Name: using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes
Uploaded: 2019-01-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Bu eser (NS094721, K.A.J.) yanında NIH R01 vermek mümkün yapıldı.

1 vitro şekil.
Not: Protokol1yayımlanmış iletişim kuralı değiştirilir.
<ol><li>RNA şablon hazırlama Not: T7 transkripsiyon için şablon olarak sentetik çift DNA (dsDNA) iplikçikli ve EcoRI/BamHI kısıtlama endonükleaz siteleri, PCR tarafından veya pET28a gibi benzersiz bir çifti taşıyan bir E. coli vektör içine her iki ekleme tarafından güçlendirilmiş emri verildi. PCR güçlendirm...

<ol>
	<li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+Quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>Trausch, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+diversity+in+the+SAM+clan+of+riboswitches.">Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).</li><li>Souliere, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+a+riboswitch+response+through+structural+extension+of+a+pseudoknot.">Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).</li><li>Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+Analysis+of+Small+RNAs+and+Riboswitches.">SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches.</a> Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+SHAPE+analysis+in+living+cells.">RNA SHAPE analysis in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).</li><li>Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+a+small-molecule+modulator+of+SMN2+splicing.">Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).</li><li>Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mn+2++-Sensing+Mechanisms+of+yybP-ykoY+Orphan+Riboswitches.">Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches.</a> Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).</li><li>Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+contacts+control+switching+of+the+SAM-I+riboswitch.">Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch.</a> Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).</li><li>Abulwerdi, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Small+Molecules+with+a+Noncanonical+Binding+Mode+to+HIV-1+Trans+Activation+Response+(TAR)+RNA.">Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).</li><li>Shortridge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrocyclic+Peptide+Ligand+Binds+the+Oncogenic+MicroRNA-21+Precursor+and+Suppresses+Dicer+Processing.">A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).</li><li>Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+targeting+RNA+with+drug-like+small+molecules.">Principles for targeting RNA with drug-like small molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+against+RNA+targets+attract+big+backers.">Small molecules against RNA targets attract big backers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).</li><li>Shortridge, M. D., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+based+approaches+for+targeting+non-coding+RNAs+with+small+molecules.">Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules.</a> Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).</li><li>Gallego, J., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RNA+with+Small-Molecule+Drugs:+Therapeutic+Promise+and+Chemical+Challenges.">Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).</li><li>Rizvi, N. F., Smith, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+small+molecule+druggable+target.">RNA as a small molecule druggable target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).</li><li>Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Role+of+RNA+as+a+Therapeutic+Target+for+Small+Molecules.">The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules.</a> Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).</li><li>Palacino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splice+modulators+enhance+U1-pre-mRNA+association+and+rescue+SMA+mice.">SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice.</a> Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).</li><li>Ratni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Risdiplam,+a+Selective+Survival+of+Motor+Neuron-2+(+SMN2+)+Gene+Splicing+Modifier+for+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy+(SMA).">Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA).</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).</li><li>Naryshkin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMN2+splicing+modifiers+improve+motor+function+and+longevity+in+mice+with+spinal+muscular+atrophy.">SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy.</a> Science. 345, (2014).</li><li>Chiriboga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+Evidence+for+Pharmacodynamics+Effects+of+RG7916+in+JEWELFISH,+a+Study+in+Patients+with+Spinal+Muscular+Atrophy+who+Previously+Participated+in+a+Study+with+Another+SMN2-Splicing+Targeting+Therapy+(S46.003).">Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003).