Name: cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation
Uploaded: 2019-01-18T15:00:00
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작업은 NIH-1R15HL135675-01 티모시 J. LaRocca에 의해 지원 되었다

1. 버퍼와 시 약 준비
주: 표 1을 참조 하십시오.
<ol><li>버퍼 A, 세포의 용 해 버퍼 B, 샘플 버퍼 및 digitonin의 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>NaCl의 8.77 g와 900 mL 이온된 물, HEPES (1 M, pH 7.4) 50 mL 조정 이온 물 1 L에 최종 볼륨을 추가 하 여 버퍼 A를 준비 합니다. 참고: 최종 농도 150 mM NaCl 및 50 mM HEPES.</li>
		<li>에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N의 2 mL KCl, MgCl2...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Song, Y., Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+project+for+the+subcellular+proteome+of+mouse+liver.">Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver.</a> Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).</li><li>Lenstra, J. A., Bloemendal, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+of+the+total+protein+population+from+cultured+cells+upon+fractionation+by+chemical+extractions.">Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions.</a> European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).</li><li>Michelsen, U., von Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19+Isolation+of+Subcellular+Organelles+and+Structures.">Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures.</a> Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses).">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses).</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Endoplasmic+Reticulum,+Mitochondria,+and+Mitochondria-Associated+Membrane+and+Detergent+Resistant+Membrane+Fractions+from+Transfected+Cells+and+from+Human+Cytomegalovirus-Infected+Primary+Fibroblasts.">Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. 68, (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, a. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).</li><li>Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na,K-ATPase+transport+from+endoplasmic+reticulum+to+Golgi+requires+the+Golgi+spectrin-ankyrin+G119+skeleton+in+Madin+Darby+canine+kidney+cells.">Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).</li><li>McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenization+of+Mammalian+Tissue.">Homogenization of Mammalian Tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).</li></ol>

이 프로토콜의 개발은 미토 콘 드리 아를 분리 하는 무 능력 하 고 막 샘플, necroptosis14동안 단백질 지 방화의 분석을 위해 상용 키트를 사용 하 여에서 발생 했다. Premade 키트의 주요 한계는 그들의 무 능력 개인 연구자의 요구에 적응 될 샘플 및 샘플 처리 수의 제한 된 수의 비용. 비싼 시 약의 사용과 고가의 장비에 대 한 필요성 없이 여기에 제시 된 메서드를 수행할 수 있습니다...

단백질 지 방화의 신뢰할 수 있는 id는 진 핵 세포에 있는 분자 통로 조사할 때 경우가 많습니다. 방법 subcellular 분수를 더 밀접 하 게 검사 세포 구성 성분의 연구자에 의해 활용 됩니다.
기존의 셀 분류 방법의 대부분은 일반적으로 두 개의 넓은 범주로, 세제 기반1,2 , ultracentrifugation 기반3,,45, 될 수 있는 속도, 정확성 및 비용에 의해 분화 된다. 셀의 고유 구성 요소를 solubilize 세제 힘 증가 함께 버퍼의 사용에 의존 하는 세제 기반된 프로토콜. 이 샘플을 처리 하는 신속 하 고 편리한 방법 이며, 비용 효과적일 수 있다 수와 샘플의 크기는 작은 하는 경우. 세포질, 막/세포 기관이 (혼합된 분수), 및 세포에서 핵 분수 분리 세제 기반 키트를 구입할 수 있습니다. 그러나, 이러한 장비와 관련 된 몇 가지 단점이 연구원에 게 그들의 유용성을 제한 한다. 그들은 쉽게 셀의 하나 또는 두 개의 구성 요소를 분리 하도록 설계 되었습니다 하지만 샘플에서 모든 분수를 동시에 차단 할 수 있다. 세제의 사용 의미는 원형질 막과 세포 막 동봉 하는 것입니다 수 똑같이 solubilized 및, 그러므로, 서로에서 분리 될 수 없습니다. 추가 합병증이 키트 연구원은 특정 응용 프로그램에 대 한 조건을 변경 하지 못하도록 독점 구성 요소에서 발생 합니다. 마지막으로, 그들은 사용에 제한 되 고 엄청나게 큰 규모의 실험에 대 한 비용이 있을 수 있습니다. 그러나 비 세제 기반된 키트 미토 콘 드리 아의 격리에 대 한 존재,, 원형질 막 분리 설계 되지 않았습니다 및 샘플 수율은 훨씬 밀도 원심에서 저것 보다는 더 적은 격리 프로토콜6,7 기반으로 .
분수를 ultracentrifugation를 사용 하는 메서드는 더 시간이 소모, 하지만 종종 세제 기반 키트 보다 순수한 분수에 결과. 그들 뒤에 세포질 분 대를 통해 차동의 분리 비 세제 메서드에서 lysed 첫 solubilizing 그들 (막 세포와 오염 결과로) 하지 않고 셀에서 플라즈마 막 분리 필요 원심 분리-원형질 막 절연 요구를 달성 하기 위해 100000 × g 의 속도. 대부분의 경우, isopycnic 밀도 그라데이션 원심 분리 추가 대 한 셀룰러 분수 또는 오염 물질의 제거의 차등 원심을 뒤 합니다. 이러한 방법은 철저 하 고 수정할 수 있지만, 단점 등 비용, 시간 소비, 분수와 더 정화를 통해 밀도 그라데이션 원심 분리에 대 한 ultracentrifuge에 대 한 필요. 대부분 고속 원심 분리기는 개별 조사와는 종종 교육 기관에서 장비를 코어 공유, 금지는 비용에 있습니다. 따라서, ultracentrifuge 가용성 이러한 상황에서 금지 된다.
이 분류 프로토콜 solubilizing 세제의 사용 없이 및 고속 원심 분리 하지 않고 subcellular 분수의 보여 줍니다. 이 메서드는 원형질 막, 미토 콘 드리 아 및 분수 사이 최소한의 오염으로 진 핵 세포의 세포질 구성 요소를 분리 하는 연구자 수 있게 됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D0540</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22877-282</td>
			<td>For Homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61721</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td>For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J848</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12315</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td>For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
			<td>For Lysis buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M145</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>probe sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td>For Final Samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>227</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>788</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td>For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation

이 프로토콜에서 우리를 ultracentrifugation 또는 무차별 세제의 사용 없이 U937 세포의 subcellular 분수를 받는 방법을 자세하게. 이 메서드 사용 소형 버퍼, digitonin, 기계적인 세포 및 세포질, 미토 콘 드리 아 및 원형질 막 분리 차등 원심 분리 합니다. 과정은 연구자의 요구에 맞게 확장할 수 있습니다, 그리고 저렴 하 고 간단. 이 메서드는 특수 원심 분리기와 둘 다 엄청나게 비쌀 수 있는 상업용 키트를 사용 하지 않고 셀에 단백질 지 방화를 결정 하기 위해 연구원 수 있게 됩니다. 성공적으로 인간 monocyte 셀 라인 U937이 cytosolic 분리 하는 방법, 원형질 막 및 미토 콘 드리 아 단백질 사용 했습니다.

Undifferentiated U9378 셀 서 스 펜 션에서의 성공적인 분류는 위에서 자세히 설명 하 고 그림 1에 나와 있는 프로토콜을 사용 하 여 달성 되었다. 이 방법으로 얻은 샘플 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막에 젖은 전송 방법을 이용 하 여 서쪽 더 럽 히9 를 받게 했다. 막에 대 한 항 체와 조사 이후에 세포질, 미토 콘 드 리아 멤브?...

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Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

고속 원심 분리의 부재에서 U937 세포의 세포 분별 법

여기, 선물이 원형질 막, 세포질 및 고속 원심 분리의 사용 없이 U937 세포의 미토 콘 드리 아를 분리 하는 프로토콜. 이 기술은 정화 subcellular 분수 immunoblotting 통해 단백질 지역화의 후속 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

이 프로토콜을 통해 연구원은 특수 장비, 고가의 시약 또는 복잡한 기술을 사용하지 않고 셀의 뚜렷한 분수를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 수정 가능하고 수행하기 쉬운 기술의 단순성입니다. 절차를 시연하는 것은 맷 데라곤, 롭 할루스카, 알렉사 호지스.내 실험실에서 대학원생 3명입니다. 원심분리를 시작하려면 준비된 세포 현탁액을 생성하여 펠릿을 생성한다. 상체를 제거하고 실온 PBS에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 10 분 동안 400 xg에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 그런 다음 상체를 제거하고 얼음 차가운 버퍼에서 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 버퍼 A 솔루션을 준비합니다. 10 분 동안 400 xg에서 세포 현탁액을 원심 분리하고 상체를 제거합니다. 완충액A용액을 ml당 2억개의 세포에 재농축하고, 파이펫을 부드럽게 하여 덩어리를 분해한다. 이 후 4에서 끝 회전기에 세포 현탁액을 인큐베이션

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

유 중수 에멀젼의 원심 분리에 의해 거 소포 캡슐화 미소 구의 제조

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

연구

생화학

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

질소 현상과 차등 원심 분리 배양된 세포의 주변 막 단백질의 분포를 모니터링 가능

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

가용성과 불용 성 Huntingtin의 해상도 대 한 분류

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

생물 검정 기반 분류를 사용 하 여 바다 심고 페로몬의 식별

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

네이티브 오토플루임션을 기반으로 sFLIM에 의한 식물 섹션의 형광 프로브와 리그닌 간의 상호 작용 측정

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

면역 반응 강화 기술을 이용한 초고속 웨스턴 블롯

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 U937 세포의 세포 분획

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

발색단의 존재 및 부재 하에 Cu(II)와 펩티드 잔기 사이의 결합 상호작용을 정량화하기

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...