Name: cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation
Uploaded: 2019-01-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation at JoVE.com

עבודה נתמכה על ידי NIH-1R15HL135675-01 כדי טימותי ג' רוקה

1. מכינים Buffers וראגנטים
הערה: ראה טבלה 1.
<ol><li>להכין פתרונות של מאגר A, פירוק מאגר B, מאגר מדגם digitonin.<ol>
<li>להכין מאגר על-ידי הוספת 8.77 g של NaCl ו- 50 מ של HEPES (1 מ', pH 7.4) יונים 900 מל מים, לכוון עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר עם מים יונים. הערה: ריכוזי הסופי הם 150 מ מ NaCl 50 מ מ HEPES.</li>
		<li>הכ?...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Song, Y., Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+project+for+the+subcellular+proteome+of+mouse+liver.">Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver.</a> Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).</li><li>Lenstra, J. A., Bloemendal, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+of+the+total+protein+population+from+cultured+cells+upon+fractionation+by+chemical+extractions.">Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions.</a> European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).</li><li>Michelsen, U., von Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19+Isolation+of+Subcellular+Organelles+and+Structures.">Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures.</a> Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses).">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses).</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Endoplasmic+Reticulum,+Mitochondria,+and+Mitochondria-Associated+Membrane+and+Detergent+Resistant+Membrane+Fractions+from+Transfected+Cells+and+from+Human+Cytomegalovirus-Infected+Primary+Fibroblasts.">Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. 68, (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, a. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).</li><li>Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na,K-ATPase+transport+from+endoplasmic+reticulum+to+Golgi+requires+the+Golgi+spectrin-ankyrin+G119+skeleton+in+Madin+Darby+canine+kidney+cells.">Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).</li><li>McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenization+of+Mammalian+Tissue.">Homogenization of Mammalian Tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).</li></ol>

הפיתוח של פרוטוקול זה עלתה מחוסר היכולת להפריד מיטוכונדריאלי ודוגמאות ממברנה, באמצעות ערכות זמינים מסחרית, לניתוח של חלבון לוקליזציה במהלך necroptosis14. המגבלות העיקרי של ערכות premade הם היכולת שלהם להתאים את הצרכים של חוקרים בודדים, שלהם עלות לדוגמה, מספר מצומצם של דוגמאות מסוגל לה...

זיהוי אמין של חלבון לוקליזציה הכרחי לעתים קרובות בעת בחינת מסלולים מולקולריים בתאים האיקריוטים. שיטות להשגת שברים subcellular מנוצלים על ידי חוקרים לבחון מקרוב את מרכיבי התא עניין.
רוב שיטות קיימות fractionation תא בדרך כלל נחלקים לשתי קטגוריות רחבות, המבוסס על אבקת1,2 ומבוסס-ultracentrifugation3,4,5, אשר יכול להיות מובחנת על ידי מהירות, דיוק ועלות. דטרגנט פרוטוקולים מבוסס מסתמכים על השימוש במאגרים עם הגדלת כוח דטרגנט solubilize רכיבים נפרדים של התא. זו היא שיטה מהירה ונוחה לעיבוד דגימות והוא יכול להיות העלות האפקטיבית אם המספר והגודל של דגימות קטנות. ניתן לרכוש ערכות המבוסס על אבקת לבודד cytoplasmic ממברנה/אברון (שבר מעורב), שברים גרעיני תאים. עם זאת, מספר חסרונות הקשורים עם ערכות אלה להגביל את התועלת שלהם לחוקרים. הם נועדו בקלות לבודד את מרכיבי התא אחד או שניים, אך אינם מסוגלים לבודד כל שברים מתוך מדגם בו-זמנית. השימוש של דטרגנטים אומר כי קרום פלזמה של organelles מוקף קרום להיות באותה מידה solubilized ולכן אין אפשרות להיות מופרדים אחד מהשני. סיבוך נוסף נובע הרכיבים קניינית ערכות אלה אשר מונעת חוקרים שינוי התנאים עבור יישומים ספציפיים. לבסוף, הם מוגבלים למספר שימושים, עשוי להיות יקר מדי עבור ניסויים בקנה מידה גדול יותר. ערכות בסיס חומרי שאינם קיימים עבור בידודו של המיטוכונדריה, עם זאת, הם לא נועדו כדי לבודד קרום פלזמה, התשואה מדגם הוא משמעותית פחות מזה של צפיפות צנטריפוגה מבוסס בידוד פרוטוקולים6,7 .
שיטות לנצל ultracentrifugation להשיג שברים הם יותר זמן צריכת, אבל לעתים קרובות התוצאה בחלקים מזוכך יותר ערכות מבוססי דטרגנט. כדי לבודד ממברנות פלזמה מתאי ללא הראשון solubilizing אותם (וכתוצאה מכך זיהום עם קרום organelles) דורש מהם כדי להיות lysed על ידי שיטה ללא חומרי ואחריו ההפרדה של מרכיבי התא באמצעות דיפרנציאל צנטריפוגה — עם בידוד קרום פלזמה הדורשים מהירויות של × 100,000 g כדי להשיג. במקרים רבים, צנטריפוגה דיפרנציאלית חייב להיות במעקב על-ידי isopycnic צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה להפרדה נוספת של שברים הסלולר או הסרה של מזהמים. בעוד ששיטות אלה הם יסודי ומשתנות, החסרונות כוללים עלות צריכת זמן, את הצורך ultracentrifuge על הפרדה בין שברים ומספרים נוספים טיהור באמצעות צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה. צנטריפוגות במהירות גבוהה ביותר הן בעלות זה אוסרני עבור חוקרים בודדים ולעיתים קרובות משותף, ליבה של ציוד במוסדות אקדמיים. לפיכך, זמינות ultracentrifuge הופך אוסרני במצבים אלה.
ב פרוטוקול fractionation זה נדגים את ניתוקה של שברים subcellular ללא שימוש solubilizing דטרגנטים וללא צנטריפוגה במהירות גבוהה. שיטה זו תאפשר חוקרים לבודד את קרום פלזמה, המיטוכונדריה, cytoplasmic מרכיבי תא האיקריוטים עם זיהום מזערי בין שברים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D0540</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22877-282</td>
			<td>For Homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61721</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td>For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J848</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12315</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td>For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
			<td>For Lysis buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M145</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>probe sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td>For Final Samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>227</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>788</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td>For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation

ב פרוטוקול זה אנחנו מפרטים שיטה להשיג שברים subcellular של תאים U937 ללא שימוש ultracentrifugation או בדטרגנטים ללא הבחנה. שיטה זו משתמשת מאגרי היפוטוניק, digitonin, פירוק מכני, צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד את הציטופלסמה, המיטוכונדריה ואת קרום פלזמה. התהליך וניתן לשנותם כדי להתאים את הצרכים של החוקרים, היא פעולה פשוטה וזולה. שיטה זו יאפשר לחוקרים לקבוע לוקליזציה של חלבונים בתאים ללא בדיקות מיוחדות וללא שימוש קיטים מסחריים, אשר שניהם ניתן לחדשו. אנחנו משתמשים בהצלחה זו שיטה להפרדת cytosolic, קרום פלזמה, חלבונים מיטוכונדריאלי בקו התא האנושי מונוציט U937.

Fractionation מוצלחת של U937 מובחן8 תאים גדל ההשעיה הושג באמצעות פרוטוקול שתוארו לעיל, מאויר באיור1. הדגימות שהושג עם שיטה זו היו נענשים המערבי סופג9 ניצול שיטת העברה רטוב כדי קרום פלואוריד (PVDF) polyvinylidene. הקרום נבדקה לאחר מכן עם נוגדנים נגד ...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation at JoVE.com

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את קרום פלזמה, הציטופלסמה ואת המיטוכונדריה U937 תאים ללא שימוש צנטריפוגה במהירות גבוהה. טכניקה זו ניתן לטהר שברים subcellular הבאים בחינת לוקליזציה חלבון באמצעות immunoblotting.

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להשיג שברים ברורים של תא ללא שימוש בציוד מיוחד, רייגנטים יקרים או טכניקות מורכבות. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא הפשטות של הטכניקות המאפשרות לו להיות ניתן לשכפול וקל לביצוע. הדגמת ההליך יהיה מאט Deragon, רוב Haluska ואלכסה הודג'ס.שלושה סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל צנטריפוגה ההשעיה התא מוכן כדי ליצור גלולה. הסר את supernatant ולהשעות מחדש את גלולה בטמפרטורת החדר PBS. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 400 xg במשך עשר דקות. ואז להסיר את supernatant מחדש להשעות את גלולת התא במאגר קר קרח. הכנת מאגר פתרון בהתאם לפרוטוקול הטקסט. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 400 xg במשך עשר דקות ולהסיר את supernatant. להשעות מחדש את גלולה במאגר פתרון לריכוז סופי של 200 מיליון תאים לכל מ"ל, ו pipette בעדינות כדי לשבור את כל הגושים. לאחר דגירה זו ההשעיה התא על קצה מעל מסובב קצה ב 4

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

הכנת ענק שלפוחית ​​encapsulating מיקרוסכמות על ידי צנטריפוגה של אמולסיה מים ב-שמן

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fractionation רזולוציה של מינים Huntingtin מסיסים ובחלקם לא מסיסים

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

זיהוי של GTPase Prenylation קטן ו GTP איגוד באמצעות ממברנה Fractionation ו GTPase-מקושרים Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

הזיהוי של פרומונים ים עגולי הפה באמצעות מונחה Bioassay Fractionation

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

מדידת אינטראקציות בין הפלורסנט לליגנין בסעיפים צמחיים על ידי sFLIM בהתבסס על מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מקורית

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

כתם מערבי במהירות גבוהה במיוחד באמצעות טכנולוגיית שיפור Immunoreaction

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

פיצול תאים של תאי U937 על ידי טיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

כימות אינטראקציות הקשירה בין שאריות Cu(II) ופפטידיות בנוכחות ובהיעדר כרומופורים

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...