Name: using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes
Uploaded: 2019-01-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Este trabajo fue posible gracias a la subvención del NIH R01 (NS094721, K.A.J.).

1. in Vitro forma
Nota: El protocolo se modifica el protocolo publicado1.
<ol><li>Preparación de la plantilla del RNA Nota: La plantilla para la transcripción de T7 fue ordenada como un sintético de doble cadena DNA (dsDNA) y amplificada por cada inserción en un vector de e. coli que lleva un único par de sitios de endonucleasa de restricción EcoRI/BamHI, como pET28a, o por PCR. El protocolo de ampli...

<ol>
	<li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+Quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>Trausch, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+diversity+in+the+SAM+clan+of+riboswitches.">Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).</li><li>Souliere, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+a+riboswitch+response+through+structural+extension+of+a+pseudoknot.">Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).</li><li>Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+Analysis+of+Small+RNAs+and+Riboswitches.">SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches.</a> Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+SHAPE+analysis+in+living+cells.">RNA SHAPE analysis in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).</li><li>Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+a+small-molecule+modulator+of+SMN2+splicing.">Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).</li><li>Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mn+2++-Sensing+Mechanisms+of+yybP-ykoY+Orphan+Riboswitches.">Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches.</a> Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).</li><li>Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+contacts+control+switching+of+the+SAM-I+riboswitch.">Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch.</a> Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).</li><li>Abulwerdi, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Small+Molecules+with+a+Noncanonical+Binding+Mode+to+HIV-1+Trans+Activation+Response+(TAR)+RNA.">Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).</li><li>Shortridge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrocyclic+Peptide+Ligand+Binds+the+Oncogenic+MicroRNA-21+Precursor+and+Suppresses+Dicer+Processing.">A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).</li><li>Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+targeting+RNA+with+drug-like+small+molecules.">Principles for targeting RNA with drug-like small molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+against+RNA+targets+attract+big+backers.">Small molecules against RNA targets attract big backers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).</li><li>Shortridge, M. D., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+based+approaches+for+targeting+non-coding+RNAs+with+small+molecules.">Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules.</a> Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).</li><li>Gallego, J., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RNA+with+Small-Molecule+Drugs:+Therapeutic+Promise+and+Chemical+Challenges.">Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).</li><li>Rizvi, N. F., Smith, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+small+molecule+druggable+target.">RNA as a small molecule druggable target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).</li><li>Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Role+of+RNA+as+a+Therapeutic+Target+for+Small+Molecules.">The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules.</a> Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).</li><li>Palacino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splice+modulators+enhance+U1-pre-mRNA+association+and+rescue+SMA+mice.">SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice.</a> Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).</li><li>Ratni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Risdiplam,+a+Selective+Survival+of+Motor+Neuron-2+(+SMN2+)+Gene+Splicing+Modifier+for+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy+(SMA).">Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA).</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).</li><li>Naryshkin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splicing+modifiers+improve+motor+function+and+longevity+in+mice+with+spinal+muscular+atrophy.">SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy.</a> Science. 345, (2014).</li><li>Chiriboga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+Evidence+for+Pharmacodynamics+Effects+of+RG7916+in+JEWELFISH,+a+Study+in+Patients+with+Spinal+Muscular+Atrophy+who+Previously+Participated+in+a+Study+with+Another+SMN2-Splicing+Targeting+Therapy+(S46.003).">Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003).</a> Neurology. 90, (2018).</li><li>Sivaramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+SMN2+pre-mRNA-protein+complex+elicits+specificity+for+small+molecule+splicing+modifiers.">Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SHAPE+reagents+for+mapping+RNA+structures+inside+living+cells.">Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells.</a> RNA. 23, 169-174 (2017).</li><li>Weeks, K. M., Mauger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+Structural+Codes+with+SHAPE+Chemistry.">Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).</li><li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+reveals+transcript-wide+interactions+,+complex+structural+domains+,+and+protein+interactions+across+the+Xist+lncRNA+in+living+cells.">SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).</li><li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+&#8242;+-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP)+for+direct+,+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis.">Selective 2 &#8242; -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes &amp; Development. 24, 1634-1644 (2010).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li><li>Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+SR+proteins+improves+SMN+expression+in+spinal+muscular+atrophy+cells.">Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells.</a> PloS One. 9, e115205 (2014).</li><li>Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+functional+implications+of+the+3D+architectures+of+viral+tRNA-like+structures.">Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures.</a> RNA. 15, 294-307 (2009).</li><li>Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+role+of+RNA+structure+in+alternative+splicing+of+a+critical+exon+in+the+spinal+muscular+atrophy+genes.">Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes.</a> Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).</li><li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy.">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).</li><li>Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+motif+discovery+by+SHAPE+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP).">RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP).</a> Nature Methods. 11, 959 (2014).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+Footprinting+to+Map+Sites+of+RNA-Protein+Interactions.">RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).</li><li>Velagapudi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+small+molecule+against+an+oncogenic+noncoding+RNA.">Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).</li><li>Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+NMR+to+structure+determination+of+RNAs+large+and+small.">Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).</li><li>Scott, L. G., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+determination+by+NMR.">RNA structure determination by NMR.</a> Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).</li></ol>

