Name: cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation
Uploaded: 2019-01-18T15:00:00
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कार्य NIH द्वारा समर्थित किया गया था-1R15HL135675-01 करने के लिए तीमुथियुस जे LaRocca

1. बफ़र्स और रिएजेंट्स तैयार करें
नोट: 1 तालिकादेखें ।
<ol><li>बफ़र A, lysis बफ़र B, नमूना बफ़र और digitonin के समाधान तैयार करें ।<ol>
<li>NaCl के ८.७७ जी और HEPES के ५० मिलीलीटर (1 एम, पीएच ७.४) को ९०० मिलीलीटर पानी से जो...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Song, Y., Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+project+for+the+subcellular+proteome+of+mouse+liver.">Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver.</a> Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).</li><li>Lenstra, J. A., Bloemendal, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+of+the+total+protein+population+from+cultured+cells+upon+fractionation+by+chemical+extractions.">Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions.</a> European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).</li><li>Michelsen, U., von Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19+Isolation+of+Subcellular+Organelles+and+Structures.">Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures.</a> Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. 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D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, a. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).</li><li>Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na,K-ATPase+transport+from+endoplasmic+reticulum+to+Golgi+requires+the+Golgi+spectrin-ankyrin+G119+skeleton+in+Madin+Darby+canine+kidney+cells.">Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).</li><li>McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenization+of+Mammalian+Tissue.">Homogenization of Mammalian Tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल का विकास necroptosis14के दौरान प्रोटीन स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए, वाणिज्यिक उपलब्ध किट का उपयोग कर, mitochondrial और झिल्ली के नमूनों को अलग करने में असमर्थता से उठी । निर्मित किट की प्राथमिक ?...

प्रोटीन स्थानीयकरण की विश्वसनीय पहचान अक्सर आवश्यक है जब eukaryotic कोशिकाओं में आणविक रास्ते की जांच । तरीके सेलुलर भागों को प्राप्त करने के लिए शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग किया जाता है और अधिक बारीकी से ब्याज की सेलुलर घटकों की जांच ।
मौजूदा सेल भिन्नीकरण विधियों के बहुमत आम तौर पर दो व्यापक श्रेणियों में गिरावट, डिटर्जेंट-आधारित1,2 और ultracentrifugation-आधारित3,4,5, जो हो सकता है गति, परिशुद्धता और लागत से विभेदित । डिटर्जेंट आधारित प्रोटोकॉल solubilize कोशिका के विशिष्ट घटकों के लिए बढ़ती डिटर्जेंट ताकत के साथ बफर के उपयोग पर भरोसा करते हैं । इस नमूने प्रसंस्करण के लिए एक तेजी से और सुविधाजनक तरीका है और संख्या और नमूनों की आकार छोटे हैं, तो लागत प्रभावी हो सकता है । डिटर्जेंट आधारित किट cytoplasmic, झिल्ली/organelle (मिश्रित अंश), और कोशिकाओं से परमाणु भागों को अलग करने के लिए खरीदा जा सकता है । हालांकि, इन किट के साथ जुड़े कई कमियां शोधकर्ताओं के लिए उनकी उपयोगिता सीमा । वे आसानी से सेल के एक या दो घटकों को अलग करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, लेकिन एक नमूना से सभी भागों को अलग करने में असमर्थ हैं समवर्ती. डिटर्जेंट के इस्तेमाल का मतलब है कि प्लाज्मा झिल्ली और झिल्ली से घिरा organelles समान रूप से solubilized होगा और, इसलिए, एक दूसरे से अलग होने में असमर्थ । एक अतिरिक्त जटिलता इन किट जो विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए शर्तों में फेरबदल से शोधकर्ताओं को रोकता में मालिकाना घटकों से उठता है । अंत में, वे उपयोग करता है की संख्या में सीमित है और बड़े पैमाने पर प्रयोगों के लिए नकारात्मक स्तर तक महंगा हो सकता है । गैर-डिटर्जेंट आधारित किट mitochondria के अलगाव के लिए मौजूद है, तथापि, वे प्लाज्मा झिल्ली को अलग करने के लिए डिज़ाइन नहीं कर रहे है और नमूना उपज है कि घनत्व से अधिक है कम है अलगाव6,7 प्रोटोकॉल आधारित .
तरीकों कि ultracentrifugation का उपयोग करने के लिए भागों को प्राप्त करने के लिए और अधिक समय लगता है, लेकिन अक्सर डिटर्जेंट से purer अंश में परिणाम आधारित किट । पहले उंहें solubilizing बिना कोशिकाओं से प्लाज्मा झिल्ली को अलग करने के लिए (झिल्ली organelles के साथ संदूषण में जिसके परिणामस्वरूप) की आवश्यकता है उंहें एक गैर से लीजड ड होने के लिए-डिटर्जेंट अंतर के माध्यम से सेलुलर घटकों के विभाजन के बाद विधि केंद्रापसारक-प्लाज्मा झिल्ली अलगाव १००,००० × जी की गति की आवश्यकता के साथ पूरा करने के लिए । कई मामलों में, अवकलन केंद्रापसारक सेलुलर भागों या संदूषणों को हटाने के आगे जुदाई के लिए isopycnic घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा पीछा किया जाना चाहिए । हालांकि इन तरीकों को पूरी तरह से और संशोधित कर रहे हैं, कमियां लागत, समय की खपत में शामिल है, और अंशों के जुदाई के लिए एक ultracentrifuge के लिए की जरूरत है और आगे घनत्व ढाल केंद्रापसारक के द्वारा शुद्धि । सबसे उच्च गति केंद्रापसारक एक लागत है कि व्यक्तिगत जांचकर्ताओं के लिए निषिद्ध है और अक्सर साझा कर रहे हैं, अकादमिक संस्थानों में मुख्य उपकरण पर हैं । इस प्रकार, ultracentrifuge उपलब्धता इन स्थितियों में निषिद्ध हो जाती है ।
इस अंश प्रोटोकॉल में हम solubilizing डिटर्जेंट के उपयोग के बिना और उच्च गति केंद्रापसारक के बिना उपसेलुलर भागों के अलगाव का प्रदर्शन । इस विधि के शोधकर्ताओं प्लाज्मा झिल्ली को अलग करने के लिए अनुमति देगा, mitochondria और अंशों के बीच न्यूनतम संदूषण के साथ एक eukaryotic सेल के cytoplasmic घटकों.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D0540</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22877-282</td>
			<td>For Homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61721</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td>For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J848</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12315</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td>For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
			<td>For Lysis buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M145</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>probe sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td>For Final Samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>227</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>788</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td>For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation

इस प्रोटोकॉल में हम विस्तार एक विधि ultracentrifugation या अंधाधुंध डिटर्जेंट के उपयोग के बिना U937 कोशिकाओं के सेलुलर भागों प्राप्त करने के लिए । इस विधि hypotonic बफ़र्स, digitonin, यांत्रिक lysis और अंतर केंद्रापसारक कोशिका द्रव्य, mitochondria और प्लाज्मा झिल्ली को अलग करने के लिए इस्तेमाल करता है । प्रक्रिया को शोधकर्ताओं की जरूरतों को समायोजित किया जा सकता है, सस्ती और सीधा है । इस विधि शोधकर्ताओं विशिष्ट केंद्रापसारक बिना कोशिकाओं में प्रोटीन स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए और वाणिज्यिक किट के उपयोग के बिना, दोनों जिनमें से नकारात्मक स्तर तक महंगा हो सकता है की अनुमति देगा । हमने इस विधि को मानव monocyte कोशिका रेखा U937 में cytosolic, प्लाज्मा झिल्ली और mitochondrial प्रोटीन को अलग करने के लिए सफलतापूर्वक प्रयोग किया है ।

विभेदित U9378 कोशिकाओं निलंबन में वृद्धि के सफल अंश ऊपर विस्तृत प्रोटोकॉल का उपयोग कर पूरा किया गया था और चित्र 1में सचित्र । इस विधि के साथ प्राप्त नमूनों पश्चिमी सोख्ता<su...

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Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

उच्च गति के केंद्रापसारक के अभाव में U937 कोशिकाओं के सेल अंश

यहां, हम एक प्रोटोकॉल के लिए प्लाज्मा झिल्ली, कोशिका द्रव्य और U937 कोशिकाओं के mitochondria उच्च गति केंद्रापसारक के उपयोग के बिना अलग मौजूद हैं । इस तकनीक immunoblotting के माध्यम से प्रोटीन स्थानीयकरण के बाद परीक्षा के लिए उपसेलुलर भागों शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को विशेष उपकरण, महंगे अभिकर्ण या जटिल तकनीकों के उपयोग के बिना एक कोशिका के विशिष्ट अंश प्राप्त करने की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल का प्राथमिक लाभ तकनीकों की सादगी है जो इसे संशोधित और प्रदर्शन करने में आसान बनाती है। प्रक्रिया का प्रदर्शन मैट Deragon, रोब Haluska और एलेक्सा हॉजेस होगा । मेरी प्रयोगशाला से तीन स्नातक छात्रों । एक गोली बनाने के लिए तैयार सेल निलंबन अपकेंद्रित्र शुरू करने के लिए। सुपरनेट निकालें और कमरे के तापमान पीबीएस में गोली को फिर से निलंबित करें। दस मिनट के लिए 400 xg पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। फिर सुपरनेट निकालें और आइस कोल्ड बफर में सेल पेलेट को फिर से सस्पेंड करें। टेक्स्ट प्रोटोकॉल के हिसाब से बफर ए सॉल्यूशन तैयार करें। दस मिनट के लिए 400 xg पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र और सुपरनैंट को हटा दें। बफर में गोली को फिर से निलंबित करें प्रति मिलीलीटर 200 मिलियन कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता का समाधान, और किसी भी झुरमुट को तोड़ने के लिए धीरे-धीरे पिपेट करें। इस के बाद 4 पर अंत रोटेटर पर एक अंत पर सेल निलंबन इनक्यूबेट

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

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Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

घुलनशील और अघुलनशील Huntingtin प्रजातियों के समाधान के लिए भिन्नीकरण

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अपव्यय Microgravimetry फॉस्फोलिपिड बाइंडिंग प्रोटीन की बाइंडिंग गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए Annexin A2 करने के लिए ठोस-समर्थित लिपिड Bilayers एक क्वार्ट्ज प्रतिध्वनि का उपयोग

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Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

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इम्यूनोरेक्शन बढ़ाने वाली तकनीक का उपयोग करके अल्ट्रा-हाई-स्पीड वेस्टर्न ब्लॉट

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Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

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Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

क्रोमोफोरस की उपस्थिति और अनुपस्थिति में सीयू (द्वितीय) और पेप्टाइड अवशेषों के बीच बाध्यकारी इंटरैक्शन की मात्रा निर्धारित करना

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...