</a> Neurology. 90, (2018).</li><li>Sivaramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+SMN2+pre-mRNA-protein+complex+elicits+specificity+for+small+molecule+splicing+modifiers.">Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SHAPE+reagents+for+mapping+RNA+structures+inside+living+cells.">Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells.</a> RNA. 23, 169-174 (2017).</li><li>Weeks, K. M., Mauger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+Structural+Codes+with+SHAPE+Chemistry.">Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).</li><li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE+reveals+transcript-wide+interactions+,+complex+structural+domains+,+and+protein+interactions+across+the+Xist+lncRNA+in+living+cells.">SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).</li><li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+&#8242;+-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP)+for+direct+,+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis.">Selective 2 &#8242; -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes &amp; Development. 24, 1634-1644 (2010).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li><li>Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+SR+proteins+improves+SMN+expression+in+spinal+muscular+atrophy+cells.">Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells.</a> PloS One. 9, e115205 (2014).</li><li>Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+functional+implications+of+the+3D+architectures+of+viral+tRNA-like+structures.">Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures.</a> RNA. 15, 294-307 (2009).</li><li>Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+role+of+RNA+structure+in+alternative+splicing+of+a+critical+exon+in+the+spinal+muscular+atrophy+genes.">Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes.</a> Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).</li><li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy.">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).</li><li>Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+motif+discovery+by+SHAPE+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP).">RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP).</a> Nature Methods. 11, 959 (2014).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+Footprinting+to+Map+Sites+of+RNA-Protein+Interactions.">RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).</li><li>Velagapudi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+small+molecule+against+an+oncogenic+noncoding+RNA.">Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).</li><li>Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+NMR+to+structure+determination+of+RNAs+large+and+small.">Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).</li><li>Scott, L. G., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+determination+by+NMR.">RNA structure determination by NMR.</a> Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).</li></ol>

Tüp bebek şeklinde yüksek kaliteli homojen RNA şablonu kullanmak için önemlidir. T7 transkripsiyon, ancak, farklı yapılardaki serilerini36kez verir. Özellikle, önemsiz olmayan verimleri36 ile 3'-terminus adlı ±1 nükleotit sıralarıyla polyacrylamide jel arıtma tarafından kaldırılacak genellikle zordur. Türdeş olmayan RNA şablonu birden fazla sıralama jel bazen sonucu yorumlamak zorlaştırır astar uzantısı çarpımı profil oluşturma içinde sinyal...

Seçmeli 2'-hidroksil asilasyonu astar uzantısı (SHAPE) tarafından analiz her nükleotit bir RNA dizisinin ilgi içinde kinetik ölçme ve tek nükleotid çözünürlük1ikincil yapı elucidating bir yöntemdir. Şekil metodolojileri, tüp bebek koşulları2,3,4 (arıtılmış RNA içinde tanımlanmış arabellek sistem) her ikisi de ve içinde yaşayan memeli hücreleri5,6, ikincil araştırmak için geliştirilmiştir Orta uzunlukta RNA dizilerinin yapısı (genellikle < hücre içi şekil için 1.000 nukleotid ve < tüp bebek şekil için 200 nukleotid). Bağlama küçük molekül metabolitleri2,4,7,8 RNA etkileşim üzerine reseptör RNA yapısal değişiklikler değerlendirmek ve mekanik eylemler Çalışmaya özellikle yararlıdır hedefleme-RNA molekülleri sırasında ilaç geliştirme9,10.
İlaç keşif RNA hedefleme son zamanlarda ilgi gibi akademik laboratuvarları ve ilaç endüstrisi11,12 farklı yaklaşımlar ve stratejileri13,14,15 çekti ,16. Son RNA hedefleme küçük moleküller klinik kullanım için iki yapısal olarak farklı deneysel ilaç, LMI-07017 ve RG-791618,19, umut verici gösterdi kas spinal atrofisi (SMA), için örnekler Aşama II klinik çalışmalar20sonuçlarında. Her iki moleküller vardı motor nöron (SMN) hedef yaşama 2 pre-mRNA gösterdi ve Tutkallama işleminin SMN2 gen6,17,21düzenler. Biz daha önce vitro ve hedef RNA yapısal değişiklikler RG-7916 SMN-C26bilinen bir analog huzurunda incelenmesi şeklinde hücre içi uygulama gösterdi.
