Name: using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes
Uploaded: 2019-01-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Detta arbete har gjorts möjlig genom NIH R01 bidraget (NS094721, K.A.J.).

1. in Vitro form
Obs: Protokollet är modifierad från publicerade protokoll1.
<ol><li>Förbereda mallen RNA Obs: Mallen för T7 transkription beställdes som en syntetisk dubbelsträngat DNA (dsDNA) och förstärks av antingen införande i en E. coli -vektor som bär ett unikt par av mina/BamHI begränsning Amiiiiin platser, såsom pET28a, eller med PCR. Protokollet för PCR-amplifiering illustreras nedan...

<ol>
	<li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+Quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>Trausch, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+diversity+in+the+SAM+clan+of+riboswitches.">Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).</li><li>Souliere, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+a+riboswitch+response+through+structural+extension+of+a+pseudoknot.">Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).</li><li>Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+Analysis+of+Small+RNAs+and+Riboswitches.">SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches.</a> Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+SHAPE+analysis+in+living+cells.">RNA SHAPE analysis in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).</li><li>Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+a+small-molecule+modulator+of+SMN2+splicing.">Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).</li><li>Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mn+2++-Sensing+Mechanisms+of+yybP-ykoY+Orphan+Riboswitches.">Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches.</a> Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).</li><li>Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+contacts+control+switching+of+the+SAM-I+riboswitch.">Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch.</a> Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).</li><li>Abulwerdi, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Small+Molecules+with+a+Noncanonical+Binding+Mode+to+HIV-1+Trans+Activation+Response+(TAR)+RNA.">Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).</li><li>Shortridge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrocyclic+Peptide+Ligand+Binds+the+Oncogenic+MicroRNA-21+Precursor+and+Suppresses+Dicer+Processing.">A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).</li><li>Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+targeting+RNA+with+drug-like+small+molecules.">Principles for targeting RNA with drug-like small molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+against+RNA+targets+attract+big+backers.">Small molecules against RNA targets attract big backers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).</li><li>Shortridge, M. D., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+based+approaches+for+targeting+non-coding+RNAs+with+small+molecules.">Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules.</a> Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).</li><li>Gallego, J., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RNA+with+Small-Molecule+Drugs:+Therapeutic+Promise+and+Chemical+Challenges.">Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).</li><li>Rizvi, N. F., Smith, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+small+molecule+druggable+target.">RNA as a small molecule druggable target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).</li><li>Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Role+of+RNA+as+a+Therapeutic+Target+for+Small+Molecules.">The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules.</a> Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).</li><li>Palacino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splice+modulators+enhance+U1-pre-mRNA+association+and+rescue+SMA+mice.">SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice.</a> Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).</li><li>Ratni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Risdiplam,+a+Selective+Survival+of+Motor+Neuron-2+(+SMN2+)+Gene+Splicing+Modifier+for+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy+(SMA).">Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA).</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).</li><li>Naryshkin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splicing+modifiers+improve+motor+function+and+longevity+in+mice+with+spinal+muscular+atrophy.">SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy.</a> Science. 345, (2014).</li><li>Chiriboga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+Evidence+for+Pharmacodynamics+Effects+of+RG7916+in+JEWELFISH,+a+Study+in+Patients+with+Spinal+Muscular+Atrophy+who+Previously+Participated+in+a+Study+with+Another+SMN2-Splicing+Targeting+Therapy+(S46.003).">Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003).</a> Neurology. 90, (2018).</li><li>Sivaramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+SMN2+pre-mRNA-protein+complex+elicits+specificity+for+small+molecule+splicing+modifiers.">Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SHAPE+reagents+for+mapping+RNA+structures+inside+living+cells.">Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells.</a> RNA. 23, 169-174 (2017).</li><li>Weeks, K. M., Mauger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+Structural+Codes+with+SHAPE+Chemistry.">Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).</li><li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+reveals+transcript-wide+interactions+,+complex+structural+domains+,+and+protein+interactions+across+the+Xist+lncRNA+in+living+cells.">SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).</li><li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+&#8242;+-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP)+for+direct+,+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis.">Selective 2 &#8242; -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes &amp; Development. 24, 1634-1644 (2010).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li><li>Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+SR+proteins+improves+SMN+expression+in+spinal+muscular+atrophy+cells.">Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells.</a> PloS One. 9, e115205 (2014).</li><li>Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+functional+implications+of+the+3D+architectures+of+viral+tRNA-like+structures.">Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures.</a> RNA. 15, 294-307 (2009).</li><li>Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+role+of+RNA+structure+in+alternative+splicing+of+a+critical+exon+in+the+spinal+muscular+atrophy+genes.">Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes.</a> Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).</li><li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy.">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).</li><li>Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+motif+discovery+by+SHAPE+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP).">RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP).</a> Nature Methods. 11, 959 (2014).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+Footprinting+to+Map+Sites+of+RNA-Protein+Interactions.">RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).</li><li>Velagapudi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+small+molecule+against+an+oncogenic+noncoding+RNA.">Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).</li><li>Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+NMR+to+structure+determination+of+RNAs+large+and+small.">Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).</li><li>Scott, L. G., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+determination+by+NMR.">RNA structure determination by NMR.</a> Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).</li></ol>

