Name: an improved and high throughput respiratory syncytial virus (rsv) micro-neutralization assay
Uploaded: 2019-01-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus RSV Micro-neutralization Assay at JoVE.com

המחברים תודה לכל המשתתפים מעורבים. אנו להכיר תוכנית תמיכה תשתיות מבצעיות של הממשלה ויקטוריאני. PVL היא נמען מלגת פיתוח הקריירה NHMRC.

הערה: כל השלבים צריך להתבצע בשכונה BSL2 אלא אם צויין אחרת. טיטור ויראלי נדרש מראש וזמינותו PRN כדי לקבוע ריכוז RSV אופטימלית בשימוש PRN וזמינותו. מומלץ aliquot את המניות וירוס באמצעי אחסון קטן להיות הקרת פעם, המשמש עבור כל assay NAb. מומלץ גם באמצעות המניה נגיפי זהה עבור כל מבחני NAb לבצע עבור כל ד?...

<ol>
	<li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015:+a+systematic+review+and+modelling+study.">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li><li>Modjarrad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+consultation+on+Respiratory+Syncytial+Virus+Vaccine+Development+Report+from+a+World+Health+Organization+Meeting+held+on+23-24+March+2015.">WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015.</a> Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).</li><li>Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+report:+WHO+consultation+on+Respiratory+Syncytial+Virus+(RSV)+vaccine+development,+Geneva,+25-26+April+2016.">Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016.</a> Vaccine. , (2017).</li><li>Mazur, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+syncytial+virus+vaccine+landscape:+lessons+from+the+graveyard+and+promising+candidates.">The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates.</a> Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).</li><li>Hosken, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-laboratory+study+of+diverse+RSV+neutralization+assays+indicates+feasibility+for+harmonization+with+an+international+standard.">A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard.</a> Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).</li><li>Zielinska, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+microneutralization+assay+for+respiratory+syncytial+virus+by+automated+plaque+counting+using+imaging+analysis.">Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis.</a> Virology Journal. 2, 84 (2005).</li><li>van Remmerden, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+respiratory+syncytial+virus+neutralization+assay+based+on+the+detection+of+green+fluorescent+protein+expression+and+automated+plaque+counting.">An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting.</a> Virology Journal. 9, 253 (2012).</li><li>Varada, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neutralization+assay+for+respiratory+syncytial+virus+using+a+quantitative+PCR-based+endpoint+assessment.">A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment.</a> Virology Journal. 10, 195 (2013).</li><li>Tripp, R. A., Jorquera, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , (2016).</li><li>Suara, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+neutralizing+antibody+to+respiratory+syncytial+virus+in+sera+from+mothers+and+newborns+residing+in+the+Gambia+and+in+The+United+States.">Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).</li><li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+neutralizing+serum+antibodies+of+patients+vaccinated+with+human+papillomavirus+L1+or+L2-based+immunogens+using+furin-cleaved+HPV+Pseudovirions.">Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions.</a> PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).</li><li>Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+resistance+to+neutralizing+antibodies:+Determination+of+antibody+concentrations+leading+to+escape+mutant+evolution.">HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution.</a> Virus Research. 218, 57-70 (2016).</li></ol>

יש שפותחה ואנו ממוטב פשוטה ויעילה RSV מיקרו-ניטרול assay זה ניתן להתאים בקלות במעבדות רוב. זה וזמינותו הוא היכולת למדוד את היכולת זיהום נגיפי, כמו גם מדידת עיכוב של זיהום נגיפי מאת NAb ברמה התאית באמצעות סריקת תמונה ממוחשב. השימוש של פלטפורמה מבוססת הדמיה של מערכות מבוססות נוגדן ספציפי גדל יריד?...