Prensip olarak, şekil tarafsız bir şekilde her nükleotit bir kendi kendine su verme asilasyonu reaktif aşırı miktarda huzurunda bir RNA dizisinin 2'-OH asilasyonu oranını ölçer. Asilasyonu reaktif su kısa bir yarı ömrü ile kararlı değil (örneğin, T1/2 = 17 s 1-metil-7-nitroisatoic anhidrit; veya 1 M 7, 2-methylnicotinic asit imidazolide ~ 20 dakika veya NAI)22 ve duyarsızlık kimliğine üsleri23. Her nükleotit dinamiklerini doğru bir değerlendirme dönüştürülebilir esnek bazlar 2'-OH grupları daha uygun bir asilasyonu sonuçlanır. Özellikle, bir nükleotid baz çifti içinde genellikle daha az reaktif NAI ve 1 M 7 gibi bir 2'-OH değiştirme reaktif için unpaired bir tane daha.
RNA şablonu ve nereye 2'-OH asilasyonu gerçekleşir kaynak bakarak, şekil genellikle tüp bebek ve hücre içi şekle kategorilere ayrılabilir. Vitro şekli kullanır saf T7 RNA transkripsiyonu ve Deneysel tasarımlar hücresel bir bağlamda yoksun. Hücre içi şeklinde RNA şablon transkripsiyon ve 2'-OH asilasyonu canlı hücreler içinde oluşur; Bu nedenle, sonuçlar RNA yapısal modeli hücresel bir bağlamda özetlemek. Hücre içi şekil için şekil vivo olduğu gibi edebiyat24canlı hücrelerde taşınan şekil için anılır olmuştur. Beri bu deney bir hayvan gerçekleştirilmez, doğruluk için hücre içi şekil olarak bu deneme olarak.
Tüp bebek ve hücre içi şekli astar uzantısı aşaması için stratejiler de farklıdır. Tüp bebek şeklinde Ters transkripsiyon huzurunda Mg2 +2'-OH asilasyonu konumunda durur. 32P-etiketli astar uzantısı bu nedenle bir grupta polyacrylamide jel elektroforez (sayfa) olarak görünür ve grup yoğunluğunu asilasyonu oranı1' e orantılıdır. Hücre içi şeklinde Ters transkripsiyon 2'-OH, rastgele mutasyonlar oluşturur pozisyon huzurunda Mn2 +sigara. Her nükleotit mutational oranı tarafından derinlik yeni nesil sıralama içinde yakalanabilir ve şekil reaktivite tek nükleotid çözünürlükte sonra hesaplanabilir.
Düşük sinyal-gürültü oranı hücre içi şekil için potansiyel sorun (değiştirilmemiş dizileri yeni nesil sıralama okuma çoğunu işgal yani, 2'-OH grupları çoğunluğu değiştirilmemiş, ise). Son zamanlarda, bir yöntem 2'-OH zenginleştirmek için RNA değiştiren, vivo olduğu gibi şekli (icSHAPE)'yi anılacaktır, Chang laboratuvar25tarafından geliştirilmiştir. Bu zenginleştirme yöntemi RNA etkileşimleri, özellikle transcriptome çapında sorgulama gibi zayıf küçük moleküller okumak avantajlı olabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>gBlock for &#62; 200 bp DNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin gel and PCR clean-up kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaScript T7 transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1333</td>
			<td>Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>750023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TBE-urea sample buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LC6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow&#8482; Filter Unit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Safe dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 % TBE-urea mini-gel</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EC6865BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C005MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperscreen&#8482; Intensifying Screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN1669</td>
