Name: cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation
Uploaded: 2019-01-18T15:00:00
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O trabalho foi acompanhado pelo NIH-1R15HL135675-01 para Timothy J. LaRocca

1. preparar reagentes e Buffers
Nota: Consulte a tabela 1.
<ol><li>Prepare soluções de tampão A, B do lysis, amortecedor da amostra e digitonin.<ol>
<li>Prepare A reserva, acrescentando 8,77 g de NaCl e 50ml de HEPES (1 M, pH 7,4) a 900 mL de água desionizada, ajustar volume final para 1 L com água desionizada. Nota: Concentrações finais são 150 mM NaCl e 50 mM HEPES.</li>
		<li>Preparar o tampão de Lise B adicionando 20 mL de HEPES (1 M, pH 7,4), 0,75 g de KCl, ...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Song, Y., Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+project+for+the+subcellular+proteome+of+mouse+liver.">Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver.</a> Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).</li><li>Lenstra, J. A., Bloemendal, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+of+the+total+protein+population+from+cultured+cells+upon+fractionation+by+chemical+extractions.">Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions.</a> European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).</li><li>Michelsen, U., von Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19+Isolation+of+Subcellular+Organelles+and+Structures.">Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures.</a> Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses).">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses).</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Endoplasmic+Reticulum,+Mitochondria,+and+Mitochondria-Associated+Membrane+and+Detergent+Resistant+Membrane+Fractions+from+Transfected+Cells+and+from+Human+Cytomegalovirus-Infected+Primary+Fibroblasts.">Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. 68, (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, a. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).</li><li>Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na,K-ATPase+transport+from+endoplasmic+reticulum+to+Golgi+requires+the+Golgi+spectrin-ankyrin+G119+skeleton+in+Madin+Darby+canine+kidney+cells.">Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).</li><li>McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenization+of+Mammalian+Tissue.">Homogenization of Mammalian Tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).</li></ol>

O desenvolvimento do presente protocolo surgiu de uma incapacidade de se separar mitocondrial e amostras de membrana, usando kits comercialmente disponíveis, para análise da localização da proteína durante necroptosis14. As limitações primárias de kits do premade são sua incapacidade de ser adaptado às necessidades dos investigadores individuais, o custo por amostra e número limitado de amostras capazes de serem processados. O método apresentado aqui pode ser realizado sem a utilizaç?...

Identificação fiável de localização da proteína é muitas vezes necessária, ao examinar as vias moleculares em células eucarióticas. Métodos para obter fracções subcelulares são utilizados pelos pesquisadores para examinar mais de perto os componentes celulares de interesse.
A maioria dos métodos existentes de fracionamento celular geralmente caem em duas categorias amplas, baseado em detergente1,2 e baseada em ultracentrifugação3,4,5, que pode ser diferenciadas por velocidade, precisão e custo. Protocolos baseados em detergente contam com o uso de buffers com crescente força detergente para solubilizar componentes distintos da célula. Este é um método rápido e conveniente para o processamento de amostras e pode ser rentável se o número e o tamanho das amostras são pequenas. Detergente com base em kits podem ser adquiridos para isolar citoplasmática membrana/organela (fração mista) e frações nucleares de células. No entanto, vários inconvenientes associados a estes kits limitam sua utilidade para pesquisadores. Eles são projetados para isolar facilmente um ou dois componentes da célula, mas são incapazes de isolar todas as frações de uma amostra simultaneamente. O uso de detergentes significa que a membrana plasmática e organelas de membrana-incluido vão ser igualmente solubilizadas e, portanto, incapaz de ser separados uns dos outros. Uma complicação adicional decorre os componentes proprietários nesses kits que impede que os investigadores alterando as condições para aplicações específicas. Por último, eles são limitados em número de usos e podem ser proibitivamente caros para experiências em maior escala. Kits de non-detergente com base existem para o isolamento de mitocôndrias, no entanto, eles não são projetados para isolar a membrana plasmática e o rendimento da amostra é significativamente menor do que a da centrifugação densidade com base em protocolos de isolamento6,7 .
Métodos que utilizam a ultracentrifugação para obter fracções são mais tempo consumindo, mas muitas vezes resultam em frações mais puras do que jogos baseados em detergente. Para isolar as membranas do plasma de células sem primeiro solubilizing-los (resultando em contaminação com organelas de membrana) os obriga a ser lysed por um método não-detergente seguido de separação de componentes celulares através do diferencial centrifugação — com isolamento de membrana plasmática que exigem velocidades de 100.000 × g para realizar. Em muitos casos, centrifugação diferencial deve ser seguida por isopícnica centrifugação de densidade gradiente para ainda mais a separação das frações celulares ou remoção de contaminantes. Enquanto esses métodos são minuciosos e modificável, desvantagens incluem a necessidade de um se para separação das frações e ainda mais purificação através de densidade gradiente centrifugação, consumo de tempo e custo. A maioria das centrífugas de alta velocidade são a um custo que é proibitivo dos investigadores individuais e são frequentemente partilhados, núcleo equipamentos em instituições acadêmicas. Assim, a disponibilidade se torna-se proibitivo nessas situações.
Neste protocolo de fracionamento, demonstramos o isolamento de frações subcelulares, sem o uso de detergentes de solubilizing e sem centrifugação de alta velocidade. Este método permitirá que pesquisadores isolar a membrana plasmática, mitocôndrias e componentes citoplasmáticos de uma célula eucariótica com contaminação mínima entre frações.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D0540</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22877-282</td>
			<td>For Homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61721</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td>For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J848</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12315</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td>For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
			<td>For Lysis buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M145</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>probe sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td>For Final Samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td>For Cytoplasm Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>227</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td>For Lysis buffers A and B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>For Lysis buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>788</td>
			<td>For Sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td>For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells in the absence of high-speed centrifugation

