Name: an improved and high throughput respiratory syncytial virus (rsv) micro-neutralization assay
Uploaded: 2019-01-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus RSV Micro-neutralization Assay at JoVE.com

Yazarlar dahil tüm katılımcılara teşekkür ederim. Victoria Hükümeti'nın operasyonel altyapı destek programı anıyoruz. PVL NHMRC kariyer geliştirme bursu alıcı olduğunu.

Not: Tüm adımları BSL2 mahallede başka türlü belirtilmediği sürece yapılması gerekiyor. Viral titrasyon öncesinde bir PRN tahlil PRN assay olarak kullanılan en uygun RSV konsantrasyonu belirlemek için gereklidir. Bu virüs stokları bir kez çözdürülen ve her NAb tahlil için kullanılan küçük bir hacim içinde aliquot için tavsiye edilir. Bir çalışmada tüm örnekleri için gerçekleştirilen tüm NAb deneyleri için aynı viral stok kullanılması da önerilir. Kültür Medya ve ...

<ol>
	<li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015:+a+systematic+review+and+modelling+study.">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li><li>Modjarrad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+consultation+on+Respiratory+Syncytial+Virus+Vaccine+Development+Report+from+a+World+Health+Organization+Meeting+held+on+23-24+March+2015.">WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015.</a> Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).</li><li>Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+report:+WHO+consultation+on+Respiratory+Syncytial+Virus+(RSV)+vaccine+development,+Geneva,+25-26+April+2016.">Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016.</a> Vaccine. , (2017).</li><li>Mazur, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+syncytial+virus+vaccine+landscape:+lessons+from+the+graveyard+and+promising+candidates.">The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates.</a> Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).</li><li>Hosken, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-laboratory+study+of+diverse+RSV+neutralization+assays+indicates+feasibility+for+harmonization+with+an+international+standard.">A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard.</a> Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).</li><li>Zielinska, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+microneutralization+assay+for+respiratory+syncytial+virus+by+automated+plaque+counting+using+imaging+analysis.">Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis.</a> Virology Journal. 2, 84 (2005).</li><li>van Remmerden, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+respiratory+syncytial+virus+neutralization+assay+based+on+the+detection+of+green+fluorescent+protein+expression+and+automated+plaque+counting.">An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting.</a> Virology Journal. 9, 253 (2012).</li><li>Varada, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neutralization+assay+for+respiratory+syncytial+virus+using+a+quantitative+PCR-based+endpoint+assessment.">A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment.</a> Virology Journal. 10, 195 (2013).</li><li>Tripp, R. A., Jorquera, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , (2016).</li><li>Suara, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+neutralizing+antibody+to+respiratory+syncytial+virus+in+sera+from+mothers+and+newborns+residing+in+the+Gambia+and+in+The+United+States.">Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).</li><li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+neutralizing+serum+antibodies+of+patients+vaccinated+with+human+papillomavirus+L1+or+L2-based+immunogens+using+furin-cleaved+HPV+Pseudovirions.">Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions.</a> PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).</li><li>Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+resistance+to+neutralizing+antibodies:+Determination+of+antibody+concentrations+leading+to+escape+mutant+evolution.">HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution.</a> Virus Research. 218, 57-70 (2016).</li></ol>

Biz geliştirdik ve çoğu laboratuvarlarında kolayca uyarlanabilir bir basit ve etkili RSV mikro-nötralizasyon tahlil en iyi duruma getirilmiş. Bu tahlil viral enfeksiyon yeteneği hem de viral enfeksiyon NAb bilgisayarlı görüntü tarama kullanarak hücresel düzeyde tarafından inhibisyonu ölçme ölçmek yapabiliyor. Bir görüntüleme tabanlı platform ve belirli antikor tabanlı sistemler özgüllük ve geleneksel plak algılama yöntemleri6,7' ye gö...