En la forma in vitro, es fundamental utilizar plantilla de RNA homogéneo de alta calidad. Transcripción de T7, sin embargo, a menudo produce secuencias heterogéneas36. Especialmente, secuencias de nucleótidos de ±1 en el 3'-terminal con rendimientos no despreciable36 son generalmente difíciles de extirpar por purificación del gel de poliacrilamida. Plantilla de RNA heterogéneo puede resultar en más de un sistema de la señal en el gel de secuenciación perfiles del...

Acilación selectiva 2'-hidroxilo por extensión de la cartilla (forma) es un método de medición de la cinética de cada nucleótido en una secuencia de ARN de interés y elucidar la estructura secundaria en el nucleótido resolución1. Metodologías de la forma, tanto en condiciones in vitro2,3,4 (RNA purificado en un sistema de amortiguamiento definida) y en vida de células de mamífero5,6, se han desarrollado para investigar la secundaria estructura de secuencias de RNA de longitud media (normalmente < 1.000 nucleótidos de forma en las células y < 200 nucleótidos de forma in vitro). Es particularmente útil para evaluar los cambios estructurales en el receptor del RNA en Unión a interacción con RNA molécula pequeña metabolitos2,4,para7,8 y estudiar acciones mecánicas de moléculas de RNA de metas durante el desarrollo de drogas9,10.
Descubrimiento de fármacos dirigidos a RNA recientemente ha atraído atención en laboratorios académicos y la industria farmacéutica11,12 a través de diferentes enfoques y estrategias13,14,15 ,16. Ejemplos recientes de RNA-dirigido a pequeñas moléculas para el uso clínico incluyen dos medicamentos experimentales estructuralmente distintas, LMI-07017 y RG-791618,19, para la atrofia muscular espinal (SMA), que demostró prometedor resultados en la fase II ensayos clínicos20. Ambas moléculas fueron demostrado a la supervivencia de la blanco de la neurona de motor (SMN) 2 pre-mRNA y regular el proceso de empalme del SMN2 gene6,17,21. Previamente demostramos la aplicación de in vitro y forma en las células en un examen de los cambios estructurales objetivo RNA en presencia de un análogo de la RG-7916 conocido como SMN-C26.
En principio, forma mide la tasa de Acilación de 2'-OH de cada nucleótido de una secuencia de ARN en presencia de cantidades excesivas de un reactivo de acilación por enfriamiento de una manera imparcial. El reactivo de acilación no es estable en agua, con una vida media corta de (p. ej., T1/2 = 17 s 1-metil-7-nitroisatoic anhídrido; o 1 M 7, ~ 20 min para imidazolide ácido 2-methylnicotinic, NAI)22 y la insensibilidad a la identidad de las bases de23. Esto resulta en una acilación más favorable de los grupos 2'-OH de bases flexibles, que pueden transformarse en una evaluación precisa de la dinámica de cada nucleótido. En concreto, un nucleótido en un par de base es generalmente menos reactivo que no emparejada a un reactivo modificar 2'-OH, como NAI y 1 M 7.
Mirando la fuente de la plantilla del RNA y en 2'-OH acilación ocurre, forma generalmente puede ser clasificada en forma in vitro y en células. En usos de vitro forma purificada T7 transcrito RNA y carece de un contexto celular en diseños experimentales. En forma de celdas, la transcripción del RNA plantilla y 2'-OH acilación ocurren dentro de las células vivas; por lo tanto, los resultados pueden recapitular el modelo estructural del RNA en un contexto celular. FORMA en las células se ha referido como vivo forma para la forma en las células vivas en la literatura24. Ya que este experimento no se realiza en un animal, llama este experimento como forma en las células para la exactitud.
Las estrategias para la etapa de extensión de la cartilla de forma in vitro y en células también son diferentes. En la forma in vitro, reversa de la transcripción se detiene en la posición de la acilación de 2'-OH en presencia de Mg2 +. Por lo tanto, una extensión de la cartilla de 32P etiqueta aparece como una banda en electroforesis del gel de poliacrilamida (PAGE) y la intensidad de la banda es proporcional a la acilación tipo1. En forma de celdas, la transcripción reversa genera mutaciones aleatorias en el 2'-OH aducción posición en presencia de Mn2 +. La tasa mutacional de cada nucleótido puede ser capturada por en secuenciación de próxima generación de profundidad, y luego se puede calcular la reactividad de la forma en la resolución del solo-nucleótido.