I in vitro-form är det viktigt att använda högkvalitativa homogena RNA mall. T7 transkription, ger dock ofta heterogena sekvenser36. Särskilt, är sekvenser med ±1 nukleotid på 3'-terminus med försumbar avkastning36 ofta svåra att avlägsnas genom Polyakrylamidgelen rening. Heterogena RNA mall kan resultera i mer än en uppsättning av signalera i sekvensering gel profilering av primer filändelsen produkten, vilket ibland gör det svårt att tolka resultatet. Riboz...

Selektiv 2'-hydroxylgruppen acylation analyseras av primer filändelsen (form) är en metod för mätning av kinetik av varje nukleotid i en RNA-sekvens av intresse och klarlägga det sekundära strukturerar på single-nucleotide upplösning1. FORM metoder, både i in vitro-villkor2,3,4 (renat RNA i en definierad buffertsystem) och levande däggdjursceller5,6, har utvecklats för att undersöka sekundärt struktur av medium längd RNA sekvenser (vanligtvis < 1 000 nukleotider för i cell form och < 200 nukleotider för in vitro-form). Det är särskilt användbart att utvärdera strukturella förändringar i receptorn RNA vid bindning till RNA-interagera småmolekylära metaboliter2,4,7,8 och studera mekanistiska åtgärder av målobjekt RNA molekyler under drog utveckling9,10.
RNA-targeting läkemedelsutveckling har nyligen dragit uppmärksamhet i akademiska laboratorier och läkemedelsindustrin11,12 via olika metoder och strategier13,14,15 ,16. Aktuella exempel på RNA-targeting små molekyler för klinisk användning är två strukturellt distinkta experimentella läkemedel, LMI-07017 och RG-791618,19, för spinal muskelatrofi (SMA), som visade lovande resultat i fas II kliniska prövningar20. Båda molekylerna var visat att målet överlevnad motorneuronen (SMN) 2 pre-mRNA och reglera processen skarvning av SMN2 genen6,17,21. Vi visat tidigare tillämpning av in vitro- och i cell form i en undersökning av de strukturella förändringarna som mål RNA i närvaro av en analog till RG-7916 kallas SMN-C26.
I princip mäter form 2'-OH acylation andelen varje nukleotid av en RNA-sekvens i närvaro av överskjutande belopp av själv släcka acylation reagens på ett opartiskt sätt. Acylation reagens är inte stabila i vatten, med en kort halveringstid på (t.ex., T1/2 = 17 s för 1-metyl-7-nitroisatoic bauxit; eller 1 M 7, ~ 20 min för 2-methylnicotinic acid imidazolide eller NAI)22 och okänslighet för identitet baser23. Detta resulterar i en mer gynnsam acylation av 2'-OH grupper av flexibla baser, som kan omvandlas till en korrekt bedömning av dynamiken i varje nukleotid. Specifikt, är en nukleotid i en base-par oftast mindre reaktiva än en oparade till 2'-OH modifiera reagens, såsom NAI och 1 M 7.
Tittar på källan till mallen RNA och där 2'-OH acylation sker, kan formen generellt delas in i in vitro och i cell form. I vitro form använder renat T7 transkriberade RNA och saknar en cellulär sammanhang i experimentell design. I cell form inträffa både RNA mall transkription och 2'-OH acylation inom levande celler; resultaten kan därför sammanfatta RNA strukturella modellen i cellulära sammanhang. I cell form har hänvisats till som i vivo form för formen i levande celler i den litteratur24. Eftersom detta experiment inte utförs i ett djur, kallas vi detta experiment i cell form för noggrannhet.
Strategierna för primer filändelsen scenen av in vitro och i cell form är också olika. I in vitro-form slutar omvänd Transkription vid 2'-OH acylation position i närvaro av Mg2 +. En 32P-märkt primer filändelsen förefaller därför som ett band i polyakrylamid gelelektrofores (sidan) och intensiteten i bandet är proportionell till acylation kurs1. I cell form, omvänd Transkription genererar slumpmässiga mutationer på 2'-OH addukt position i närvaro av Mn2 +. Mutationsanalys andelen varje nukleotid kan fångas av i djup nästa generations sekvensering, och formen reaktiviteten på single-nucleotide upplösning kan sedan beräknas.
Ett potentiellt problem för i cell form är låg signal-brus-förhållandet (dvs. en majoritet av de 2'-OH-grupperna är oförändrad, medan de omodifierade sekvenserna upptar mest av Läs i nästa generations sekvensering). Nyligen, en metod för att berika 2'-OH modifierade RNA, som avses i vivo Klicka formen (icSHAPE), utvecklades av Chang laboratorium25. Denna berikning metod kan vara förmånligt studera svaga små molekyler som RNA interaktioner, särskilt i en transkriptom-wide förhör.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>gBlock for &#62; 200 bp DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin gel and PCR clean-up kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaScript T7 transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1333</td>
			<td>Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TBE-urea sample buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow&#8482; Filter Unit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Safe dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 % TBE-urea mini-gel</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperscreen&#8482; Intensifying Screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1669</td>
			<td>calcium tungstate phosphor screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphor storage screen</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>BAS-IP MS 3543 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Typhoon</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAI (2M)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>03-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Contains 5X RT buffer, SuperScript IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddNTP set (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE27-2045-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>GD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Also contains RNase A and protease K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMN2 minigene34</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpLE</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca/ Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Also contains RW1, RPE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Contains DNase I and RDD buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>random nonamer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11904-018</td>
			<td>Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime pfx DNA polymerse</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12344024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucAway column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM10070</td>
			<td>for desalting purpose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes

I processen för läkemedelsutveckling RNA-targeting små molekyler önskas belysa de strukturella förändringarna vid deras interaktioner med målet RNA sekvenser. Vi tillhandahåller häri en detaljerad in vitro- och selektiv i cell 2'-hydroxylgruppen acylation analyseras av primer filändelsen (form) protokoll för att studera den RNA strukturförändringen i närvaro av en drog för spinal muskelatrofi (SMA), överlevnad motorneuronen (SMN)-C2, och i exon 7 av pre-mRNA av SMN2-genen. I in vitro-form, är en RNA-sekvens av 140 nukleotider som innehåller SMN2 exon 7 transkriberas av T7 RNA-polymeras, vikta i närvaro av SMN-C2 och därefter ändras av en mild 2'-OH acylation reagens, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). Detta 2'-OH-NAI addukt är ytterligare trotsat av 32P-märkt primer filändelsen och lösas av polyakrylamid gelelektrofores (sidan). Omvänt, 2'-OH acylation i cell formen sker på plats med SMN-C2 bunden cellulära RNA i levande celler. Den pre-mRNA-sekvensen av exon 7 i SMN2 genen, tillsammans med form-inducerade mutationer i tillägget primer, förstärktes sedan av PCR och omfattas av nästa generations sekvensering. Jämföra de två metoderna, in vitro-form är en mer kostnadseffektiv metod och kräver inte datorkraft att visualisera resultat. In vitro-form-derived RNA modellen avviker dock ibland från det sekundära strukturerar i cellulära sammanhang, sannolikt på grund av förlusten av alla interaktioner med RNA-bindande proteiner. I cell form behöver inte ett radioaktivt material arbetsplatsen och ger en mer exakt RNA sekundära struktur inom ramen för cellulära. Dessutom i cell formen är vanligtvis tillämplig för ett större utbud av RNA-sekvenser (~ 1000 nukleotider) genom att använda nästa generations sekvensering, jämfört med in vitro-forma (~ 200 nukleotider) som vanligtvis bygger på analys. I fall av exon 7 i SMN2 pre-mRNA, in vitro och i cell form härrör är RNA modellerna lika varandra.