הווירוס syncytial הנשימה (RSV) הוא הגורם המוביל של זיהומים בדרכי הנשימה התחתונה אוכלוסיית ילדים ברחבי העולם1. למרות משאו גבוהה, יש עדיין אין חיסון או טיפול זמין. משנת 2013, ארגון הבריאות העולמי (WHO) הכריזה על פיתוח חיסון RSV כעדיפות המחקר העיקרי, עם2,פגישות ייעוץ העולמי השנתי3. המי שהסכים באמצעות RSV בנטרול מדידה נוגדנים (NAb) כדי לעקוב אחר חיסון immunogenicity, כפי זה מזוהה כמספר דה מרקר סרולוגית העיקריים של הגנה4. NAbs הוכחו להגן מפני זיהום חמור RSV במספר מחקרים, כמו גם ניסויים קליניים של palivizumab נוגדנים חד שבטיים אנטי-RSV, כיום אסטרטגיה מניעתי בלבד זמינים4.
קיימות מספר תבניות assay NAb בשימוש על ידי מעבדות ברחבי העולם, כולל מבחני מבוססת תא, מבוסס על מולקולרית, אשר עשו מאמצים סטנדרטיזציה מאתגר5,-6,-7,-8. עם זאת, וזמינותו ניטרול (PRN) פלאק קונבנציונלי-הפחתת המודד את מספר מופחת פלאק ויוצרים יחידות (PFU) על ידי הנוכחות של נוגדנים ספציפיים RSV נשאר עדיין תקן זהב9. כאן, אנחנו מדווחים פרוטוקול PRN משופרת מפושטת, תפוקה גבוהה יכול לשמש בשורות תאים רבים, זנים RSV ועם תפוקה מוגברת וזמינותו. פרוטוקול זה נבדקו באמצעות דגימות קליניות של הגדרות שונות, כמו גם על דגימות מן המודל החייתי ניסויים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSV A2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-1540</td>
			<td>lot number 60430286</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1000142511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 &#176;C)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMC sodium salt powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5678-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 &#176;C)</td>
			<td>Scientific Services &#8211; Tissue Culture</td>
			<td></td>
			<td>MCRI in house supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 &#176;C)</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>SFBS-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat X RSV antibody</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AB1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 &#181;L aliquots at -20 &#176;C)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-4022</td>
			<td>Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 powder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31100035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk diluent blocking solution (stored at 4 &#176;C)</td>
			<td>Australian Biosearch</td>
			<td>50-82-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 &#176;C)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>s.d.H2O from Milli-Q dispenser</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>In-house dispensation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1X PBS for culture (stored at 4&#176;C)</td>
			<td>Scientific Services &#8211; Tissue Culture</td>
			<td></td>
			<td>MCRI in house supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 polysorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td>Invitro Technologies</td>
			<td>FAL352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit 0.22um (500 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NAL5660020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Australia PL</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile flat-bottom plates (96-well with lid)</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile U-bottom plates (96-well with lid)</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>650180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml serological pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4487-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4251-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pipette 1-200 &#181;L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960</td>
			<td>Fisher Biotec</td>
			<td>TF-200-L-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pipette 5-20 &#181;L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960</td>
			<td>Fisher Biotec</td>
			<td>TF-20-L-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pipette 100-1000 &#181;LClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000</td>
			<td>Fisher Biotec</td>
			<td>TF-1000-L-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pipette 1-10 &#181;L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001</td>
			<td>Fisher Biotec</td>
			<td>TXLF-10-L-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments and softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISpot reader system</td>
			<td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AID ELISpot software version 5.0</td>
			<td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel 2007</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved and high throughput respiratory syncytial virus (rsv) micro-neutralization assay

הנשימה syncytial וירוס ספציפיים נטרול נוגדנים (RSV NAbs) הם סמן חשוב של הגנה כנגד RSV. מספר תבניות assay שונים הם נמצאים כעת בשימוש ברחבי העולם כך שאין צורך שיטה מדויקת, תפוקה גבוהה עבור מדידת RSV NAbs. נתאר כאן assay מיקרו-ניטרול מבוססת הדמיה אחר נושאים ' נבדק על קבוצת משנה של RSV A, ניתן להתאים גם עבור קבוצת משנה של RSV B סוגי דגימה שונים. שיטה זו היא מאוד לשחזור, עם וריאציות הבין-assay בנסיוב הפניה להיות פחות מ 10%. אנו מאמינים ש-assay הזה ניתן להקים בקלות במעבדות רבות ברחבי העולם במחיר נמוך יחסית. התפתחות assay משופרת, תפוקה גבוהה המודד RSV NAbs מייצג צעד משמעותי קדימה התקינה של שיטה זו ברחבי העולם, כמו גם להיות ביקורתיים להערכת המועמדים חיסון RSV הרומן בעתיד.

טיטרציה של מלאי וירוס בוצעה מ 1:10 עד 1:108 דילול כדי לקבוע ריכוז מניות וירוס לפני וזמינותו PRN (נציג תוצאות המוצג באיור5). איור 5, PFU ניתן לספור באופן אמין-דילולים של 1:104 ו- 1:105. המספר הממוצע של PFU מבארות triplicate-הדילול באותו מחושב. מא...

Watch this Scientific Journal Video about An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus RSV Micro-neutralization Assay at JoVE.com

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus RSV Micro-neutralization Assay

מחקר זה מתאר של תפוקה גבוהה, assay מיקרו-ניטרול מבוססת הדמיה כדי לקבוע את כייל נוגדנים נטרול ספציפיות עבור הווירוס syncytial הנשימה (RSV). תבנית זו assay נבדקו על סוגי דגימה שונים.

Assay מיקרו-ניטרול קצב העברת נתונים משופר וגבוה הווירוס Syncytial הנשימה (RSV)

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...