			<td>calcium tungstate phosphor screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphor storage screen</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>BAS-IP MS 3543 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Typhoon</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAI (2M)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>03-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Contains 5X RT buffer, SuperScript IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddNTP set (5mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE27-2045-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>GD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Also contains RNase A and protease K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMN2 minigene34</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrpLE</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Ca/ Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Also contains RW1, RPE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Contains DNase I and RDD buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>random nonamer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11904-018</td>
			<td>Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime pfx DNA polymerse</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12344024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucAway column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM10070</td>
			<td>for desalting purpose</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro and in-cell shape to investigate small molecule induced pre-mrna structural changes

İlaç geliştirme sürecinde küçük moleküllerin RNA hedefleme, yapısal değişiklikler hedef RNA serileri ile ilişkileri üzerine elucidating arzu edilir. Biz burada detaylı vitro sağlamak ve hücre içi seçmeli 2'-hidroksil asilasyonu (SHAPE) iletişim kuralı RNA yapısal değişim varlığında spinal kas atrofisi (SMA), yaşama için deneysel bir ilaç çalışmaya astar uzantısı tarafından analiz motor nöron (SMN)-C2 ve pre-mRNA SMN2 gen 7 exon. Tüp bebek şeklinde 140 nükleotit SMN2 exon 7 içeren bir RNA dizisinin T7 RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu, SMN-C2 huzurunda katlanmış ve daha sonra bir hafif 2'-OH asilasyonu reaktif tarafından 2-methylnicotinic asit imidazolide (NAI) değiştirilmiş. Bu 2'-OH-NAI adduct daha fazla 32tarafından P olarak etiketlenmiş astar uzantısı probed ve polyacrylamide jel elektroforez (sayfa) tarafından çözüldü. Bunun tersi olarak, hücre içi şeklinde 2'-OH asilasyonu SMN-C2 bağlı Hücresel RNA ile yerinde yaşayan hücrelerde gerçekleşir. Exon 7 şekil kaynaklı mutasyonların astar Uzantısı ile birlikte SMN2 gen pre-mRNA dizisi sonra PCR ve yeni nesil sıralama tabi güçlendirilmiş. İki metodolojiler karşılaştırılması, tüp bebek şekli daha düşük maliyetli bir yöntemdir ve sonuçları görselleştirmek için bir işlem gücü gerektirmez. Ancak, tüp bebek RNA şekli elde edilen modeli bazen RNA bağlanıcı proteinler ile tüm etkileşim kaybı nedeniyle büyük olasılıkla hücresel bir bağlamda ikincil yapıdan sapma sergiliyor. Hücre içi şekli radyoaktif malzeme işyeri ihtiyacı yoktur ve bir daha doğru RNA ikincil yapı hücresel bağlamda verir. Ayrıca, hücre içi şekli genellikle geçerlidir tarafından yeni nesil sıralama, tüp bebek için karşılaştırıldığında kullanan daha büyük bir aralığı RNA dizileri (~ 1000 nukleotid) (~ 200 nukleotid) genellikle bu şekil için sayfa analizine dayanır. -Dibi takdirde eXoN 7 içinde SMN2 pre-mRNA, tüp bebek ve hücre içi şekil elde RNA modelleri birbirine benzer.

Biz daha önce modülatör Uçbirleştirme bir RNA SMN-C2, exon 7 SMN2 gene pre-mRNA üzerinde AGGAAG motifi ile etkileşim kurar ve şekil RNA yapısal değişiklikler SMN-C26huzurunda değerlendirmek için kullanılan olduğunu gösterdi. SMN-C2 bağlama sitenin FDA onaylı antianlamlı oligonükleotid (ASO) SMA, nusinersen, hangi bağlar ve intron 727,28 (Şekil 1A) intronic...

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes at JoVE.com

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Her iki tüp bebek ve hücre içi seçmeli 2'-hidroksil asilasyonu pre-mRNA dizileri bir RNA hedefleme küçük molekül huzurunda ilgi ikincil yapısını belirlemek için astar uzantısı (SHAPE) deneyler tarafından analiz için detaylı iletişim kuralları Bu makalede sunulan.

İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Bu video, küçük bir molekülü hedefleyen bir RNA'nın varlığındaki ilgi rna dizilerinin ikincil yapısını belirlemek için in vitro şekil deneyleri için ayrıntılı protokoller sağlayacaktır. İn vitro şekil genellikle 200 nükleotit daha az bir amino boyutlu RNA elementi üzerinde her nükleotit dinamiklerini anlamak için uygun maliyetli bir yöntemdir. El yazmasında açıklandığı gibi RNA şablonu hazırlandıktan sonra, bir gama 32P ATP ekleyerek radyo etiketi ters transkripsiyon astarlar, ters transkripsiyon astar.10XPNK reaksiyon tamponu, polinükleotid kinaz ve RNA'nın serbest suyu 1.7 mililitrelik mikrosentrifüge tüpünde toplam 20 mikrolitre hacimdedir. Sonra bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra 65 santigrat derece beri 20 dakika boyunca örnekleri etkinleştirin ve daha sonra 1000 kez G.Add 25 mikrolitre 2XTBE üre örnek tampon ve mix bir tuzsuzluk sütun ve santrifüj örnekleri filtreleyin.%10 akrilamid jel içine bu etiketli ürünleri düşürün ve üst rezervuarlar içine radyoaktivite kanama önlemek için emin olun. Bir saat boyunca 20 watt jel çalıştırın. Çalışmadan sonra jel kasetin cam plakalarını çıkarın.Jeli plastik ambalajın üzerine ser. Bir hava geçirmez sandviç yapmak için jel üstüne plastik katlayın. Bir kalsiyum-tungstate fosfor ekran üzerine jel sandviç yerleştirin ve bir hayal aleti ile ortaya çıkarmak.Jel kenarları nerede olduğunu bilmek için düzenli ışık ile tekrar jel görüntü. İki görüntüyü kaplamak ve açık ve koyu renkli görüntüleri kaplamak için bir görüntü işleme yazılımı kullanın. Daha sonra her iki görüntüyü aynı anda görmek için üstteki görüntüyü biraz opak hale getirin.Yazdırılan görüntünün gerçek jelle aynı boyutta olduğundan emin olun. Daha sonra yazdırılan görüntüdeki jeli hizalayın. Son olarak, jel istenilen virajları kesmek ve jel ayrı bir 1.7 mililitre mikrosantrifüj tüp her parça yerleştirmek için sterilize jilet kullanın.Pasif elüsasyon ile jel dilimden DNA kurtarmak için, her 1.7 mililitre tüp elüsyon yağış karışımı 0.3 mililitre ekleyin. Tüpleri radyoaktif güvenli bir kapta 16 saat boyunca dört derece santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra sıvıyı 1,7 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.2.5x buz soğuk 200 geçirmez etanol ekleyin ve sıvı karıştırmak için tüpleri altı kez ters çevirin. Tüpleri eksi 80 derecede en az bir saat kuluçkaya yatırın. 10 dakika boyunca 10, 000g ve dört santigrat derece santrifüj sonra, pipetleme tarafından dikkatle supernatant çıkarın.Pelet yıkamak için% 80 etanol bir mililitre ekleyin. Girdap 15 saniye ve santrifüj tekrar aynı koşullar altında. Supernatant'ı pipetleme ile çıkardıktan sonra, DNA peletini beş dakika havayla kurutun.RNA'nın serbest suyunun 50 mikrolitresini ekleyin ve 10 kez yukarı ve aşağı borular ekleyerek karıştırın. Bir sintillation sayacında mikrolitre başına dakikada 100,000 sayıma kadar DNA konsantrasyonunu normalleştirin. Kimyasal modifikasyon için dört numune hazırlamak için, 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 0,5 XTE tamponunun 32 mikrolitresinde sekiz