Name: cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation
Uploaded: 2019-01-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation at JoVE.com

وأيده عمل المعاهد الوطنية للصحة-1R15HL135675-01 إلى تيموثي ج. لاروككا

1. إعداد المخازن المؤقتة والمواد الكاشفة
ملاحظة: انظر الجدول 1.
<ol><li>إعداد الحلول من المخزن المؤقت A والعينة المخزن المؤقت وتحلل المخزن المؤقت ب ديجيتونين.<ol>
<li>إعداد المخزن المؤقت A بإضافة 8.77 غرام من كلوريد الصوديوم و 50 مل من حبيس (1 م، ودرجة الحموضة 7.4) إلى 900 مل منزوع ...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Song, Y., Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+project+for+the+subcellular+proteome+of+mouse+liver.">Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver.</a> Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).</li><li>Lenstra, J. A., Bloemendal, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+of+the+total+protein+population+from+cultured+cells+upon+fractionation+by+chemical+extractions.">Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions.</a> European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).</li><li>Michelsen, U., von Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19+Isolation+of+Subcellular+Organelles+and+Structures.">Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures.</a> Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses).">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses).</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Endoplasmic+Reticulum,+Mitochondria,+and+Mitochondria-Associated+Membrane+and+Detergent+Resistant+Membrane+Fractions+from+Transfected+Cells+and+from+Human+Cytomegalovirus-Infected+Primary+Fibroblasts.">Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. 68, (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, a. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).</li><li>Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na,K-ATPase+transport+from+endoplasmic+reticulum+to+Golgi+requires+the+Golgi+spectrin-ankyrin+G119+skeleton+in+Madin+Darby+canine+kidney+cells.">Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).</li><li>McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenization+of+Mammalian+Tissue.">Homogenization of Mammalian Tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).</li></ol>

وضع هذا البروتوكول قد نشأت من عدم قدرة على فصل mitochondrial وعينات الغشاء، باستخدام مجموعات المتاحة تجارياً، بتحليل للتعريب البروتين خلال نيكروبتوسيس14. القيود الأساسية لمجموعات premade هي قدرتها على أن تتكيف مع احتياجات الباحثين من الأفراد، التكلفة لكل عينة وعدد محدود من العينات قا...

الهوية موثوقة للتعريب البروتين ضروري غالباً عند دراسة مسارات الجزيئية في الخلايا حقيقية النواة. وتستخدم أساليب الحصول على كسور سوبسيلولار من الباحثين بدراسة المكونات الخلوية من اهتمام أوثق.
معظم أساليب تجزئة الخلية الحالية عموما تندرج في فئتين عريضتين، تستند إلى المنظفات1،2 و على أساس تنبيذ فائق3،4،5، التي يمكن أن تكون متباينة بالسرعة والدقة والتكلفة. المنظفات البروتوكولات استناداً إلى الاعتماد على استخدام المخازن المؤقتة مع زيادة قوة المنظفات جعل العناصر المتميزة للخلية. وهذا هو طريقة سريعة وملائمة لتجهيز العينات، ويمكن أن تكون فعالة من حيث التكلفة إذا كان عدد وحجم العينات الصغيرة. يمكن شراء مجموعات تستند إلى مواد التنظيف لعزل هيولى والغشاء/عضية (الكسر مختلطة) والكسور النووي من الخلايا. ومع ذلك، تحد عيوباً عديدة ترتبط بهذه المجموعات فائدتها للباحثين. تهدف إلى عزل عناصر واحد أو اثنين من الخلية بسهولة ولكنهم غير قادرين على عزل جميع الكسور من عينة في نفس الوقت. استخدام المنظفات يعني أن الغشاء البلازمية والعضيات محاطة الغشاء سوف سولوبيليزيد على قدم المساواة، ومن ثم غير قادر على يمكن فصلها عن بعضها البعض. مضاعفات إضافية تنشأ عن مكونات الملكية في هذه المجموعات مما يمنع الباحثين من تغيير الظروف لتطبيقات محددة. وأخيراً، أنها محدودة في عدد من الاستخدامات وقد يكون باهظ التكلفة لإجراء التجارب على نطاق أكبر. توجد مجموعات استناداً إلى عدم-المنظفات لعزل الميتوكوندريا، بيد أنها لم تصمم لعزل غشاء البلازما وعينه العائد إلى حد كبير أقل من كثافة استخدام الطرد المركزي القائمة على عزل البروتوكولات6،7 .
الأساليب التي تستخدم تنبيذ فائق للحصول على الكسور هي أكثر وقتاً طويلاً، لكن كثيرا ما تؤدي الكسور أنقى من مجموعات تستند إلى مواد التنظيف. لعزل الأغشية البلازمية من الخلايا دون سولوبيليزينج الأولى لهم (الذي ينتج عنه تلوث بغشاء العضيات) يتطلب منها أن يكون تفكيك بأسلوب غير المنظفات متبوعاً بالفصل بين المكونات الخلوية عبر التفاضلية الطرد المركزي – مع غشاء البلازما العزلة التي تتطلب سرعة 100,000 × ز لإنجاز. في كثير من الحالات، يجب أن يتبعها الطرد المركزي التفاضلي إيسوبيكنيك الكثافة المتدرجة الطرد المركزي لمزيد من الانفصال كسور الخلوية أو إزالة الملوثات. في حين أن هذه الأساليب شاملة وقابلة للتعديل، تشمل عيوب التكلفة واستهلاك الوقت، والحاجة أولتراسينتريفوجي للفصل بين الكسور وكذلك تنقية عبر الكثافة المتدرجة الطرد المركزي. على معظم أجهزة الطرد المركزي عالية السرعة بتكلفة باهظة للمحققين الفردية، وهي غالباً ما يشارك، الأساسية للمعدات في المؤسسات الأكاديمية. وهكذا، يصبح توافر ultracentrifuge الباهظة في هذه الحالات.
في هذا البروتوكول تجزئة نظهر عزلة الكسور سوبسيلولار دون استخدام المنظفات سولوبيليزينج ودون استخدام الطرد المركزي عالية السرعة. سيسمح هذا الأسلوب الباحثون عزل غشاء البلازما والميتوكوندريا ومكونات هيولى الخلية حقيقية النواة مع الحد الأدنى من التلوث بين الكسور.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D0540</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22877-282</td>
			<td>For Homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61721</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td>For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J848</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12315</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td>For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
			<td>For Lysis buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M145</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>probe sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td>For Final Samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>227</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>788</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td>For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation

