Name: cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation
Uploaded: 2019-01-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation at JoVE.com

仕事に NIH-1R15HL135675-01 ティモシー j. ラロッカに支えられ

1. バッファーおよび試薬
注: は、テーブル 1を参照してください。
<ol><li>バッファー A、B の換散バッファー、サンプル バッファーおよびジギトニンのソリューションを準備します。<ol>
<li>バッファー A を準備するには、NaCl の 8.77 g と 900 mL の脱イオン水 50 mL HEPES (1 M、pH 7.4) の調整を脱イオン水 1 L に最終巻を追加します。 注: 最終濃度は、150 mM の NaCl と...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Song, Y., Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+project+for+the+subcellular+proteome+of+mouse+liver.">Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver.</a> Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).</li><li>Lenstra, J. A., Bloemendal, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+of+the+total+protein+population+from+cultured+cells+upon+fractionation+by+chemical+extractions.">Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions.</a> European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).</li><li>Michelsen, U., von Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19+Isolation+of+Subcellular+Organelles+and+Structures.">Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures.</a> Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses).">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses).</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Endoplasmic+Reticulum,+Mitochondria,+and+Mitochondria-Associated+Membrane+and+Detergent+Resistant+Membrane+Fractions+from+Transfected+Cells+and+from+Human+Cytomegalovirus-Infected+Primary+Fibroblasts.">Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. 68, (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, a. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).</li><li>Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na,K-ATPase+transport+from+endoplasmic+reticulum+to+Golgi+requires+the+Golgi+spectrin-ankyrin+G119+skeleton+in+Madin+Darby+canine+kidney+cells.">Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).</li><li>McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenization+of+Mammalian+Tissue.">Homogenization of Mammalian Tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).</li></ol>

このプロトコルの開発は、ミトコンドリアを分離することができないと膜サンプル、市販キットを用いたネクロトーシス14中タンパク質の局在の解析から生まれた。既成のキットの主な制限は、サンプルとサンプルを処理することの限られた数、単価、各研究者のニーズに適応する無力です。ここで紹介した方法は、高価な試薬を使用せず、高価な機器の必要性なしに実行?...

蛋白質のローカリゼーションの確実な同定は、真核細胞の分子経路を調べてみる必要があります。内分を取得する方法は、興味の細胞成分を調べる研究者によって活用されます。
既存のセル分別方法の大半は一般に洗剤ベース1,2および遠心ベース3,4、5、することができます 2 つの広範なカテゴリに分類します。スピード ・精度・ コストによって区別されます。洗剤ベース プロトコルはセルの異なるコンポーネントを可溶化する洗剤の高強度化をバッファーの使用に頼る。これはサンプルを処理するための迅速かつ便利な方法で、数とサンプルのサイズが小さい場合は費用対効果にすることができます。細胞質膜/オルガネラ (混合割合)、細胞から核分画を分離するため洗剤ベース キットを購入できます。しかし、これらのキットに関連付けられているいくつかの欠点は、研究者への有用性を制限します。彼らは、簡単にセルの 1 つまたは 2 つのコンポーネントを分離するために設計されていますが、同時にサンプルからすべての画分を分離することができません。洗剤の使用を意味する血しょう膜、膜で囲まれた細胞内小器官が均等に溶こと、したがって、お互いから分離することができません。その他の合併症は、これらのキットは研究者が特定のアプリケーションのための条件を変更するを防止する独自のコンポーネントから発生します。最後に、彼らは、使用回数に制限が、非常に大きい実大施工実験高価かもしれません。非洗剤ベース キットは、ミトコンドリアの分離、膜を分離する設計されていませんし、サンプルの利回りは大幅密度遠心分離からのそれより小さいベース分離のプロトコル6,7.
分画遠心を利用する方法はより時間がかかるが、しばしば洗剤ベース キットよりも純粋な分数の結果。最初可 (膜小器官による汚染の結果) それらのない細胞から膜を分離するには、必要があります細胞コンポーネントを介して差動の分離に続いて非洗剤法による分離遠心分離、膜分離を達成する 100,000 × gの速度を必要とします。多くの場合、差動遠心分離細胞一部分または汚染物質の除去のさらに分離のための密度密度勾配遠心による従わなければなりません。これらのメソッドは、徹底的に、変更可能なコスト、時間消費、および分数とさらに浄化経由で密度勾配遠心分離用超遠心機の必要性の欠点が含まれます。ほとんど高速遠心分離機は、個々 の調査官とはしばしば共有、教育機関の機器のコアは、法外なコストです。したがって、超遠心機可用性はこのような状況で禁止になります。
この分別のプロトコルでは、内分可洗剤を使用せず、高速遠心分離なしの分離を示しています。このメソッドは、細胞膜、ミトコンドリアと分数の間の雑菌と真核細胞の細胞質成分を隔離して研究者になります。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D0540</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22877-282</td>
			<td>For Homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61721</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td>For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J848</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12315</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td>For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
			<td>For Lysis buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M145</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>probe sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td>For Final Samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>227</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>788</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td>For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation

このプロトコル細胞遠心や無差別な洗剤を使用せず U937 細胞画分を取得する方法を詳しく説明します。このメソッドは、細胞質、ミトコンドリア、細胞膜を分離する差動遠心分離機械換散、ジギトニン低張性バッファーを利用します。プロセスは、研究者のニーズに対応することができます、安価で簡単です。このメソッドは、セル特殊な遠心分離機とどちらが極端に高くなることができる市販のキットの使用なしで蛋白質のローカリゼーションを決定する研究者になります。このゾル性細胞質の分離方法、細胞膜、ミトコンドリア蛋白質は、正常にひと単球細胞 u937 で利用させていただきました。

未分化 U937 細胞懸濁液で栽培の成功の分別は、上記の詳細し、図 1に示したプロトコルを使用して達成されました。この方法で得られた試料は、ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜に濡れた転送法を用いた西部しみが付く9に服従しました。膜はその後に対する抗体をプローブ細胞質、ミトコンドリア膜局在蛋白質?...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation at JoVE.com

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

高速遠心分離のない状態で U937 細胞のセル分別

ここでは、細胞膜、細胞質、高速遠心分離を使用せず U937 細胞のミトコンドリアを分離するためのプロトコルを提案する.この手法は、蛋白質のローカリゼーションを介して免疫ブロットの後続受験内分を浄化するために使用できます。

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

このプロトコルは、専門の装置、高価な試薬や複雑な技術を使用せずに細胞の明確な分画を得ることができます。このプロトコルの主な利点は、変更可能で実行しやすい手法のシンプルさです。手順を実証するには、マット・デラゴン、ロブ・ハルスカ、アレクサ・ホッジスです。ペレットを作成するために調製した細胞懸濁液を遠心分離を開始する。上清を取り除き、室温PBSでペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を400xgで10分間遠心分離する。その後、上清を取り除き、氷の冷たい緩衝液中の細胞ペレットを再中断します。バッファを準備する テキスト プロトコルに従ってソリューションを準備します。細胞懸濁液を400 xgで10分間遠心し、上清を取り除く。バッファー内のペレットを再中断する溶液は、1ml当たり2億個の細胞の最終濃度に溶液し、ピペットを穏やかに分解して塊を分解する。この後、4でエンドオーバー回転器のエンド上の細胞懸濁液をインキュベート

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

油中水型エマルションの遠心分離により巨大ベシクルカプセル化微小球の調製

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

窒素キャビテーションと差動遠心分離培養細胞の周辺膜蛋白質の分布を監視することができます。

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

水溶性と不溶性の Huntingtin 種の解像度の分別

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

小さい gtp アーゼ プレニル化および分子量 GTP 結合を使用して膜分画と gtp アーゼ抗体法の検出

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

バイオアッセイ誘導分別を使用して海ヤツメウナギ フェロモンの同定

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

ネイティブ自己蛍光に基づくsFLIMによる植物切片における蛍光プローブとリグニン間の相互作用の測定

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

免疫反応向上技術を用いた超高速ウェスタンブロット

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

等密度勾配精製によるU937細胞の細胞分画

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

発色団の存在下および非存在下におけるCu(II)とペプチド残基間の結合相互作用の定量化

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...