Vi tidigare visat att en RNA skarvning modulator, SMN-C2, interagerar med AGGAAG motiv på exon 7 SMN2 genens pre-mRNA och används formen för att bedöma de RNA strukturförändringarna i närvaro av SMN-C26. Bindningsstället för SMN-C2 är skild från den FDA-godkända antisense oligonukleotiden (ASO) för SMA, nusinersen, som binder och blockerar intronic skarvning ljuddämparen (ISS) på intron 727,28</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Detaljerade protokoll för både in vitro och i cell selektiv 2'-hydroxylgruppen acylation analyseras av primer filändelsen (form) experiment för att fastställa det sekundära strukturerar av pre-mRNA sekvenser av intresse i närvaro av en RNA-targeting liten molekyl är presenteras i denna artikel.

Använda i Vitro och i cell form att undersöka småmolekylära inducerad Pre-mRNA strukturella förändringar

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Denna video kommer att ge detaljerade protokoll för in vitro-form experiment för att bestämma den sekundära strukturen av RNA sekvenser av intresse i närvaro av en RNA inriktning liten molekyl. In vitro-form är en kostnadseffektiv metod för att förstå dynamiken i varje nukleotid på ett RNA-element i aminostorlek som vanligtvis är mindre än 200 nukleotider. Efter att ha förberett RNA-mallen som beskrivs i manuskriptet, radioetikett omvänd transkription primers genom att lägga till en gamma 32P ATP, omvänd transkription primer.10XPNK reaktionsbuffert, polynukleotidkinas och RNA:s fria vatten i ett 1,7 milliliter mikrocentrifugrör i en total volym av 20 mikroliter. Sedan inkubera vid 37 grader Celsius i en timme. Du aktiverar sedan proverna i 20 minuter sedan 65 grader Celsius och sedan filtrera proverna i en avsaltning kolumn och centrifug på 1000 gånger G.Lägg till 25 mikroliter av 2XTBE urea prov buffert och blanda.Sänk dessa märkta produkter i en 10%akrylamid gel och se till att undvika blödning radioaktiviteten i toppen reservoarer. Kör gelen på 20 watt i en timme. Efter körningen, ta bort glasplattorna i gelkassetten.Lägg gelen på plastfoliebiten. Vik plasten på toppen av gelen för att göra en lufttät smörgås. Placera gel smörgås på en kalcium-tungstate fosfor skärm och exponera med ett föreställande instrument.Bild gelen igen med regelbundet ljus för att veta var kanterna på gelén är. Använd en bildbehandlingsprogramvara för att överlagra de två bilderna och överlagra de ljusa och mörka bilderna. Gör sedan den översta bilden något ogenomskinlig för att kunna se båda bilderna samtidigt.Kontrollera att den utskrivna bilden har samma storlek som den faktiska gelén. Rikta sedan in gelen på den tryckta bilden. Slutligen, använd ett steriliserat rakblad för att skära de önskade böjarna ur gelen och placera varje bit gel i en separat 1,7 milliliter mikrocentrifugrör.För att återvinna DNA från gelskivan genom passiv eluering, tillsätt 0,3 milliliter elution nederbörd mix till varje 1,7 milliliter rör. Inkubera rören i en radioaktiv-säker behållare på en rotator vid fyra grader Celsius i 16 timmar. Efter inkubationen överför du vätskan till ett nytt 1,7 milliliterrör.Tillsätt 2,5x iskall 200 bevis etanol och invertera rören sex gånger för att blanda vätskan. Inkubera rören vid minus 80 grader Celsius i minst en timme. Efter centrifugering vid 10, 000g och fyra grader Celsius i 10 minuter, ta bort supernatanten försiktigt genom pipettering.Tillsätt en milliliter av 80%etanol för att tvätta pelleten. Vortex i 15 sekunder och centrifug igen under samma förhållanden. Lufttorka DNA-pelleten i fem minuter efter att supernatanten avlägsnats genom pipettering.Tillsätt 50 mikroliter av RNA:s fria vatten och blanda genom att pipettera upp och ner 10 gånger. Normalisera DNA-koncentrationen