Un problema potencial para la forma en las células es la baja relación de señal a ruido (es decir, la mayoría de los grupos 2'-OH es sin modificar, mientras que las secuencias no modificadas ocupan la mayor parte de la lectura en secuenciación de próxima generación). Recientemente, un método para enriquecer el 2'-OH modificado RNA, que se refiere como en vivo haga clic en forma (icSHAPE), fue desarrollado por el laboratorio de Chang25. Este método de enriquecimiento puede ser ventajoso en el estudio de débiles pequeñas moléculas como interacciones RNA, especialmente en un interrogatorio de todo el transcriptoma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>gBlock for &#62; 200 bp DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin gel and PCR clean-up kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaScript T7 transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1333</td>
			<td>Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TBE-urea sample buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow&#8482; Filter Unit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Safe dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 % TBE-urea mini-gel</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperscreen&#8482; Intensifying Screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1669</td>
			<td>calcium tungstate phosphor screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphor storage screen</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>BAS-IP MS 3543 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Typhoon</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAI (2M)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>03-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Contains 5X RT buffer, SuperScript IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddNTP set (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE27-2045-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>GD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Also contains RNase A and protease K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMN2 minigene34</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpLE</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca/ Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Also contains RW1, RPE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Contains DNase I and RDD buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>random nonamer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11904-018</td>
			<td>Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime pfx DNA polymerse</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12344024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucAway column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM10070</td>
			<td>for desalting purpose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes

En el proceso de desarrollo de fármacos de moléculas pequeñas metas de RNA, se desea dilucidar los cambios estructurales en sus interacciones con secuencias de RNA Diana. Aquí proporcionamos una detallada en vitro y en célula selectiva 2'-hidroxilo acilación analizadas por extensión primer Protocolo (forma) para estudiar el cambio estructural del RNA en presencia de una droga experimental para la atrofia muscular espinal (SMA), la supervivencia de la neurona de motor (SMN)-C2 y en el exón 7 del pre-mRNA del gen SMN2. En la forma in vitro, una secuencia de ARN de 140 nucleótidos que contienen SMN2 exón 7 transcripción por polimerasa del RNA T7, doblada en presencia de SMN-C2 y modificada posteriormente por un reactivo de acilación suave 2'-OH, imidazolide ácido 2-methylnicotinic (NAI). Esta aducción 2'-OH-NAI más es sondeado por un 32extensión primer marcado con P y resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Por el contrario, Acilación de la 2'-OH en la forma en las células ocurre in situ con SMN-C2 límite ARN celular en las células vivas. La secuencia de pre-mRNA del exón 7 en el gen SMN2, y mutaciones inducidas por la forma en la extensión de la cartilla, entonces fue amplificada por PCR y secuenciación de próxima generación. Comparando las dos metodologías, forma in vitro es un método más económico y no requiere de poder computacional a visualizar los resultados. Sin embargo, el modelo in vitro de RNA forma derivada a veces se desvía de la estructura secundaria en el contexto celular, probablemente debido a la pérdida de todas las interacciones con proteínas RNA-que atan. FORMA en la célula no necesita un lugar de trabajo de material radiactivo y produce una precisa estructura secundaria del RNA en el contexto celular. Además, forma en las células es generalmente aplicable para una mayor gama de RNA las secuencias (~ 1.000 nucleótidos) utilizando secuenciación de próxima generación, en comparación con el in vitro de la forma (~ 200 nucleótidos) que generalmente se basa en el análisis de la página. En el caso del exón 7 en el pre-mRNA de SMN2, derivados de la forma in vitro y en células RNA modelos son similares entre sí.

