Name: an improved and high throughput respiratory syncytial virus (rsv) micro-neutralization assay
Uploaded: 2019-01-26T14:30:00
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Gli autori ringraziano tutti i partecipanti coinvolti. Riconosciamo il programma di supporto dell'infrastruttura operativa del governo vittoriano. PVL è un destinatario NHMRC carriera sviluppo Fellowship.

Nota: Tutte le fasi devono essere eseguite in un cappuccio BSL2 se non diversamente indicato. Titolazione virale è richiesto in anticipo un dosaggio PRN per determinare la concentrazione ottimale di RSV usata per il test PRN. Si raccomanda di aliquota le scorte di virus in un piccolo volume che verrà una volta scongelati e utilizzato per ogni dosaggio NAb. Inoltre è consigliabile utilizzare lo stesso stock virale per tutti i saggi di NAb eseguite per tutti i campioni provenienti da uno studio. Assicur...

<ol>
	<li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015:+a+systematic+review+and+modelling+study.">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li><li>Modjarrad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+consultation+on+Respiratory+Syncytial+Virus+Vaccine+Development+Report+from+a+World+Health+Organization+Meeting+held+on+23-24+March+2015.">WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015.</a> Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).</li><li>Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+report:+WHO+consultation+on+Respiratory+Syncytial+Virus+(RSV)+vaccine+development,+Geneva,+25-26+April+2016.">Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016.</a> Vaccine. , (2017).</li><li>Mazur, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+syncytial+virus+vaccine+landscape:+lessons+from+the+graveyard+and+promising+candidates.">The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates.</a> Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).</li><li>Hosken, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-laboratory+study+of+diverse+RSV+neutralization+assays+indicates+feasibility+for+harmonization+with+an+international+standard.">A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard.</a> Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).</li><li>Zielinska, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+microneutralization+assay+for+respiratory+syncytial+virus+by+automated+plaque+counting+using+imaging+analysis.">Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis.</a> Virology Journal. 2, 84 (2005).</li><li>van Remmerden, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+respiratory+syncytial+virus+neutralization+assay+based+on+the+detection+of+green+fluorescent+protein+expression+and+automated+plaque+counting.">An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting.</a> Virology Journal. 9, 253 (2012).</li><li>Varada, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neutralization+assay+for+respiratory+syncytial+virus+using+a+quantitative+PCR-based+endpoint+assessment.">A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment.</a> Virology Journal. 10, 195 (2013).</li><li>Tripp, R. A., Jorquera, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , (2016).</li><li>Suara, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+neutralizing+antibody+to+respiratory+syncytial+virus+in+sera+from+mothers+and+newborns+residing+in+the+Gambia+and+in+The+United+States.">Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).</li><li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+neutralizing+serum+antibodies+of+patients+vaccinated+with+human+papillomavirus+L1+or+L2-based+immunogens+using+furin-cleaved+HPV+Pseudovirions.">Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions.</a> PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).</li><li>Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+resistance+to+neutralizing+antibodies:+Determination+of+antibody+concentrations+leading+to+escape+mutant+evolution.">HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution.</a> Virus Research. 218, 57-70 (2016).</li></ol>

Abbiamo sviluppato e ottimizzato un'analisi di micro-neutralizzazione di RSV semplice ed efficiente che può essere facilmente adattata nella maggior parte dei laboratori. Questo test è in grado di misurare la capacità di infezione virale così come l'inibizione di infezione virale di NAb a livello cellulare mediante scansione immagine automatizzata di misura. L'uso di una piattaforma basata su formazione immagine e sistemi basati su anticorpi specifici ha aumentato la specificità e la sensibilità di rilevazione spot...