till ca 100, 000 räknas per minut per mikroliter i en scintillationsräknare. För att förbereda fyra prover för kemisk modifiering, tillsätt åtta picomoles av RNA i 32 mikroliter av 0,5 XTE buffert till en 1,7 milliliter mikrocentrifugrör.Värm i 80 grader Celsius i två minuter och snäpp svalt på is i minst en minut. Tillsätt sedan åtta mikroliter av 5x vikning mix, blanda en allokera nio mikroliter av denna RNA-blandning i var och en av de fyra PCR-rören, märkta från en till fyra. Tillsätt en mikroliter på 10%DMSO i röret märkt som en, en mikroliter av koncentrerad liten molekyllösning i rör två, en mikroliter av utspädd liten molekyllösning i rör tre och en mikroliter vatten i rör fyra.Inkubera alla PCR-rör i 37 grader Celsius i en termisk cycler i 30 minuter. Direkt före den två främsta OH-modifieringsreaktionen späd en mikroliter av två molar NAI-stamlösning i tre mikroliter av DEPC-behandlat vatten för att ge en 0,5 molar arbetslösning. Lägg omedelbart till en mikroliter av denna lösning i rör ett, två och tre.Lägg till en mikroliter på 25%DMSO i rör fyra och inkubera i en termisk cycler vid 37 grader Celsius i 15 minuter. Förbered fyra färska 1,7 milliliter mikrocentrifugrör och tillsätt 100 mikroliter av ellution nederbörd mix och två mikroliter glykogen till varje rör. Sedan in i vart och ett av dessa rör överföra all vätska från motsvarande PCR rör.Tillsätt 0,34 milliliter iskall 200-bevis etanol i varje rör och blanda genom att virvla i fem sekunder. Placera rören i en minus 80 grader Celsius frys i minst en timme. Sedan centrifugera rören i 15 minuter vid 14, 000 gånger G vid fyra grader Celsius.Utan att störa RNA-pelleten, avlägsna supernatanten från varje rör. Tillsätt 0,5 milliliter 80%etanol per rör för att tvätta RNA-pelleten och virveln i 15 sekunder. Efter centrifugering vid samma förhållanden igen, ta bort supernatanten och lufttorka RNA-pelleten i fem minuter.Tillsätt nio mikroliter av RNA: s fria vatten och rör som upp och ner 10 gånger för att blanda. Överför det ändrade RNA i fyra nya PCR-rör och märk dem en till fyra som i föregående steg. Lägg till två picomoles av RNA i sju mikroliter av DEPC-behandlat vatten till var och en av fyra ytterligare PCR-rör och märk dem med nummer fem till åtta.Lägg till två mikroliter av den återvunna radiolabeled primer till var och en av de åtta PCR-rören markerade en till åtta. Efter uppvärmning vid 65 grader Celsius i fem minuter, omedelbart svalna till fyra grader Celsius i termiska cycler. Tillsätt fyra mikroliter av 5x RT-buffert, en mikroliter på 0,1 molar DTT och en mikroliter DNTP-mix till vart och ett av rören.Tillsätt sedan två mikroliter av DEPC-behandlat vatten till rören ett till fyra. Tillsätt fyra mikroliter på fem millimolar ddATP till tub fem, fyra mikroliter på fem millimolar ddTTP till rör sex och fyra mikroliter på fem millimolar ddCTP till tub sju och en mikroliter på fem millimolar ddGTP och tre mikroliter av DEPC-behandlat vatten till tub åtta och pipett fyra gånger för att blanda. Efter uppvärmning av alla PCR-rör vid 52 grader Celsius i en minut i en termisk cycler, tillsätt en mikroliter av omvänd transkriptas till varje rör och rör den upp och ner fyra gånger för att blanda.Inkubera reaktionerna vid 52 grader Celsius i 20 minuter i termisk cycler. För att hydrolysera RNA, tillsätt en mikroliter av fem molar natriumhydroxid i vart och ett av rören och värm dem i 95 grader Celsius i fem minuter. Tillsätt sedan fem mikroliter av en molal saltsyra för att neutralisera reaktionen och upprepa etanolnederbörden som tidigare beskrivits.Efter lufttorkning av DNA-pelleten i fem minuter, tillsätt 10 mikroliter vatten och 10 mikroliter av 2xTBE urea prov lastning buffert i 1,7 milliliter rör