في هذا البروتوكول أننا بالتفصيل طريقة الحصول على كسور سوبسيلولار U937 الخلايا دون استخدام تنبيذ فائق أو المنظفات عشوائية. ويستخدم هذا الأسلوب المخازن المؤقتة ناقص التوتر، ديجيتونين، وتحلل الميكانيكية والطرد المركزي التفاضلي لعزل السيتوبلازم، الميتوكوندريا وغشاء البلازما. العملية يمكن تحجيمها لاستيعاب احتياجات الباحثين، وهي غير مكلفة وبسيطة. سيسمح هذا الأسلوب الباحثين لتحديد التعريب البروتين في الخلايا دون المتخصصة أجهزة الطرد المركزي، ودون استخدام مجموعات تجارية، والتي يمكن أن تكون باهظة التكاليف. أننا استخدمت بنجاح هذا الأسلوب لفصل سيتوسوليك وغشاء البلازما والبروتينات المتقدرية في خط الخلية الوحيدات البشرية U937.

وأنجزت تجزئة ناجحة من خلايا غير متمايزة من8 U937 تزرع في تعليق استخدام بروتوكول المفصلة أعلاه، وهو موضح في الشكل 1. العينات التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة قد تعرضوا لغربي النشاف9 استخدام أسلوب نقل رطب لغشاء الفينيليدن فلوريد (PVDF)...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation at JoVE.com

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

وجود خلية من خلايا U937 في غياب الطرد المركزي عالية السرعة

نقدم هنا، بروتوكولا لعزل غشاء البلازما والسيتوبلازم والميتوكوندريا U937 الخلايا دون استخدام الطرد المركزي عالية السرعة. يمكن استخدام هذا الأسلوب لتنقية الكسور سوبسيلولار لدراسة لاحقة للتعريب البروتين عن طريق إيمونوبلوتينج.

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

يسمح هذا البروتوكول للباحثين بالحصول على كسور متميزة من الخلية دون استخدام معدات متخصصة أو الكواشف المكلفة أو التقنيات المعقدة. الميزة الأساسية لهذا البروتوكول هو بساطة التقنيات التي تجعل من التعديل وسهلة الأداء. وسوف يكون إثبات الإجراء مات ديراغون، روب Haluska واليكسا Hodges.Three طلاب الدراسات العليا من مختبري. لبدء الطرد المركزي على استعداد تعليق الخلية لإنشاء بيليه. إزالة فائقة وإعادة تعليق بيليه في درجة حرارة الغرفة PBS. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية في 400 XG لمدة عشر دقائق. ثم إزالة افرنح وإعادة تعليق بيليه الخلية في الجليد العازلة الباردة. تحضير المخزن المؤقت حل وفقاً لبروتوكول النص. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية في 400 XG لمدة عشر دقائق وإزالة الفائق. إعادة تعليق بيليه في العازلة A الحل لتركيز النهائي من 200 مليون خلية لكل مل، وماصة بلطف لتفريق أي كتل. بعد هذا احتضان تعليق الخلية على نهاية على نهاية الدوار في 4

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

إعداد العملاق الحويصلات تغليف المجهرية بواسطة الطرد المركزي من مستحلب الماء في الزيت

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

التجويف النيتروجين والطرد المركزي التفاضلي يسمح بمراقبة توزيع البروتينات الغشاء المحيطي في الخلايا المستزرعة

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

تجزئة للقرار من الأنواع هونتينجتين القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

الكشف عن برينيليشن جتباسي صغيرة وأنشئ ملزمة باستخدام تجزئة غشاء ومقايسة الممتز GTPase مرتبطة

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

تحديد الفيرومونات لامبرى البحر باستخدام تجزئة تسترشد الحشري

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

قياس التفاعلات بين مجسات الفلورسنت والليغسين في أقسام النبات بواسطة sFLIM استنادا إلى الفلورية الاصليه

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

فائق السرعة الغربية لطخة باستخدام تقنية تحسين رد المناعة

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

تجزئة الخلايا لخلايا U937 عن طريق تنقية التدرج بكثافة isopycnic

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

قياس التفاعلات الملزمة بين Cu(II) وبقايا الببتيد في وجود وغياب الكروموفور

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...