Virus respiratorio sinciziale (RSV) è la causa principale delle infezioni più basse delle vie respiratorie nella popolazione pediatrica in tutto il mondo1. Nonostante la sua alta difficoltà, non c'è ancora nessun vaccino o trattamento disponibile. Dal 2013, l'organizzazione mondiale della sanità (OMS) ha dichiarato lo sviluppo di vaccini di RSV come una priorità di ricerca principali, con annuale WHO consultazione riunioni2,3. L'OMS ha concordato sull'utilizzo RSV neutralizzando misura dell'anticorpo (NAb) per monitorare l'immunogenicità del vaccino, come questo è riconosciuto come il principale marker sierologico di protezione4. NAbs hanno dimostrato di proteggere contro l'infezione RSV severa in un certo numero di studi, nonché a studi clinici di palivizumab l'anticorpo monoclonale anti-RSV, attualmente la strategia solo profilattico disponibili4.
Ci sono diversi formati di dosaggio NAb usati dai laboratori in tutto il mondo, tra cui saggi basati su molecolare e cellulare, che hanno compiuto sforzi di standardizzazione impegnativo5,6,7,8. Tuttavia, l'analisi di neutralizzazione (PRN) riduzione della placca convenzionale che misura il numero di riduttore della placca formando unità (PFU) dalla presenza di un anticorpo specifico RSV rimane ancora il gold standard9. Qui, segnaliamo un protocollo PRN migliorato, semplificato e ad alta velocità che può essere utilizzato su numerose linee cellulari, per diversi ceppi di RSV e con un throughput di dosaggio aumentato. Questo protocollo è stato testato utilizzando campioni clinici da impostazioni diverse, come pure su campioni provenienti da esperimenti di modello animale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSV A2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-1540</td>
			<td>lot number 60430286</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1000142511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 &#176;C)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMC sodium salt powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5678-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 &#176;C)</td>
			<td>Scientific Services &#8211; Tissue Culture</td>
			<td></td>
			<td>MCRI in house supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 &#176;C)</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>SFBS-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat X RSV antibody</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AB1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 &#181;L aliquots at -20 &#176;C)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-4022</td>
			<td>Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 powder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31100035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk diluent blocking solution (stored at 4 &#176;C)</td>
			<td>Australian Biosearch</td>
			<td>50-82-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 &#176;C)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>s.d.H2O from Milli-Q dispenser</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>In-house dispensation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1X PBS for culture (stored at 4&#176;C)</td>
			<td>Scientific Services &#8211; Tissue Culture</td>
			<td></td>
			<td>MCRI in house supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 polysorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td>Invitro Technologies</td>
			<td>FAL352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit 0.22um (500 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NAL5660020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Australia PL</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile flat-bottom plates (96-well with lid)</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile U-bottom plates (96-well with lid)</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>650180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml serological pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4487-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4251-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pipette 1-200 &#181;L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960</td>
			<td>Fisher Biotec</td>
			<td>TF-200-L-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pipette 5-20 &#181;L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960</td>
			<td>Fisher Biotec</td>
			<td>TF-20-L-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pipette 100-1000 &#181;LClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000</td>
			<td>Fisher Biotec</td>
			<td>TF-1000-L-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pipette 1-10 &#181;L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001</td>
			<td>Fisher Biotec</td>
			<td>TXLF-10-L-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments and softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISpot reader system</td>
			<td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AID ELISpot software version 5.0</td>
			<td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel 2007</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved and high throughput respiratory syncytial virus (rsv) micro-neutralization assay

Respiratori sinciziali virus-specifici anticorpi neutralizzanti (RSV NAbs) sono un indicatore importante di protezione contro RSV. Un numero di formati diversi test è attualmente in uso in tutto il mondo c'è un'esigenza di un metodo preciso e ad alta produttività per la misurazione NAbs RSV. Descriviamo qui un'analisi micro-neutralizzazione basato su formazione immagine che è stata testata su sottogruppo RSV A e può essere adattata anche per RSV sottogruppo B e tipi di campioni diversi. Questo metodo è altamente riproducibile, con variazioni inter-saggio per l'antisiero di riferimento inferiore al 10%. Crediamo che questo test può essere facilmente stabilito in molti laboratori in tutto il mondo a costi relativamente bassi. Sviluppo di un'analisi migliore, ad alta produttività che misura RSV NAbs rappresenta un significativo passo avanti per la normalizzazione di questo metodo a livello internazionale, oltre ad essere critici per la valutazione di nuovi candidati vaccinali di RSV in futuro.

La titolazione di uno stock di virus è stata effettuata da 01:10 a 01:108 diluizione per determinare la concentrazione di stock di virus prima del dosaggio del PRN (risultati rappresentativi illustrati nella Figura 5). Dalla Figura 5, PFU può contare in modo affidabile alle diluizioni di 01:104 e 01:105. È stato calcolato il numero medio di PFU da pozzi triplici con la stessa diluizione. Poich?...

