Name: cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation
Uploaded: 2019-01-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation at JoVE.com

Arbejdet var støttet af NIH-1R15HL135675-01-Timothy J. LaRocca

1. Forbered buffere og reagenser
Bemærk: Se tabel 1.
<ol><li>Forberede løsninger af buffer A, lysisbuffer B, prøvebuffer og digitonin.<ol>
<li>Forbered buffer A ved at tilføje 8,77 g NaCl og 50 mL af HEPES (1 M, pH 7,4) til 900 mL deioniseret vand, justere endelige mængden til 1 L med deioniseret vand. Bemærk: Endelige koncentrationer er 150 NaCl og 50 mM HEPES.</li>
		<li>Forbered lysisbuffer B ved at tilføje 20 mL af HEPES (1 M, pH 7,4), 0,75 g af KCl, 0,19 g MgC...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Song, Y., Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+project+for+the+subcellular+proteome+of+mouse+liver.">Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver.</a> Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).</li><li>Lenstra, J. A., Bloemendal, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+of+the+total+protein+population+from+cultured+cells+upon+fractionation+by+chemical+extractions.">Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions.</a> European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).</li><li>Michelsen, U., von Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19+Isolation+of+Subcellular+Organelles+and+Structures.">Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures.</a> Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses).">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses).</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Endoplasmic+Reticulum,+Mitochondria,+and+Mitochondria-Associated+Membrane+and+Detergent+Resistant+Membrane+Fractions+from+Transfected+Cells+and+from+Human+Cytomegalovirus-Infected+Primary+Fibroblasts.">Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. 68, (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, a. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).</li><li>Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na,K-ATPase+transport+from+endoplasmic+reticulum+to+Golgi+requires+the+Golgi+spectrin-ankyrin+G119+skeleton+in+Madin+Darby+canine+kidney+cells.">Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).</li><li>McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenization+of+Mammalian+Tissue.">Homogenization of Mammalian Tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).</li></ol>

Udviklingen af denne protokol skyldtes manglende evne til at adskille mitokondrie og membran prøver, ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits, analyse af protein lokalisering under necroptosis14. De primære begrænsninger af premade kits er deres evne til at være tilpasset til behovene, som enkelte forskere, deres kostpris pr. prøve og begrænset antal prøver at blive behandlet. Metoden præsenteres her kan udføres uden brug af dyrt reagenser og uden behov for dyrt udstyr. Denne metode k...

Pålidelig identifikation af protein lokalisering er ofte nødvendig, når undersøge molekylære veje i eukaryote celler. Metoder til at opnå subcellulært fraktioner er udnyttet af forskere mere nøje undersøge cellulære komponenter af interesse.
Fleste af eksisterende celle fraktionering metoder generelt falder i to hovedkategorier, vaskemiddel-baseret1,2 og ultracentrifugering-baserede3,4,5, som kan være differentieret hastighed, præcision og pris. Vaskemiddel baseret protokoller er afhængige af brugen af buffere med vaskemiddel styrke for at solubilize forskellige komponenter i cellen. Dette er en hurtig og bekvem metode til behandling af prøver og kan være omkostningseffektive, hvis antal og størrelse af prøver er små. Vaskemiddel-baseret kits kan købes for at isolere cytoplasmatisk, membran/organelle (blandet brøkdel) og nukleare fraktioner fra celler. Dog begrænser flere ulemper forbundet med disse kits deres anvendelighed til forskere. De er designet til let isolere en eller to komponenter i cellen, men er stand til at isolere alle fraktioner fra en stikprøve samtidigt. Brugen af detergenter betyder, at plasma membran og membran-lukkede organeller vil være lige så solubilized og derfor ikke kan adskilles fra hinanden. En yderligere komplikation opstår fra de proprietære komponenter i disse kits, der forhindrer forskerne i at ændre betingelserne for specifikke applikationer. Endelig, de er begrænset i antal anvendelser og kan være uoverkommeligt dyre for større skala eksperimenter. Ikke-rengøringsmiddel baseret kits findes til isolering af mitochondrier, men de er ikke designet til at isolere plasma membran og prøve udbytte er betydeligt mindre end det fra tæthed centrifugering baseret isolation protokoller6,7 .
Metoder, der udnytter ultracentrifugering for at få fraktioner er mere tidskrævende, men ofte resultere i renere fraktioner end vaskemiddel-baseret kits. For at isolere plasma membraner fra celler uden første solubilizing dem (hvilket resulterer i forurening med membran organeller) kræver dem til at være mængden af en ikke-rengøringsmiddel metode efterfulgt af adskillelse af cellulære komponenter via differentieret centrifugering — med plasma membran isolation kræver hastigheder på 100.000 × g at udrette. I mange tilfælde skal differential centrifugering efterfulgt af isopycnic tæthed gradient centrifugering for yderligere adskillelse af cellulære brøker eller fjernelse af forurenende stoffer. Mens disse metoder er grundig og modificerbare, omfatter ulemper omkostninger, tidsforbrug og behovet for en ultracentrifuge til adskillelse af brøker og yderligere rensning via tæthed gradient centrifugering. De fleste Højhastighedscentrifuger er til en pris, der er uoverkommelige for enkelte undersøgelsesmedarbejdere og ofte delt, core udstyr på akademiske institutioner. Således bliver ultracentrifuge tilgængelighed uoverkommelige i disse situationer.
I protokollens fraktionering vise vi isolering af subcellulært brøker uden brug af solubilizing rengøringsmidler og uden hurtig centrifugering. Denne metode giver forskere at isolere plasma membran, mitokondrier og cytoplasmatisk komponenter i en eukaryote celle med minimal kontaminering mellem fraktioner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D0540</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22877-282</td>
			<td>For Homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61721</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td>For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J848</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12315</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td>For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
			<td>For Lysis buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M145</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>probe sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td>For Final Samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>227</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>788</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td>For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation

I denne protokol detaljer vi en metode til at opnå subcellulært brøkdele af U937 celler uden brug af ultracentrifugering eller vilkårlige rengøringsmidler. Denne metode udnytter hypotonic buffere, digitonin, mekaniske lysis og differentieret centrifugering at isolere cytoplasma, mitokondrier og plasma membran. Processen kan skaleres til at imødekomme behovene hos forskere, er billig og ligetil. Denne metode giver forskere til at bestemme protein lokalisering i celler uden specialiserede centrifuger og uden brug af kommercielle kits, som begge kan være uoverkommeligt dyre. Vi har med succes brugt denne metode til at adskille cytosole, plasma membran og mitokondrielle proteiner i humane monocyt cellelinie U937.

Vellykket fraktionering af udifferentierede U9378 celler dyrkes i suspension blev udført ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor og illustreret i figur 1. De prøver med denne metode blev udsat for western blotting9 udnytter en våd overførselsmetode til en polyvinylidene fluorid (PVDF) membran. Membranen blev efterfølgende aftestede med antistoffer mod cytoplasmatisk, mitokondrier og membran lokaliseret ...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation at JoVE.com

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Celle fraktionering af U937 celler i mangel af højhastighedstog centrifugering

Vi præsenterer her, en protokol for at isolere plasma membran, cytoplasma og mitokondrier af U937 celler uden brug af højhastighedstog centrifugering. Denne teknik kan bruges til at rense subcellulært brøker for efterfølgende undersøgelse af protein lokalisering via immunoblotting.

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Denne protokol giver forskerne mulighed for at opnå forskellige fraktioner af en celle uden brug af specialiseret udstyr, dyre reagenser eller komplekse teknikker. Den primære fordel ved denne protokol er enkelheden af de teknikker, der gør det modificerbare og let at udføre. Demonstration af proceduren vil være Matt Deragon, Rob Haluska og Alexa Hodges.Three kandidatstuderende fra mit laboratorium. Til at begynde centrifuge den forberedte celle suspension til at skabe en pellet. Fjern supernatanten, og ophæng pelletet igen i rumtemperatur PBS. Centrifuge cellen suspension ved 400 xg i ti minutter. Fjern derefter supernatanten og re-suspendere celle pellet i iskold buffer. Forbered buffer En løsning i henhold til tekstprotokollen. Centrifuge cellen suspension ved 400 xg i ti minutter og fjerne supernatant. Re-suspendere pellet i buffer En opløsning til en endelig koncentration på 200 millioner celler pr ml, og pipette forsigtigt at bryde op eventuelle klumper. Efter denne inkubering af cellefjedringen på en ende over ende rotator ved 4

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Fremstilling af Giant vesikler indkapslende mikrosfærer ved centrifugering af en vand-i-olie-emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Kvælstof kavitation og differentieret centrifugering giver mulighed for overvågning fordelingen af perifere Membranproteiner i kulturperler celler

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fraktionering for opløsning af opløselige og uopløselige Huntingtin arter

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning af små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjælp af membran fraktionering og GTPase-forbundet Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identifikation af Havlampretten feromoner ved hjælp af Bioassay-styrede fraktionering

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Måling af interaktioner mellem fluorescerende sonder og lignin i plante sektioner af sFLIM baseret på naturlig Auto Luorescens

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultra-High-Speed Western Blot ved hjælp af immunoreaktionsfremmende teknologi

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Cellefraktionering af U937-celler ved isopycnic densitetsgradientrensning

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Kvantificering af bindingsinteraktionerne mellem Cu (II) og peptidrester i nærvær og fravær af kromoforer

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...