och rör den upp och ner 10 gånger till redissolve. Värm proverna på 70 grader Celsius i fem minuter, sedan placera rören på is, innan du laddar på gelen. Lasta 10 mikroliter av provet som har placerats på is på 8%polyakrylamidsekvenseringsgel.Kör gelen på 65 watt i två timmar eller tills bottenfärgen når gelens 3/4:e. Ta bort distansen och sätt försiktigt in en spatel för att ta bort den översta silikoniserade glasplattan. Täck över gelen med en bit stort filterpapper och tryck försiktigt för att gelen ska kunna hålla sig till filterpappret.Med utgångspunkt från den nedre änden, lyft filterpapperet och ta bort gelen från glasplattan tillsammans med papperet. Efter överföring av gelen till ett omslagspapper som tidigare gjorts, torka den i 70 grader Celsius i en timme med ett vakuum, se till att använda flera filterpapper mellan gelen och torktumlare. Överför gelsmörgåsen på en fotoblekt fosforlagringsraskasseskassett och utsätt gelens radioaktivitet för skärmen i fyra till 16 timmar.Placera slutligen fosforlagringsskärmen på en bildanordning och skanna med medelupplösning i cirka 30 minuter. Efter utsätta polyacrylamide sekvensering gel till fosfor lagring skärmen, en framgångsrik form experiment visade en enda och mest intensiv böj på toppen av gelen och böjer hela gelen vid enda nukleotid upplösning utan smeta. Gelen visade också att intensiteten hos vissa böjningar förändrats i närvaro av små molekyler, vilket indikerar förändringar av basparningsstyrka.Ett vanligt problem i sidanalys är att en utstrykregion som kallas saltfronten kan dyka upp i mitten av gelén, troligen på grund av hög koncentration av salt, DMSO eller annat oönskat ämne i lastprovet. Det kan undvikas genom att ta bort den oönskade substansen genom etanol nederbörd. En homogen RNA-mall är att föredra för in vitro-form.Vi använder ribosomer vid både fem prime och tre prime ändarna för att få ett sådant RNA. I-cell form kan också utföras för att erhålla RNA sekundär struktur i cellulära sammanhang. Kom ihåg, in vitro-form får inte rekapitulera in vivo RNA bindande protein interaktioner.In vitro-form är en kraftfull metod för att upptäcka förändringar i RNA-strukturen på grund av närvaron av en liten molekyl. Detta görs genom att kvantifiera förändringar i mönsterstyrkan av omvänd transkriptas stannar. Var försiktig att alla experiment som beskrivs i denna video utföras på en auktoriserad radioaktiv arbetsplats med lämpligt personligt skydd och plexiglas avskärmning.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Slumpmässig mutagenes med användning Histon-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analys av omgivnings Partiklar-inducerad kromosomavvikelser Använda en<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Mareld Assay att karakterisera dygnsrytmen i mjölkkörtlar epitelceller

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Realtidsanalys av transkriptionsfaktor som bindande, transkription, översättning och omsättning under cellulär aktivering med visning av globala händelser

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

En Optogenetic metod för att kontrollera och analysera gen uttrycksmönster i Cell-till-cell interaktioner

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enda molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analys i spirande jäst vegetativ tillväxt och meios

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissektion av Enhancer-funktion som använder Multiplex CRISPR-baserade Enhancer störningar i cellinjer

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analys av alternativa Pre-mRNA Splicing i mus hjärnan sektioner med RNA In Situ hybridisering analys

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...