Name: cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation
Uploaded: 2019-01-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation at JoVE.com

Arbeidet ble støttet av NIH-1R15HL135675-01 til Timothy J. LaRocca

1. klargjør buffere og reagenser
Merk: Se tabell 1.
<ol><li>Utarbeide løsninger av buffer A, lyseringsbuffer B, prøve buffer og digitonin.<ol>
<li>Utarbeide buffer en ved å legge 8.77 g NaCl og 50 mL av HEPES (1 M, pH 7.4) til 900 mL vaskebuffer vann, justere siste volum til 1 L med deionisert vann. Merk: Siste konsentrasjoner er 150 mM NaCl og 50 mM HEPES.</li>
		<li>Forberede lyseringsbuffer B ved å legge til 20 mL HEPES (1 M, pH 7.4) 0,75 g KCl, 0,19 g av MgCl<sub...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Song, Y., Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+project+for+the+subcellular+proteome+of+mouse+liver.">Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver.</a> Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).</li><li>Lenstra, J. A., Bloemendal, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+of+the+total+protein+population+from+cultured+cells+upon+fractionation+by+chemical+extractions.">Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions.</a> European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).</li><li>Michelsen, U., von Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19+Isolation+of+Subcellular+Organelles+and+Structures.">Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures.</a> Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses).">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses).</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Endoplasmic+Reticulum,+Mitochondria,+and+Mitochondria-Associated+Membrane+and+Detergent+Resistant+Membrane+Fractions+from+Transfected+Cells+and+from+Human+Cytomegalovirus-Infected+Primary+Fibroblasts.">Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. 68, (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, a. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).</li><li>Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na,K-ATPase+transport+from+endoplasmic+reticulum+to+Golgi+requires+the+Golgi+spectrin-ankyrin+G119+skeleton+in+Madin+Darby+canine+kidney+cells.">Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).</li><li>McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenization+of+Mammalian+Tissue.">Homogenization of Mammalian Tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).</li></ol>

Utviklingen av denne protokollen oppsto fra manglende evne til å skille mitokondrie og membran datautvalg, bruke kommersielt tilgjengelige kits, for analyse av protein lokalisering under necroptosis14. Primære begrensningene av forhåndslagde kits er deres manglende evne å tilpasses behovene til forskere, kostnadene per eksempler og begrenset antall prøver kunne behandles. Metoden som presenteres her kan utføres uten bruk av dyre reagenser og uten behovet for dyrt utstyr. Denne metoden kan sk...

Pålitelig identifikasjon av protein lokalisering er ofte nødvendig når undersøke molekylær stier i eukaryote celler. Metoder for å få subcellular fraksjoner benyttes av forskere å undersøke nærmere cellulære komponenter av interesse.
Fleste av eksisterende celle fraksjoneres metoder generelt faller inn i to hovedkategorier, vaskemiddel-baserte1,2 og ultracentrifugation-baserte3,4,5, som kan differensiert av hastighet, presisjon og pris. Vaskemiddel basert protokollene er avhengige av bruk av buffere med økende vaskemiddel styrke til å solubilize ulike komponenter i cellen. Dette er en rask og enkel metode for prosessering prøver kan være kostnadseffektivt Hvis antallet og størrelsen på prøvene er små. Vaskemiddel-baserte kits kan kjøpes for å isolere cytoplasmatiske membran/organelle (blandet brøkdel) og kjernefysiske fraksjoner celler. Men begrense flere ulemper forbundet med disse pakkene nytteverdien til forskere. De er laget for å lett isolere en eller to komponenter i cellen, men er i stand til å isolere alle fraksjoner fra et utvalg samtidig. Bruk av rengjøringsmidler betyr at plasma membran og membran-Tilknytta organeller vil være like solubilized og derfor ikke kan skilles fra hverandre. Ekstra komplisert oppstår fra proprietære komponentene i disse pakkene som hindrer forskere i å endre betingelsene for bestemte programmer. Til slutt, de er begrenset i antall bruker og kan være uoverkommelig dyrt for større skala eksperimenter. Ikke-rengjøringsmiddel basert kits finnes for isolering av mitokondrier, men de er ikke laget for å isolere plasma membranen og prøve avkastningen er betydelig mindre enn fra tetthet sentrifugering basert isolasjon protokoller6,7 .
Metoder som bruker ultracentrifugation for å få fraksjoner er mer tidkrevende, men ofte resultere i renere fraksjoner enn vaskemiddel-baserte kits. Å isolere plasma membraner fra celler uten første solubilizing dem (som fører til forurensning med membran organeller) krever dem til å være lysed av en ikke-rengjøringsmiddel metode etterfulgt av separasjon av cellulære komponenter via differensial sentrifugering, med plasma membranen isolasjon krever hastigheter på 100.000 × g å oppnå. I mange tilfeller etterfølges differensial sentrifugering av isopycnic tetthet gradert sentrifugering for ytterligere separasjon av mobilnettet brøker eller fjerning av miljøgifter. Mens disse metodene er grundig og modifiserbare, inkludere ulemper kostnader, tidsforbruk og behovet for en ultracentrifuge for separasjon av brøker og ytterligere rensing via tetthet gradert sentrifugering. De fleste høyhastighets sentrifuger er en kostnad som er uoverkommelige for individuelle etterforskere og er ofte delt, core utstyr på akademiske institusjoner. Dermed blir ultracentrifuge tilgjengelighet uoverkommelige i disse situasjonene.
Denne fraksjoneres protokollen viser vi isolering av subcellular brøk uten bruk av solubilizing vaskemidler og uten høyhastighets sentrifugering. Denne metoden vil tillate forskere isolere plasma membran, mitokondrier og cytoplasmatiske komponentene i en eukaryot celle med minimal forurensning mellom fraksjoner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D0540</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22877-282</td>
			<td>For Homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61721</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td>For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J848</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12315</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td>For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
			<td>For Lysis buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M145</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>probe sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td>For Final Samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>227</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>788</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td>For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation

I denne protokollen detalj vi en metode for å få subcellular fraksjoner av U937 celler uten bruk av ultracentrifugation eller vilkårlig vaskemidler. Denne metoden bruker hypotonisk buffere, digitonin, mekaniske lyse og differensial sentrifugering isolere cytoplasma, mitokondrier og plasma membran. Prosessen kan skaleres for å imøtekomme behovene til forskere, billig og enkel. Denne metoden vil tillate forskere å bestemme protein lokalisering i celler uten spesialiserte sentrifuger og uten bruk av kommersielle kits, begge kan være uoverkommelig dyrt. Vi har brukt denne metoden til å skille cytosolic, plasma membranen og mitokondrie proteiner i menneskelig monocytt celle linjen U937.

Vellykket fraksjoneres av udifferensierte U9378 celler dyrket i suspensjon ble gjort ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor og illustrert i figur 1. Prøvene med denne metoden ble utsatt for vestlige blotting9 utnytte en våt overføringsmetode å en polyvinylidene fluor (PVDF) membran. Membranen deretter undersøkt med antistoffer mot cytoplasmatiske, mitokondrie og membran lokalisert protein markører (<st...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation at JoVE.com

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Celle fraksjoneres av U937 celler i fravær av høyhastighets sentrifugering

Her presenterer vi en protokoll for å isolere plasma membran, cytoplasma og mitokondrier U937 celler uten bruk av høyhastighets sentrifugering. Denne teknikken kan brukes til å rense subcellular brøker for påfølgende undersøkelse av protein lokalisering via immunoblotting.

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Denne protokollen gjør det mulig for forskere å få forskjellige fraksjoner av en celle uten bruk av spesialisert utstyr, dyre reagenser eller komplekse teknikker. Den primære fordelen med denne protokollen er enkelheten i teknikkene som gjør den modifiserbar og enkel å utføre. Demonstrere prosedyren vil være Matt Deragon, Rob Haluska og Alexa Hodges.Tre graduate studenter fra laboratoriet mitt. For å begynne sentrifuge forberedt celle suspensjon for å skape en pellet. Fjern den overnaturlige og re-suspendere pellet i romtemperatur PBS. Sentrifuger cellesuspensjonen på 400 xg i ti minutter. Fjern deretter det overnaturlige og re-suspendere cellepellet i iskald buffer. Klargjør buffer En løsning i henhold til tekstprotokollen. Sentrifuger cellefjæringen på 400 xg i ti minutter og fjern supernatanten. Re-suspendere pellet i buffer En løsning til en endelig konsentrasjon på 200 millioner celler per ml, og pipette forsiktig for å bryte opp noen klumper. Etter denne inkubere cellefjæringen på en ende over ende rotator på 4

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Utarbeidelse av Giant vesikler innkapsle mikrosfære ved sentrifugering av en vann-i-olje emulsjon

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Nitrogen kavitasjon og differensial sentrifugering tillater overvåking fordelingen av ytre membran proteiner i kulturperler celler

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fraksjoneres for løsning av løselig og uløselig Huntingtin arter

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning av små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjelp av membran fraksjoneres og GTPase-koblede Immunosorbent analysen

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identifikasjon av havet Lamprey feromoner bruker Bioassay-guidede fraksjoneres

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Måle interaksjoner mellom fluorescerende sonder og lignin i Plant seksjoner av sFLIM basert på Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultra-High-Speed Western Blot ved hjelp av immunoreaction styrke teknologi

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Cellefraksjonering av U937-celler ved isopycnic tetthetsgradientrensing

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Kvantifisering av bindingsinteraksjonene mellom Cu (II) og peptidester i nærvær og fravær av kromoforer

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...