יש צורך בשיטת תפוקה מדויקת וגוהה למדידת נוגדנים לנטרול RSV, כסמן חשוב להגנה מפני וירוס סינפטיאלי נשימתי. שיטה זו היא מאוד לשכפל עם וריאציות בין assay עבור antiserum התייחסות להיות פחות מ 10%אנו מאמינים כי בדיקה זו ניתן להקים בקלות במעבדות רבות ברחבי העולם בעלות נמוכה יחסית. אנו מתארים כאן בדיקה מבוססת מיקרו-נטרול הדמיה שנבדקה בקבוצת משנה A של RSV, וגם יכולה להיות מותאמת לקבוצת משנה B של RSV ולסוגי מדגמים שונים.הדגמת ההליך תהיה ראובן Tse, חבר בצוות המחקר ב MCRI. כדי לזרוע צלחות ביום הראשון, הראשון resuspend A549 תאים במדיה DMEM, עם 10%FCS ו 1, 000 יחידות פניצילין-סטרפטומיצין תערובת בריכוז של 400, 000 תאים למיליליטר. ואז זרע 96 צלחות סטריליות שטוחות תחתית עם 40, 000 תאי A459 בצפיפות של 100 מיקרוליטרים ל באר.דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה 5%פחמן דו חמצני לילה. כדי להכין את דילול הסרום ביום השני, הפשרו תחילה את דגימות מבחן RSV וסרום אנושיות בטמפרטורת החדר. ואז למקם אותם באמבט מים ב 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לחמם ולהפעיל אותם.לאחר מכן, להכין יותר מ 110 microliters של אחד עד 100 דילול של סרום הייחוס על ידי ערבוב 1.5 microliters של סרום התייחסות עם מדיה DMEM ללא FCS עם תערובת פניצילין-סטרפטומיצין לנפח סופי של 150 microliters. פיפטה 110 מיקרוליטרים של דילול זה לתוך גם A12 של צלחת סטרילית U-התחתון 96 היטב. כדי לבצע דילול טורי אחד עד שניים לאורך הצלחת, תחילה להוסיף 55 microliters של מדיה DMEM ללא FCS עם תערובת פניצילין-סטרפטומיצין ל בארות B12 כדי H12.ואז עם העברת טיפ חדשה 55 microliters מגם A12 לגם B12. פיפטה למעלה ולמטה חמש פעמים כדי לערבב את הפתרון, ולהמשיך עד שתגיע גם H12. פיפטה את עודף 55 microliters של הפתרון מ גם H12.לאחר מכן, הכינו דילול של 1 עד 100 דגימות לבדיקת סרום, והוסיפו 110 מיקרוליטרים של כל דילול ל הבאר המתאימה A1 עד A9 ו-E1 ל-E9 של הלוח הסטרילי של 96 הבאר. לאחר מכן הוסיפו 55 מיקרוליטרים של מדיית DMEM נטולת FCS עם תערובת פניצילין-סטרפטומיצין ל בארות בעמודות 1 עד 9. בצע דילול טורי של שורה א' לשורה D ומן שורה E לשורה H כמתואר לעיל.הוסף 55 מיקרוליטרים של מדיית DMEM נטולת FCS עם תערובת פניצילין-סטרפטומיצין ל בארות בעמודות 10 ו- 11. כדי להכין את מלאי הנגיף, תחילה לשים בקבוקון קפוא של RSV באמבט מים 37 מעלות צלזיוס להפשיר אותו במהירות, ולאחר מכן למקם את הבקבוקון על קרח. לאחר מכן, להוסיף את הווירוס למדיה DMEM המכיל תערובת פניצילין-סטרפטומיצין בכ 200 PFU ל הבאר כדי להפוך נפח כולל של 55 מיליליטר עבור 100 בארות.כדי להכין את תערובת סרום הנגיף, ראשית להוסיף 55 microliters של הנגיף מדולל לכל בארות של עמודות אחד עד תשע בארות של שורות E עד H של עמודות 10 ו 11. לאחר מכן הוסיפו 55 מיקרוליטרים של מדיית DMEM נטולת FCS עם תערובת פניצילין-סטרפטומיצין לכל בארות השורות A עד D של עמודים 10 ו-11, וגרפו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס בסביבה של 5%פחמן דו-חמצני למשך שעה. לפני החיסון של תאי A549 עם RSV, בדוק את לוחית התא תחת מיקרוסקופ אור כדי לאשר כי מונואירים תא A549 הם 80%confluent.לאחר מכן להפוך את הצלחת בעדינות כדי להשליך את המדיה, ולמחוק קלות את הצלחת על מגבת נייר סופג סטרילי. לאחר כל אחד מהם, יש לשטוף עם PBS סטרילי מסונן. לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטרים ל הבאר של תערובת סרום הנגיף ל הבאר המתאימה על צלחת התא A549 על פי תבנית הלוחית המסופקת בכתב היד, ו דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת.בסוף הדגירה, השתמש בפיקטה כדי להסיר 90 מיקרוליטרים ל באר, ולהוסיף 100 מיקרוליטרים של המדיה המכילה 1XM199, 1.5%CMC ו- 2%FCS בתערובת פניצילין-סטרפטומיצין. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים. כדי לתקן ולפתח לוחית מים, הפוך תחילה את לוח התאים A549 הנגוע ב- RSV בעדינות כדי להשליך את המדיה המכילה M199, CMC, 2% FCS ותערובת פניצילין-סטרפטומיצין.לאחר מכן הוסיפו באיטיות 200 מיקרוליטרים של מאגר קיבעון לכל באר. דגירה הצלחת במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. ואז להשליך את מאגר קיבעון בעדינות כתם על מגבת נייר סופג.השאירו את הצלחת עם הפנים כלפי מטה לייבוש במשך 10 דקות. לאחר מכן, כאשר מאגר PBS מסונן מכיל 05 פוליסורבט 20, הפוך את פתרון חסימת החלב ל-5%. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של פתרון החסימה לכל באר ומדרגים את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.בסוף הדגירה להפוך את הצלחת בעדינות כדי להשליך את הפתרון כתם על מגבת נייר סופג. כדי להפוך את הנוגדן העיקרי, לדלל נוגדן XRSV עז אחד עד 500 בתת פתרון החסימה. מוסיפים 50 מיקרוליטרים לכל באר ומדרגים את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם PBS-פוליסורבט מסונן. לאחר מכן, להפוך את הנוגדן המשני על ידי דילול אחד עד 5, 000 אלקסה פלואור חמור נגד עז אימונוגלובולין G בתתא החסימה. מוסיפים 50 מיקרוליטרים לכל באר ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לשטוף את הצלחת חמש פעמים עם PBS-פוליסורבט מסונן. כדי לספור לוחות עם קורא כתמים אוטומטי, השתמש תחילה בלוחית תרבות של 96 בארות שאינן בשימוש כדי לשתף פעולה עם הכלי על-ידי הזנת הגדרות הספירה בערוץ FITC. ואז לקרוא את לוחית התא, לעטוף אותו בנייר כסף, ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, בדוק את התמונות של בארות עבור לוחות חפצים או monolayers תאים משובשים, ולא לכלול בארות עם monolayers תאים משובשים. המספר הממוצע של לוחות של בארות בקרת ללא סרום חושב והשתמשו בו כדי לקבוע את ניתוב הנטרול של 50% שיגרם לעיכוב של 50% בפעילות הנגיף. דילול הסרום ההדדי התווה על ציר ה- x ועל מספר הלוחות על ציר ה- y של גרף יומן רישום למחצה מ קו שצויר בין שתי הנקודות.50% טיטרציה נטרול של דגימות סרום הבדיקה היו אדומים ודילול סרום עם ספירות מיד מעל או מתחת לערך 50% של בארות בקרת ללא סרום זוהו. RSVAPRN מוצג בשתי קבוצות מבוגרים שונות מגמביה ומתנדבים בריאים במלבורן גרמו למבוגרים הגמביים להיות בעלי TITRE NAB ממוצע נמוך יותר בהשוואה למבוגרים במלבורן. סרום התייחסות RSV האנושי המוצג מדגים שונות נמוכה מאוד עם מקדם וריאציה של 6.82%זה שיפור תפוקה גבוהה RSV פלאק הפחתת בדיקה ניתן ליישם בקלות במעבדות רבות, ויתמוך במאמץ ההרמוניזציה הבינלאומי של ארגון מי עבור RSV בנטרול בדיקות נוגדנים.זה יהיה קריטי להערכת מועמדים חדשים לחיסון RSV בעתיד.

Research

JoVE Journal

Medicine

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

תפוקה גבוהה ELISA סדרתית עבור אימות של סמנים ביולוגיים של מחלות אקוטיות שתל נגד מארח

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

אימונותרפיה תת לשונית כחלופה ללהשרות הגנה מפני זיהומים בדרכי הנשימה חריפים

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

שיטה משופרת עבור אינטובציה מהירה של קנה הנשימה של עכברים

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

תפוקה גבוהה, Multiplexed וממוקדת proteomic CSF Assay לכמת Biomarkers ניווניות ו אפוליפופרוטאין E isoforms סטטוס

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Murine Left Anterior Descending (LAD) Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

Murine Left Anterior Descending LAD Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

Murine שמאל Anterior יורד (LAD) קשירת עורקים הכליליים: דגם משופר או פשוט עבור אוטם שריר לב

Ischemic heart disease (IHD), or acute coronary syndrome (ACS), is one of the leading causes of death in the United States. IHD is characterized by ...