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An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus RSV Micro-neutralization Assay

Questo studio descrive un throughput elevato, basato su formazione immagine di analisi di micro-neutralizzazione per determinare il titolo degli anticorpi neutralizzanti specifici per il virus respiratorio sinciziale (RSV). Questo formato di dosaggio è stato testato su tipi di campioni diversi.

Un'analisi di Micro-neutralizzazione del Virus respiratorio sinciziale (RSV) migliorata e ad alta velocità di trasmissione

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...

C'è bisogno di un metodo accurato e ad alta produttività per misurare gli anticorpi neutralizzanti RSV, come importante marcatore di protezione contro il virus respiratorio sinciteale. Questo metodo è altamente riproducibile con variazioni inter-test per l'antisiero di riferimento inferiore al 10%Crediamo che questo saggio possa essere facilmente stabilito in molti laboratori in tutto il mondo a costi relativamente bassi. Descriviamo qui un saggio di micro-neutralizzazione basato sull'imaging che è stato testato sul sottogruppo RSV A e può anche essere adattato per il sottogruppo RSV B e diversi tipi di campione.A dimostrare la procedura sarà Reuben Tse, membro del gruppo di ricerca di MCRI. Per seminare piastre il primo giorno, riutilizzare per la prima volta le cellule A549 nei supporti DMEM, con 10%FCS e 1.000 unità miscela Penicillina-Streptomicina ad una concentrazione di 400.000 cellule per millilitro. Quindi seminare piastre sterili a fondo piatto da 96 po 'con 40.000 cellule A459 ad una densità di 100 microlitri per pozzo.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un ambiente di anidride carbonica del 5% durante la notte. Per preparare la diluizione del siero il secondo giorno, scongelare prima il siero di riferimento RSV umano e i campioni di prova del siero a temperatura ambiente. Quindi mettili in un bagno d'acqua a 56 gradi Celsius per 30 minuti per riscaldarli e attivarli.Successivamente, preparare più di 110 microlitri di una diluizione da uno a 100 del siero di riferimento mescolando 1,5 microlitri del siero di riferimento con supporti DMEM senza FCS con miscela Penicillina-Streptomicina ad un volume finale di 150 microlitri. Pipetta 110 microlitri di questa diluizione in pozzo A12 di una piastra sterile con fondo a U da 96 po '. Per effettuare diluizioni seriali da uno a due lungo la piastra, aggiungere prima 55 microlitri di supporti DMEM senza FCS con miscela Penicillina-Streptomicina ai pozzi da B12 a H12.Quindi con una nuova punta trasferire 55 microlitri dal pozzo A12 al pozzo B12. Pipettare su e giù cinque volte per mescolare la soluzione, e continuare fino a raggiungere bene H12. Pipettare fuori gli eccesso di 55 microlitri della soluzione dal pozzo H12.Successivamente, preparare una diluizione da uno a 100 di campioni di prova del siero e aggiungere 110 microlitri di ogni diluizione ai pozzi corrispondenti da A1 a A9 ed E1 a E9 della piastra sterile da 96 po '. Quindi aggiungere 55 microlitri di supporti DMEM senza FCS con miscela Penicillina-Streptomicina ai pozzi nelle colonne da uno a nove. Effettuare diluizioni seriali da una a due della riga A alla riga D e dalla riga E alla riga H come descritto in precedenza.Aggiungere 55 microlitri di supporti DMEM senza FCS con miscela Penicillina-Streptomicina ai pozzi nelle colonne 10 e 11. Per preparare lo stock di virus, prima metti una fiala congelata di RSV in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per scongelarla rapidamente, quindi posiziona il flaconcino sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere il virus al supporto DMEM contenente miscela Penicillina-Streptomicina a circa 200 PFU per pozzo per fare un volume totale di 55 millilitri per 100 pozzi.Per preparare la miscela di siero virale, aggiungere prima 55 microlitri del virus diluito a tutti i pozzi delle colonne da uno a nove e pozzi di righe da E a H delle colonne 10 e 11. Quindi aggiungere 55 microlitri di supporti DMEM senza FCS con miscela Penicillina-Streptomicina a tutti i pozzi di file da A a D delle colonne 10 e 11 e incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un