Neste protocolo, detalhamos um método para obter fracções subcelulares de células U937 sem o uso de ultracentrifugação ou detergentes indiscriminados. Este método utiliza buffers de hipotônicas, digitonin, Lise mecânica e centrifugação diferencial para isolar o citoplasma, mitocôndrias e membrana plasmática. O processo pode ser dimensionado para acomodar as necessidades dos investigadores, é barato e simples. Este método permitirá que os investigadores determinar a localização da proteína nas células sem centrifugadores especializados e sem o uso de kits comerciais, ambos dos quais podem ser proibitivamente caros. Com sucesso usamos este método para separar citosólica, membrana plasmática e proteínas mitocondriais em linhagem celular de monócitos humanos U937.

Bem sucedido fraccionamento de células indiferenciadas de8 U937 crescido em suspensão foi realizado utilizando o protocolo detalhado acima e ilustrado na Figura 1. As amostras obtidas com este método foram submetidas a mancha ocidental9 utilizando um método de transferência molhado para uma membrana (PVDF) de fluoreto de polivinilideno. A membrana foi posteriormente analisada com anticorpos contra citoplasm...

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Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Fracionamento celular de células U937, na ausência de centrifugação de alta velocidade

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar a membrana plasmática, citoplasma e mitocôndrias de células U937 sem o uso de centrifugação de alta velocidade. Esta técnica pode ser usada para purificar as fracções subcelulares para posterior exame de localização de proteínas através de immunoblotting.

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Este protocolo permite que os pesquisadores obtenham frações distintas de uma célula sem o uso de equipamentos especializados, reagentes caros ou técnicas complexas. A principal vantagem deste protocolo é a simplicidade das técnicas que o tornam modificável e fácil de executar. Demonstrando o procedimento serão Matt Deragon, Rob Haluska e Alexa Hodges.três estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Para começar a centrifugar a suspensão celular preparada para criar uma pelota. Remova o supernatante e suspenda a pelota em temperatura ambiente PBS. Centrifugar a suspensão da célula a 400 xg por dez minutos. Em seguida, remova o supernasciente e suspenda novamente a pelota da célula no tampão gelado. Prepare o buffer Uma solução de acordo com o protocolo de texto. Centrifugar a suspensão da célula a 400 xg por dez minutos e remover o supernatante. Suspenda a pelota no buffer Uma solução para uma concentração final de 200 milhões de células por ml, e pipeta suavemente para quebrar qualquer aglomerado. Depois disso, incubar a suspensão da célula em uma rotadora final em 4

Research

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