adet RNA pikomolekleyin.Isı 80 santigrat derecede iki dakika ve en az bir dakika buz üzerinde serin snap. Sonra 5x katlama karışımı sekiz mikrolitre ekleyin, dört PCR tüpleri her içine bu RNA karışımı bir tahsis dokuz mikrolitre karıştırın, bir ila dört etiketli. Bir olarak işaretlenmiş tüpiçine% 10 DMSO bir mikrolitre ekleyin, tüp içine konsantre küçük molekül çözeltisi bir mikrolitre, tüp içine seyreltilmiş küçük molekül çözeltisi bir mikrolitre üç ve tüp dört içine su bir mikrolitre.Tüm PCR tüplerini 37 santigrat derecede bir termal döngüde 30 dakika kuluçkaya yatırın. İki ana OH modifikasyon reaksiyonundan hemen önce, 0,5 molar çalışma çözeltisi vermek için depc ile işlenmiş üç mikrolitre de iki molar NAI stok çözeltisinin bir mikrolitresini seyreltin. Hemen tüpler bir, iki ve üç içine bu çözeltinin bir mikrolitre ekleyin.Tüp dört içine% 25 DMSO bir mikrolitre ekleyin ve 15 dakika boyunca 37 derece santigrat bir termal döngü içinde kuluçka. Dört taze 1.7 mililitre mikrosantrifüj tüp hazırlayın ve her tüpe 100 mikrolitre elüsyon çökeltme karışımı ve iki mikrolitre glikojen ekleyin. Daha sonra bu tüplerin her biri içine ilgili PCR tüpleri tüm sıvı transferi.Her tüp içine buz gibi 200 geçirmez etanol 0,34 mililitre ekleyin ve beş saniye girdap tarafından karıştırın. Tüpleri eksi 80 derecelik dondurucuya en az bir saat yerleştirin. Sonra tüpleri 14,000 kez G'de 15 dakika santrifüj edin.RNA peletini rahatsız etmeden, her tüpten süpernatantı çıkarın. 15 saniye boyunca RNA pelet ve girdap yıkamak için tüp başına% 80 etanol 0,5 mililitre ekleyin. Tekrar aynı koşullarda santrifüj sonra, supernatant çıkarın ve hava-rna pelet beş dakika kuru.RNA'nın serbest su ve boru dokuz mikrolitre ekleyin yukarı ve aşağı 10 kez karıştırmak için. Modifiye Edilmiş RNA'yı dört yeni PCR tüpüne aktarın ve önceki adımda olduğu gibi 1-4 etiketleyin. Dört ek PCR tüpünün her birine yedi mikrolitre DEPC ile işlenmiş suya iki adet RNA pikomolü ekleyin ve bunları beş ila sekiz arasında sayılarla etiketleyin.Bir ila sekiz arasında işaretlenmiş sekiz PCR tüpünün her birine, kurtarılan radyoetiketli astarın iki mikrolitresini ekleyin. 5 dakika boyunca 65 santigrat derecede ısıtılmasından sonra, termal döngüde hemen 4 santigrat dereceye kadar soğuyun. Tüplerin her birine 5x RT tamponunun dört mikrolitresini, bir mikrolitre0 0,1 molar DTT ve bir mikrolitre DNTP karışımıekleyin.Daha sonra tüplere 1-4 depc ile işlenmiş iki mikrolitre su ekleyin. Tüp beş beş milimolar ddATP dört mikrolitre ekleyin, beş milimolar ddTP beş milimolar ddCTP dört mikrolitre tüp yedi ve beş milimolar ddGTP bir mikrolitre ve tüp sekiz ve pipet dört kez karıştırmak için DEPC ile tedavi su üç mikrolitre. Bir termal döngüiçinde bir dakika boyunca 52 santigrat derecede tüm PCR tüpleri ısıtma sonra, her tüp için ters transkriptaz bir mikrolitre ekleyin ve karıştırmak için dört kez yukarı ve aşağı boru.Reaksiyonları 52 derecede, termal döngüde 20 dakika kuluçkaya yatırın. RNA'yı hidrolize etmek için, tüplerin her birine beş molar sodyum hidroksit in bir mikrolitre ekleyin ve onları 95 derecede beş dakika ısıtın. Daha