул. Форма in vitro является экономически эффективным методом для понимания динамики каждого нуклеотида на аминокислотном РНК-элементе, который обычно составляет менее 200 нуклеотидов. После подготовки шаблона РНК, как описано в рукописи, радио этикетка обратной транскрипции грунтовки, добавив гамма 32P АТФ, обратная транскрипция грунтовки.10XPNK буфер реакции, полинуклеотид киназы и свободной воды РНК в 1,7 миллилитров микроцентрифуг трубки в общем объеме 20 микролитров. Затем инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. Затем вы активируете образцы в течение 20 минут с 65 градусов по Цельсию, а затем фильтруете образцы в колонке для опреснировки и центрифуге в 1000 раз G.Add 25 микролитров буфера и смеси образца мочевины 2XTBE.Опустите эти маркированную продукцию в гель 10%acrylamide и убеждайтесь во избежание кровотечение радиоактивность в верхние резервуары. Вы запустите гель на 20 Вт в течение одного часа. После пробежки снимите стеклянные пластины гелеобразной кассеты.Положите гель на кусок полиэтиленовой пленки. Сложите пластик на верхнюю часть геля, чтобы сделать герметичной бутерброд. Поместите гель сэндвич на кальций-вольфсударный фосфорный экран и разоблачить с воображая инструмент.Изображение гель снова с регулярным светом, чтобы знать, где края геля. Используйте программное обеспечение для обработки изображений, чтобы наложить два изображения и наложить светлые и темные изображения. Затем сделайте верхнее изображение слегка непрозрачным, чтобы увидеть оба изображения одновременно.Убедитесь, что печатное изображение имеет тот же размер, что и фактический гель. Затем выровняй гель на печатном изображении. Наконец, используйте стерилизованное лезвие бритвы, чтобы вырезать желаемые изгибы из геля и поместить каждый кусок геля в отдельную 1,7 миллилитровую микроцентрифугную трубку.Чтобы восстановить ДНК из ломтика геля пассивным элюционом, добавьте 0,3 миллилитров смеси осадков elution в каждую 1,7 миллилитровую трубку. Инкубировать трубки в радиоактивно-безопасном контейнере на ротаторе при четырех градусах по Цельсию в течение 16 часов. После инкубации перенесите жидкость в новую 1,7 миллилитровую трубку.Добавить 2.5x ледяной 200 доказательство этанола и инвертировать трубки шесть раз, чтобы смешать жидкость. Инкубировать трубки при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение как минимум одного часа. После центрифугирования при 10 000 г и 4 градусах Цельсия в течение 10 минут, удалите супернатант тщательно трубопроводом.Добавьте один миллилитр 80% этанола для мытья гранул. Вихрь в течение 15 секунд и центрифуга снова в тех же условиях. После удаления супернатанта путем пипетки, воздух-сухой гранулы ДНК в течение пяти минут.Добавьте 50 микролитров свободной воды РНК и смешайте с помощью трубок вверх и вниз 10 раз. Нормализация концентрации ДНК примерно до 100 000 кол-во в минуту на микролитер в счетчике сцинтилляции. Чтобы подготовить четыре образца для химической модификации, добавьте восемь пикомолов РНК в 32 микролитров буфера 0,5 XTE в 1,7 миллилитровую микроцентрифугную трубку.Нагрейте при температуре 80 градусов по Цельсию в течение двух минут и оснастки прохладно на льду, по крайней мере одну минуту. Затем добавьте восемь микролитров 5x складной смеси, смешайте выделить девять микролитров этой смеси РНК в каждой из четырех труб ПЦР, помеченных от одного до четырех. Добавьте один микролитер 10%DMSO в трубку, помеченную как один, один микролитер концентрированного раствора малых молекул в трубку два, один микролитер разбавленного раствора малых молекул в трубку три и один микролитер воды в трубку четыре.Инкубировать все ПЦР трубки при 37 градусах по Цельсию в тепловой циклер в течение 30 минут. Непосредственно перед двумя премьер OH модификации реакции, разбавить один микролитер из двух молярных NAI фондового раствора в трех микролитров DEPC-обработанной воды, чтобы дать 0,5 молярного рабочего решения. Сразу добавьте один микролитер этого раствора в трубки один, два и три.Добавьте один микролитр 25%DMSO в трубку четыре и инкубировать в тепловой циклер при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут. Приготовьте четыре свежих 1,7 миллилитровых микроцентрифуговых трубки и добавьте 100 микролитров смеси осадков elution и два микролитера гликогена в каждую трубку. Затем в каждую из этих трубок передают всю жидкость из соответствующих ПЦР труб.Добавьте 0,34 миллилитров ледяного этанола 200 в каждую трубку и смешайте вихрем в течение пяти секунд. Поместите трубки в морозильную камеру минус 80 градусов по Цельсию, по крайней мере один час. Затем центрифуга труб в течение 15 минут при 14000 раз G при четырех градусах Цельсия.Не нарушая гранулы РНК, удалить супернатант из каждой трубки. Добавьте 0,5 миллилитров 80% этанола на трубку для мытья гранул РНК и вихря в течение 15 секунд. После центрифугирования в тех же условиях снова, удалить супернатант и высушить гранулы РНК в течение пяти минут.Добавить девять микролитров свободной воды РНК и трубы, что вверх и вниз 10 раз, чтобы смешать. Перенесите модифицированную РНК в четыре новые трубки ПЦР и обозначите их от одного до четырех, как на предыдущем этапе. Добавьте два пикомолы РНК в семь микролитров воды, обработанной DEPC, к каждой из четырех дополнительных трубок ПЦР и обозначите их цифрами от пяти до восьми.