ambiente di anidride carbonica al 5% per un'ora. Prima dell'inoculazione delle cellule A549 con RSV, esaminare la piastra cellulare al microscopio leggero per confermare che i monostrati cellulari A549 sono confluenti all'80%.Quindi invertire delicatamente la piastra per scartare il supporto e asciugare leggermente la piastra su un tovagliolo di carta assorbente sterile. Dopo ciascuno, lavare con PBS sterile filtrato. Aggiungere quindi 100 microlitri per pozzo della miscela di siero virale ai pozzi corrispondenti sulla piastra cellulare A549 in base al modello di piastra fornito nel manoscritto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per un'ora.Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta per rimuovere 90 microlitri per pozzo e aggiungere 100 microlitri del supporto contenente 1XM199, 1,5%CMC e 2%FCS nella miscela Penicillina-Streptomicina. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per tre giorni. Per fissare e sviluppare una piastra di dosaggio, invertire prima delicatamente la piastra cellulare A549 infetta da RSV per scartare delicatamente il supporto contenente M199, CMC, 2%FCS e la miscela Penicillina-Streptomicina.Quindi aggiungere lentamente 200 microlitri di Fixation Buffer ad ogni pozzo. Incubare la piastra a meno 20 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi scartare il tampone di fissazione e tamponare delicatamente su un tovagliolo di carta assorbente.Lasciare asciugare la piastra a faccia in giù per 10 minuti. Quindi, con tampone PBS filtrato contenente 05 polisorbato 20, fare soluzione di blocco del latte al 5%. Aggiungere 200 microlitri della soluzione di blocco ad ogni pozzo e incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti.Al termine dell'incubazione invertire delicatamente la piastra per scartare la soluzione e tamponare su un tovagliolo di carta assorbente. Per realizzare l'anticorpo primario, diluire da uno a 500 anticorpi XRSV di capra nella soluzione di blocco. Aggiungere 50 microlitri ad ogni pozzo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora.Lavare la piastra tre volte con PBS-polisorbato filtrato. Successivamente, fare l'anticorpo secondario diluire da uno a 5.000 Alexa Fluor anti-capra immunoglobulina G nella soluzione di blocco. Aggiungere 50 microlitri ad ogni pozzo e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora.Lavare la piastra cinque volte con PBS-polisorbato filtrato. Per contare le placche con un lettore di spot automatizzato, utilizzare prima una piastra di coltura inutilizzata da 96 pozzi per collaborare allo strumento inserendo le impostazioni di conteggio nel canale FITC. Quindi leggere la piastra cellulare, avvolgerla in un foglio e conservarla a quattro gradi Celsius.Quindi, controlla le immagini dei pozzi alla ricerca di placche artefatto o monostrati cellulari interrotti ed escludi i pozzi con monostrati cellulari interrotti. Il numero medio di placche dei pozzi di controllo senza siero è stato calcolato e utilizzato per determinare il taglio di neutralizzazione del 50% che avrebbe determinato un'inibizione del 50% dell'attività del virus. La diluizione reciproca del siero è stata tracciata sull'asse x e il numero di placche sull'asse y di un grafico semi-log da una linea tracciata tra i due punti.I titoli di neutralizzazione del 50% dei campioni di siero di prova erano diluizioni rosse e siere con conteggi immediatamente superiori o inferiori al valore del 50% dei pozzi di controllo senza siero. I test RSVAPRN in due diverse coorti adulte del Gambia e volontari sani a Melbourne hanno portato gli adulti gambiani ad avere un titolo NAB medio inferiore rispetto agli adulti di Melbourne. Il siero di riferimento RSV umano mostrato dimostra una variabilità molto bassa con il coefficiente di variazione del 6,82%Questo test di neutralizzazione della riduzione della placca RSV ad alta produttività migliorato può essere facilmente implementato in molti laboratori e sosterrà lo sforzo di armonizzazione internazionale dell'OMS per i test anticorpali neutralizzanti RSV.Questo sarà fondamentale per la valutazione dei nuovi candidati al vaccino RSV in futuro.

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