Previamente demostramos que un RNA splicing modulador, SMN-C2, interactúa con motivo de la AGGAAG en el exón 7 del pre-mRNA del gen SMN2 y utilizó la forma para evaluar los cambios estructurales del RNA en presencia de SMN-C26. El sitio de unión del SMN-C2 es distinto de los oligonucleótidos antisentido aprobado por la FDA (ASO) para el SMA, nusinersen, que se une y bloquea el silenciador que empalma intronic (ISS) en el intrón 727<sup...

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Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Protocolos detallados para ambos acilación in vitro y en células selectivo 2'-hidroxilo por experimentos de extensión (forma) de cartilla para determinar la estructura secundaria de las secuencias de interés en presencia de una pequeña molécula de RNA-dirigido a pre-mRNA son presentados en este artículo.

Uso en Vitro y en las células la forma para investigar la molécula pequeña inducida por cambios estructurales Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Este video proporcionará protocolos detallados para experimentos de forma in vitro para determinar la estructura secundaria de las secuencias de ARN de interés en presencia de un ARN dirigido a moléculas pequeñas. La forma in vitro es un método rentable para entender la dinámica de cada nucleótido en un elemento de ARN de tamaño amino que suele ser inferior a 200 nucleótidos. Después de preparar la plantilla de ARN como se describe en el manuscrito, la etiqueta de radio invierte las imprimaciones de transcripción inversa mediante la adición de un GAMMA 32P ATP, imprimación de transcripción invertida.Tampón de reacción 10XPNK, polinucleótido quinasa y agua libre de ARN en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros en un volumen total de 20 microlitros. Luego incubar a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, active las muestras durante 20 minutos desde 65 grados Celsius y luego filtre las muestras en una columna de desaladora y centrífuga a 1000 veces G.Add 25 microlitros de búfer de muestra de urea 2XTBE y mezcle.Baje estos productos etiquetados en un gel de 10% acrilamida y asegúrese de evitar sangrar la radiactividad en los depósitos superiores. Ejecute el gel a 20 vatios durante una hora. Después de la carrera, retire las placas de vidrio del cassette de gel.Poner el gel sobre la pieza de plástico. Dobla el plástico sobre la parte superior del gel para hacer un sándwich hermético. Coloque el sándwich de gel en una pantalla de fósforo de calcio-tungstato y exponga con un instrumento imaginador.Vuelve a tomar una imagen del gel con luz regular para saber dónde están los bordes del gel. Utilice un software de procesamiento de imágenes para superponer las dos imágenes y superponer las imágenes claras y oscuras. A continuación, haga que la imagen superior sea ligeramente opaca para ver ambas imágenes simultáneamente.Asegúrese de que la imagen impresa tenga el mismo tamaño que el gel real. A continuación, alinee el gel en la imagen impresa. Por último, utilice una cuchilla de afeitar esterilizada para cortar los pliegues deseados del gel y coloque cada pieza de gel en un tubo de microcentrífuga separado de 1,7 mililitros.Para recuperar el ADN de la rebanada de gel por elución pasiva, agregue 0,3 mililitros de mezcla de precipitación de elución a cada tubo de 1,7 mililitros. Incubar los tubos en un recipiente seguro radioactivo en un rotador a cuatro grados centígrados durante 16 horas. Después de la incubación, transfiera el líquido a un nuevo tubo de 1,7 mililitros.Añadir 2.5x hielo frío 200 etanol a prueba e invertir los tubos seis veces para mezclar el líquido. Incubar los tubos a menos 80 grados centígrados durante un mínimo de una hora. Después de centrifugar a 10.000 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos, retire el sobrenadante cuidadosamente pipeteando.Añadir un mililitro de 80%etanol para lavar el pellet. Vórtice durante 15 segundos y centrifugar de nuevo en las mismas condiciones. Después de retirar el sobrenadante por pipeteo, seque al aire el pellet de ADN durante cinco minutos.Agregue 50 microlitros de agua