sonra reaksiyonu nötralize etmek ve daha önce açıklandığı gibi etanol yağışı tekrarlamak için bir molar hidroklorik asit beş mikrolitre ekleyin.DNA peletini beş dakika hava kuruttuktan sonra, 1,7 mililitrelik tüplerde 10 mikrolitre su ve 10 mikrolitre 2xTBE üre numune yükleme tamponu ekleyin ve 10 kez yeniden çözünmek için borulayın. Numuneleri 70 derecede beş dakika ısıtın, sonra jelüzerine yüklemeden önce tüpleri buza yerleştirin. Buz üzerine yerleştirilen numunenin 10 mikrolitresini %8 poliakrilamid sıralama jeline yükleyin.Jeli 65 watt'ta iki saat veya alt boya jelin üçte biri olana kadar çalıştırın. Spacer çıkarın ve yavaşça üst silikoncam plaka kaldırmak için bir spatula takın. Jeli büyük bir filtre kağıdı ile kaplayın ve jelin filtre kağıdına yapışmasını sağlamak için hafifçe bastırın.Alt uçtan başlayarak, filtre kağıdını kaldırın ve jeli kağıtla birlikte cam plakadan çıkarın. Daha önce yapıldığı gibi bir ambalaj kağıdına jel aktardıktan sonra, bir vakum ile bir saat boyunca 70 derece santigrat kuru, jel ve kurutucu arasında birkaç filtre kağıtları kullandığınızdan emin olun. Jel sandviçi fotoğrafla beyazlatılmış fosfor saklama ekranı kasetine aktarın ve jelin radyoaktivitesini 4 ila 16 saat boyunca ekrana takın.Son olarak, fosfor depolama ekranını bir görüntüleme cihazına yerleştirin ve yaklaşık 30 dakika orta çözünürlükte tarayabilirsiniz. Fosfor depolama ekranına poliakrilamid sıralama jelmaruz kaldıktan sonra, başarılı bir şekil deneyi jel üstünde tek ve en yoğun viraj gösterdi ve yayma olmadan tek nükleotit çözünürlükte jel boyunca virajlı. Jel ayrıca bazı bükümlerin yoğunluğunun küçük moleküllerin varlığında değiştiğini gösterdi, bu da baz eşleştirme mukavemetinin değiştiğini gösteriyordu.Sayfa analizinde sık karşılaşılan bir sorun, tuz cephesi olarak bilinen bir yayma bölgesinin jelin ortasında, muhtemelen yükleme numunesindeki yüksek tuz konsantrasyonu, DMSO veya diğer istenmeyen maddeler nedeniyle ortaya çıkmasıdır. Bu etanol yağış ile istenmeyen madde kaldırarak önlenebilir. Homojen Bir RNA şablonu in vitro şekil için tercih edilir.Biz böyle bir RNA elde etmek için hem beş asal ve üç prime ucunda ribozomlar kullanın. Hücre içi şekil de hücresel bağlamda RNA ikincil yapısı elde etmek için yapılabilir. Unutmayın, in vitro şekil in vivo RNA bağlayıcı protein etkileşimleri recapitulate olmayabilir.In vitro şekil küçük bir molekülün varlığı nedeniyle RNA yapısındaki değişiklikleri tespit etmek için güçlü bir yöntemdir. Bu ters transkriptaz durur desenleme gücü değişiklikleri ölçülmesi ile yapılır. Bu videoda açıklanan tüm deneylerin uygun kişisel koruma ve pleksiglas kalkanlı yetkili bir radyoaktif işyerinde yapılmasına karşı dikkatli olun.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Bir Kullanarak Ortam Partikül Madde kaynaklı kromozomal anormallikler Analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Sistem

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

Vitro Sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri ayırdetmek için bioluminescence tahlil

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...