Name: cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation
Uploaded: 2019-01-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation at JoVE.com

Travaux ont été subventionnés par les NIH-1R15HL135675-01 à Timothy J. LaRocca

1. Préparez les tampons et les réactifs
Remarque : Voir le tableau 1.
<ol><li>Préparer des solutions de tampons A, tampon de lyse B, tampon et digitonine.<ol>
<li>Préparer, tampon A en ajoutant 8,77 g de NaCl et 50 mL de HEPES (1 M, pH 7,4) à 900 mL d’eau désionisée, ajuster le volume final à 1 L avec de l’eau désionisée. Remarque : Les concentrations finales sont NaCl 150 mM et 50 mM HEPES.</li>
		<li>Préparer le tampon de lyse B en ajoutant 20 mL d’HE...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Song, Y., Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+project+for+the+subcellular+proteome+of+mouse+liver.">Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver.</a> Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).</li><li>Lenstra, J. A., Bloemendal, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+of+the+total+protein+population+from+cultured+cells+upon+fractionation+by+chemical+extractions.">Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions.</a> European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).</li><li>Michelsen, U., von Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19+Isolation+of+Subcellular+Organelles+and+Structures.">Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures.</a> Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses).">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses).</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Endoplasmic+Reticulum,+Mitochondria,+and+Mitochondria-Associated+Membrane+and+Detergent+Resistant+Membrane+Fractions+from+Transfected+Cells+and+from+Human+Cytomegalovirus-Infected+Primary+Fibroblasts.">Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. 68, (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, a. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).</li><li>Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na,K-ATPase+transport+from+endoplasmic+reticulum+to+Golgi+requires+the+Golgi+spectrin-ankyrin+G119+skeleton+in+Madin+Darby+canine+kidney+cells.">Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).</li><li>McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenization+of+Mammalian+Tissue.">Homogenization of Mammalian Tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).</li></ol>

L’élaboration du présent protocole est née de l’incapacité de séparer les mitochondries et les échantillons de membrane, utilisant des kits disponibles dans le commerce, pour l’analyse de la localisation des protéines au cours de la necroptosis14. Les limitations primaires de kits préfabriqués sont leur incapacité à être adapté aux besoins des chercheurs individuels, leur coût par échantillon et le nombre limité d’échantillons peuvent être traitées. La méthode présent?...

Une identification fiable de la localisation de la protéine est souvent nécessaire lors de l’examen des voies moléculaires dans les cellules eucaryotes. Méthodes pour obtenir des fractions subcellulaires sont utilisés par les chercheurs à examiner de plus près les composants cellulaires d’intérêt.
La plupart des méthodes de fractionnement cellulaire existant tombe généralement dans deux grandes catégories, à base de détergent1,2 et axée sur l’ultracentrifugation3,4,5, qui peut être différenciés par la vitesse, de précision et de coût. Protocoles de base détergents reposent sur l’utilisation de tampons avec augmentation de la force de détergent pour solubiliser des composantes distinctes de la cellule. C’est une méthode rapide et pratique pour le traitement des échantillons et peut être rentable si le nombre et la taille des échantillons sont de petite taille. Détergent à base de produits peuvent être achetés pour isoler cytoplasmique, membrane/organelle (fraction mixte) et des fractions nucléaires des cellules. Cependant, plusieurs inconvénients liés à ces kits limitent leur utilité pour les chercheurs. Ils sont conçus pour isoler facilement un ou deux composants de la cellule, mais sont incapables d’isoler toutes les fractions auprès d’un échantillon en même temps. L’utilisation de détergents signifie que la membrane plasmique et l’enveloppe membranaire organites vont être tout aussi solubilisées et, par conséquent, impossible d’être séparés l’un de l’autre. Une complication supplémentaire vient les composants propriétaires dans ces kits, qui empêche les chercheurs de modifier les conditions pour des applications spécifiques. Enfin, ils sont limités en nombre d’utilisations et peuvent être prohibitifs pour des expériences à échelle plus grandes. Kits de base non détergente existent pour l’isolation des mitochondries, cependant, ils ne sont pas conçus pour isoler la membrane plasmique et le rendement de l’échantillon est nettement inférieure à celle de la centrifugation de densité basée isolement protocoles6,7 .
Les méthodes qui utilisent l’ultracentrifugation pour obtenir des fractions sont plus prendrait beaucoup de temps, mais souvent le résultat dans les fractions plus purs que le détergent à base de produits. Pour isoler les membranes plasmiques des cellules sans premier solubilisation eux (entraînant la contamination avec les organites membranaires) doit pouvoir être lysées par une méthode non détergente suivie de la séparation des composants cellulaires via différentiel centrifugation — avec l’isolement de la membrane plasmique nécessitant des vitesses de 100 000 × g d’accomplir. Dans bien des cas, centrifugation différentielle doit être suivie d’une centrifugation gradient de densité isopycnique pour davantage de séparation des fractions cellulaires ou enlèvement de contaminants. Bien que ces méthodes soient approfondies et modifiable, les inconvénients incluent coût, consommation de temps et la nécessité d’une ultracentrifugeuse pour la séparation des fractions et autres purification par centrifugation gradient de densité. La plupart des centrifugeuses à grande vitesse sont à un coût qui est prohibitif pour les chercheurs individuels et sont souvent partagés, core équipement aux institutions académiques. Ainsi, la disponibilité ultracentrifugeuse devient prohibitive dans ces situations.
Dans ce protocole de fractionnement, nous démontrons l’isolement des fractions subcellulaires sans l’utilisation de détergents de solubilisation et sans centrifugation à haute vitesse. Cette méthode permettra aux chercheurs d’isoler la membrane plasmique, les mitochondries et les composants cytoplasmiques d’une cellule eucaryote avec contamination minime entre les fractions.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D0540</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22877-282</td>
			<td>For Homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61721</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td>For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J848</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12315</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td>For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
			<td>For Lysis buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M145</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>probe sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td>For Final Samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>227</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>788</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td>For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation

Dans ce protocole, nous détaillons une méthode pour obtenir des fractions subcellulaires des cellules U937 sans l’utilisation d’ultracentrifugation ou détergents sans discernement. Cette méthode utilise des tampons hypotoniques, digitonine, lyse mécanique et centrifugation différentielle pour isoler le cytoplasme, la mitochondrie et la membrane plasmique. Le processus peut être adapté pour répondre aux besoins des chercheurs, est peu coûteux et simple. Cette méthode permettra aux chercheurs de déterminer la localisation des protéines dans les cellules sans centrifugeuses spécialisés et sans l’utilisation de kits commerciaux, qui peuvent être prohibitifs. Nous avons utilisé avec succès cette méthode pour séparer cytosolique, la membrane plasmique et la protéines mitochondriales chez la lignée monocytaire humaine U937.

Succès le fractionnement des indifférenciées U9378 cellules cultivées en suspension a été accompli en utilisant le protocole indiqué ci-dessus et illustré à la Figure 1. Les échantillons obtenus avec cette méthode ont été soumis à western blotting9 utilisant une méthode de transfert humide sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF). La membrane a été sondée par la suite avec des ant...

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Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Fractionnement de cellules des cellules U937 en l’Absence de Centrifugation à haute vitesse

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les membrane plasmique, cytoplasme et les mitochondries des cellules U937 sans l’utilisation de la centrifugation à grande vitesse. Cette technique peut servir à purifier les fractions subcellulaires pour un examen subséquent de la localisation de la protéine par immunoblotting.

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Ce protocole permet aux chercheurs d’obtenir des fractions distinctes d’une cellule sans l’utilisation d’équipement spécialisé, de reagents coûteux ou de techniques complexes. Le principal avantage de ce protocole est la simplicité des techniques qui le rendent modifiable et facile à exécuter. La démonstration de la procédure sera Matt Deragon, Rob Haluska et Alexa Hodges.Trois étudiants diplômés de mon laboratoire. Pour commencer la centrifugeuse, la suspension cellulaire préparée pour créer une pastille. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau la pastille à température ambiante PBS. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 xg pendant dix minutes. Retirez ensuite le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans un tampon glacé. Préparer le tampon Une solution selon le protocole de texte. Centrifugez la suspension cellulaire à 400 xg pendant dix minutes et retirez le supernatant. Suspendre à nouveau la pastille dans la solution tampon A à une concentration finale de 200 millions de cellules par ml, et pipette doucement pour briser les touffes. Après cette incubation, la suspension cellulaire sur une extrémité au-dessus du rotateur d’extrémité à 4

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