libre de ARN y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Normalice la concentración de ADN a unos 100.000 recuentos por minuto por microlitro en un contador de centelleo. Para preparar cuatro muestras para su modificación química, añada ocho picomoles de ARN en 32 microlitros de 0,5 Tampón XTE a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros.Calienta a 80 grados Centígrados durante dos minutos y enfría el hielo durante al menos un minuto. A continuación, añadir ocho microlitros de mezcla plegable 5x, mezclar un asignar nueve microlitros de esta mezcla de ARN en cada uno de los cuatro tubos de PCR, etiquetados de uno a cuatro. Agregue un microlitro de 10%DMSO al tubo marcado como uno, un microlitro de solución de moléculas pequeñas concentrada en el tubo dos, un microlitro de solución de moléculas pequeñas diluidas en el tubo tres y un microlitro de agua en el tubo cuatro.Incubar todos los tubos PCR a 37 grados centígrados en un ciclor térmico durante 30 minutos. Inmediatamente antes de la reacción de modificación de dos oh primera, diluir un microlitro de dos soluciones de NAI molar en tres microlitros de agua tratada con DEPC para producir una solución de trabajo molar de 0,5. Agregue inmediatamente un microlitros de esta solución en los tubos uno, dos y tres.Añadir un microlitro de 25%DMSO en el tubo cuatro e incubar en un ciclor térmico a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Prepare cuatro tubos de microcentrífuga frescos de 1,7 mililitros y añada 100 microlitros de mezcla de precipitación de elución y dos microlitros de glucógeno a cada tubo. A continuación, en cada uno de estos tubos transferir todo el líquido de los tubos PCR correspondientes.Agregue 0,34 mililitros de etanol a prueba de 200 helados en cada tubo y mezcle por vórtice durante cinco segundos. Coloque los tubos en un congelador de menos 80 grados Centígrados durante al menos una hora. Luego centrifuga los tubos durante 15 minutos a 14.000 veces G a cuatro grados centígrados.Sin alterar el pellet de ARN, retire el sobrenadante de cada tubo. Añadir 0,5 mililitros de 80% de etanol por tubo para lavar el pellet de ARN y el vórtice durante 15 segundos. Después de centrifugar en las mismas condiciones de nuevo, retire el sobrenadante y seque al aire el pellet de ARN durante cinco minutos.Agregue nueve microlitros de agua y tuberías libres de ARN que suelen y bajen 10 veces para mezclar. Transfiera el ARN modificado en cuatro nuevos tubos pcR y etiquete uno a cuatro como en el paso anterior. Agregue dos picomoles de ARN en siete microlitros de agua tratada con DEPC a cada uno de los cuatro tubos de PCR adicionales y etiquete con los números cinco a ocho.Agregue dos microlitros de la imprimación radiomarcada recuperada a cada uno de los ocho tubos pcR marcados de uno a ocho. Después de calentar a 65 grados Celsius durante cinco minutos, se enfríe inmediatamente a cuatro grados Celsius en el ciclor térmico. Agregue cuatro microlitros de tampón RT 5x, un microlitro de TDT molar 0.1 y un microlitro de mezcla DNTP a cada uno de los tubos.A continuación, agregue dos microlitros de agua tratada con DEPC a los tubos de uno a cuatro. Añadir cuatro microlitros de cinco ddATP mililolares al tubo cinco, cuatro microlitros de cinco ddTTP milimotores al tubo seis y cuatro microlitros de cinco ddCTP mililolares al tubo siete y un microlitro de cinco mililitros de ddGTP y tres microlitros de agua tratada con DEPC al tubo ocho y pipeta cuatro veces para mezclar. Después de calentar todos los tubos pcR a 52 grados Celsius durante un minuto en un ciclo térmico, agregue un microlitro de transcriptasa inversa a cada tubo y pipeelo hacia arriba y hacia abajo cuatro veces para mezclar.Incubar las reacciones a 52 grados centígrados durante 20 minutos en el ciclor térmico. Para hidrolizar el ARN, agregue un microlitro de cinco molares de hidróxido de sodio en cada uno de los tubos y calientelos a 95 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, agregue cinco microlitros de un ácido clorhídrico molar para neutralizar la reacción y repetir la precipitación de etanol como se describió