Добавьте два микролитров восстановленной радиозамещенной грунтовки к каждой из восьми трубок ПЦР, отмеченных от одного до восьми. После нагрева при 65 градусах по Цельсию в течение пяти минут, сразу же остыть до четырех градусов по Цельсию в тепловой циклер. Добавьте четыре микролитров буфера 5x RT, один микролитр 0,1 молярного DTT и один микролитр смеси DNTP к каждой из трубок.Затем добавьте два микролитров воды, обработанной DEPC, в трубки от одного до четырех. Добавьте четыре микролитера из пяти миллимоляров ddATP в трубку пять, четыре микролитера из пяти миллимолейных ddTTP в трубку шесть и четыре микролитера из пяти миллимолейных ddCTP в трубку семь и один микролитр из пяти миллимолейных ddGTP и три микролитров DEPC-обработанной воды в трубку восемь и пипетку четыре раза, чтобы смешать. После нагрева всех труб ПЦР при 52 градусах Цельсия в течение одной минуты в тепловом циклере, добавьте один микролитр обратной транскриптазы к каждой трубке и трубы его вверх и вниз четыре раза, чтобы смешать.Инкубировать реакции при 52 градусах по Цельсию в течение 20 минут в тепловом циклере. Для гидролиза РНК добавьте в каждую из труб один микролитер из пяти гидроксида натрия моляра и нагревайте их при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Затем добавьте пять микролитров одной молярной соляной кислоты, чтобы нейтрализовать реакцию и повторить осадки этанола, как описано ранее.После высыхания воздуха гранулы ДНК в течение пяти минут, добавить 10 микролитров воды и 10 микролитров 2xTBE мочевины образца загрузки буфера в 1,7 миллилитров труб и трубы его вверх и вниз в 10 раз, чтобы переостереть. Нагрейте образцы при температуре 70 градусов по Цельсию в течение пяти минут, затем поместите трубки на лед, перед загрузкой на гель. Загрузите 10 микролитров образца, которые были помещены на лед, на 8%полиакриламида секвенирования геля.Вы запустите гель на 65 Вт в течение двух часов или до тех пор, пока нижний краситель достигает 3/4ths геля. Снимите промявитель и аккуратно вставьте шпатель, чтобы удалить верхнюю силиконовую стеклянную пластину. Обложка гель с куском большой фильтровальной бумаги и осторожно нажмите, чтобы гель придерживаться фильтровальной бумаги.Начиная с нижней части, поднимите фильтровальную бумагу и удалите гель из стеклянной пластины вместе с бумагой. После передачи геля на оберточную бумагу, как это было сделано ранее, высушите его при 70 градусах по Цельсию в течение одного часа с вакуумом, убедившись, что использовать несколько фильтровальной бумаги между гелем и сушилкой. Перенесите сэндвич с гелем на кассету с экраном хранения фосфора с фото отбеленным и подвергните радиоактивность геля экрану в течение четырех-16 часов.Наконец, поместите экран хранения фосфора на устройство визуализации и сканируйте со средним разрешением в течение примерно 30 минут. После разоблачения полиакриламида секвенирования геля на экран хранения фосфора, успешный эксперимент формы показал один и наиболее интенсивный изгиб в верхней части геля и изгибы по всему гель в одном нуклеотидного разрешения без мазка. Гель также показал, что интенсивность некоторых изгибов изменяется в присутствии мелких молекул, что указывает на изменения силы базового спаривания.Распространенной проблемой в анализе страниц является то, что область мазка, известная как солевой фронт, может появиться в середине геля, вероятно, из-за высокой концентрации соли, DMSO или другого нежелательного вещества в образце загрузки. Этого можно избежать, удалив нежелательное вещество с помощью этанола осадков. Однородный шаблон РНК предпочтительнее формы in vitro.Мы используем рибосомы на обоих пяти премьер и три основных концов, чтобы получить такую РНК. Форма клетки также может быть выполнена для получения вторичной структуры РНК в клеточном контексте. Помните, что форма in vitro не может резюмировать взаимодействия белка, связывающего виво РНК.Форма in vitro является мощным методом обнаружения изменений в структуре РНК из-за присутствия небольшой молекулы. Это делается путем количественной оценки изменений в структуре силы обратной транскрипции останавливается. Будьте осторожны, чтобы все эксперименты, описанные в этом видео, проводились на разрешенном радиоактивном рабочем месте с соответствующей личной защитой и защитой плексигласа.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Оптогенетика Случайные мутагенеза Использование гистона-miniSOG в<em&gt; C. Элеганс</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Анализ окружающей среды твердые частицы-индуцированных хромосомных аберраций Использование номера<em&gt; In Vitro</em&gt; система

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

В пробирке Assay биолюминесценции характеризовать Циркадный ритм в эпителиальных клеток молочной железы

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Анализ в реальном времени транскрипционного фактора привязки, транскрипция, перевод и оборот для отображения глобальных событий в процессе активации клеточного

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Метод Optogenetic для контроля и анализа картин выражения гена в ячейке для взаимодействия

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Одной молекулы флуоресценции In Situ гибридизация (smFISH) анализ многообещающий вегетативного роста дрожжей и мейоз

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Рассечение Enhancer функции мультиплексной основанный ТРИФОСФАТЫ Enhancer вмешательства в клеточных линиях

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Количественный анализ альтернативных пре мРНК сплайсинга в разделах мозга мыши, с помощью РНК в Situ гибридизация Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...