anteriormente.Después de secar al aire el pellet de ADN durante cinco minutos, agregue 10 microlitros de agua y 10 microlitros de tampón de carga de muestra de urea 2xTBE en tubos de 1,7 mililitros y entubarlo hacia arriba y hacia abajo 10 veces para redissolve. Calienta las muestras a 70 grados centígrados durante cinco minutos, luego coloca los tubos sobre hielo, antes de cargarlos sobre el gel. Cargue 10 microlitros de la muestra que se ha colocado sobre hielo en un gel de secuenciación de poliacrilamida al 8%.Ejecute el gel a 65 vatios durante dos horas o hasta que el tinte inferior alcance los 3/4 del gel. Retire el espaciador e inserte suavemente una espátula para quitar la placa de vidrio siliconizado superior. Cubra el gel con un pedazo de papel de filtro grande y presione suavemente para permitir que el gel se adhiera al papel de filtro.A partir del extremo inferior, levante el papel del filtro y retire el gel de la placa de vidrio junto con el papel. Después de transferir el gel a un papel de envoltura como se había hecho anteriormente, séquelo a 70 grados Celsius durante una hora con una aspiradora, asegurándose de usar varios papeles de filtro entre el gel y la secadora. Transfiera el sándwich de gel a un casete de pantalla de almacenamiento de fósforo foto blanqueado y exponga la radiactividad del gel a la pantalla durante cuatro a 16 horas.Por último, coloque la pantalla de almacenamiento de fósforo en un dispositivo de imágenes y escanee con una resolución media durante aproximadamente 30 minutos. Después de exponer el gel de secuenciación de poliacrilamida a la pantalla de almacenamiento de fósforo, un experimento de forma exitoso mostró una sola y más intensa curvatura en la parte superior del gel y se dobla a lo largo del gel con una sola resolución de nucleótido sin frotis. El gel también mostró que la intensidad de algunas curvas cambió en presencia de moléculas pequeñas, lo que indica cambios en la fuerza de emparejamiento base.Un problema común en el análisis de página es que una región de frotis conocida como el frente de sal puede aparecer en el medio del gel, probablemente debido a la alta concentración de sal, DMSO u otra sustancia no deseada en la muestra de carga. Eso se puede evitar mediante la eliminación de la sustancia no deseada por precipitación de etanol. Una plantilla de ARN homogénea es preferible para la forma in vitro.Usamos ribosomas en cinco extremos primos y tres primos para obtener tal ARN. La forma en la célula también se puede realizar para obtener la estructura secundaria del ARN en el contexto celular. Recuerde que la forma in vitro puede no recapitular interacciones in vivo de proteínas de unión al ARN.La forma in vitro es un método potente para detectar cambios en la estructura del ARN debido a la presencia de una molécula pequeña. Esto se hace cuantificando los cambios en la fuerza de patrón de las paradas de transcriptasa inversa. Tenga cuidado de que todos los experimentos descritos en este video se realicen en un lugar de trabajo radiactivo autorizado con protección personal adecuada y blindaje de plexiglás.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenética aleatoria de mutagénesis, utilizando la histona-miniSOG en<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Investigación

Genética

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

El análisis de la inducida por la materia particulada ambiental aberraciones cromosómicas El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Ensayo de bioluminiscencia para la caracterización del ritmo circadiano en células epiteliales mamarias

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Un método de Optogenetic para controlar y analizar patrones de expresión génica en las interacciones célula a célula

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Sola molécula fluorescencia In Situ hibridación (smFISH) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Disección de la función del reforzador mediante Multiplex basados en CRISPR potenciador de interferencia en líneas celulares

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...