Respiratuvar sinsisyal virüs (RSV) alt solunum yolu enfeksiyonları Pediatrik popülasyon dünya çapında1önde gelen nedenidir. Onun yüksek yük rağmen hala hiçbir aşı veya tedavi kullanılabilen bulunmamaktadır. 2013 yılından bu yana, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) RSV aşısı geliştirme yıllık WHO istişare toplantıları2,3ile bir büyük araştırma öncelik olarak ilan etti. WHO Bu koruma4büyük serolojik marker olarak tanınan olarak aşı immünojenisite, izlemek için antikor (NAb) ölçüm nötralize RSV kullanarak kabul etti. NAbs ağır RSV enfeksiyonu yanı sıra anti-RSV monoklonal antikor palivizumab, şu anda sadece profilaktik strateji kullanılabilir4klinik çalışmalar bir dizi karşı korumak için göstermiştir.
Birden çok NAb tahlil laboratuvarları tarafından Dünya çapında,5,6,7,8zorlu standartlaştırma çabaları yapmış hücre ve moleküler tabanlı deneyleri de dahil olmak üzere kullanılan biçimi vardır. Ancak, bir RSV özgü antikor varlığı ile sınırlı plak oluşturan birimler (PFU) sayısını ölçer geleneksel plak-azaltma nötralizasyon (PRN) tahlil hala altın standart9kalır. Burada, çok sayıda hücre satırlarında ile artan tahlil geçerek ve farklı RSV suşları için kullanılabilir bir geliştirilmiş, Basitleştirilmiş ve yüksek işlem hacmi PRN Protokolü raporu. Bu iletişim kuralı klinik numuneleri farklı ayarlar yanı sıra hayvan modeli deneyler örnekleri Tarih kullanılarak test edilmiştir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td>provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSV A2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-1540</td>
			<td>lot number 60430286</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1000142511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 &#176;C)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMC sodium salt powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5678-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 &#176;C)</td>
			<td>Scientific Services &#8211; Tissue Culture</td>
			<td></td>
			<td>MCRI in house supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 &#176;C)</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>SFBS-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat X RSV antibody</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AB1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 &#181;L aliquots at -20 &#176;C)</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>NR-4022</td>
			<td>Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 powder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31100035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk diluent blocking solution (stored at 4 &#176;C)</td>
			<td>Australian Biosearch</td>
			<td>50-82-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 &#176;C)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>s.d.H2O from Milli-Q dispenser</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>In-house dispensation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1X PBS for culture (stored at 4&#176;C)</td>
			<td>Scientific Services &#8211; Tissue Culture</td>
			<td></td>
			<td>MCRI in house supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 polysorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td>Invitro Technologies</td>
			<td>FAL352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit 0.22um (500 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NAL5660020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Australia PL</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile flat-bottom plates (96-well with lid)</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile U-bottom plates (96-well with lid)</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>650180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml serological pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4487-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4251-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pipette 1-200 &#181;L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960</td>
			<td>Fisher Biotec</td>
			<td>TF-200-L-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pipette 5-20 &#181;L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960</td>
			<td>Fisher Biotec</td>
			<td>TF-20-L-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pipette 100-1000 &#181;LClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000</td>
			<td>Fisher Biotec</td>
			<td>TF-1000-L-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pipette 1-10 &#181;L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001</td>
			<td>Fisher Biotec</td>
			<td>TXLF-10-L-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments and softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISpot reader system</td>
			<td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AID ELISpot software version 5.0</td>
			<td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel 2007</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved and high throughput respiratory syncytial virus (rsv) micro-neutralization assay

Solunum sinsisyal virüs özgü nötralize antikorlar (RSV yakalar) RSV karşı koruma önemli bir işaret vardır. Bu nedenle farklı tahlil biçimleri bir dizi şu anda dünya çapında bir ihtiyaç RSV yakalar ölçmek için doğru ve yüksek işlem hacmi bir yöntem için kullanılmaktadır. Biz burada RSV alt grubu A test edilmiş ve aynı zamanda RSV alt grubu B ve farklı örnek türleri için adapte edilebilir bir görüntüleme tabanlı mikro-nötralizasyon tahlil açıklayın. Bu yöntem son derece az % 10 varlık başvuru anti-serum arası tahlil varyasyon ile tekrarlanabilir. Bizce bu tahlil nispeten düşük maliyetle dünya çapında birçok laboratuarlarında kolayca kurulabilir. Gelişme RSV yakalar ölçer bir geliştirilmiş, yüksek üretilen iş testin yanı sıra roman RSV aşısı adayların değerlendirilmesi için gelecekte kritik bu yöntem Uluslararası Standardizasyon için önemli bir adım gösterir.

Bir virüs hisse senedi titrasyon 1:10 1:10 gerçekleştirilen8 seyreltme PRN tahlil ( Şekil 5' te gösterilen temsilcisi sonuçları) önce virüs hisse senedi konsantrasyonu belirlemek için. Şekil 5, PFU güvenilir 1:10 dilutions sayabiliriz4 ve 1:105. PFU aynı seyreltme, ineklemek kuyulardan ortalama sayısı hesaplanır. Noktalar 1:105 seyreltme 14 oldu ortalama sayısı beri bu...

Watch this Scientific Journal Video about An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus RSV Micro-neutralization Assay at JoVE.com

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus RSV Micro-neutralization Assay

Bu çalışmada açıklar yüksek işlem hacmi, nötralize antikorlar respiratuvar sinsityal virüs (RSV) için belirli titresi belirlemek için görüntüleme tabanlı mikro-nötralizasyon tahlil. Bu tahlil biçimi farklı örnek türleri üzerinde test edilmiştir.

Bir geliştirilmiş ve yüksek üretilen iş respiratuvar sinsityal virüs (RSV) mikro-nötralizasyon tahlil

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...

Solunum sinsi siniyel virüsüne karşı önemli bir koruma göstergesi olarak, rsv nötralize antikorları ölçmek için doğru ve yüksek iş elde etme yöntemi için bir ihtiyaç vardır. Bu yöntem referans antiserum un %10'dan az olması için yapılan tahsoz varyasyonları ile son derece tekrarlanabilir biz bu tahkikatın dünya çapında birçok laboratuvarda nispeten düşük maliyetle kolayca kurulabileceğine inanıyoruz. Burada RSV alt grubu A üzerinde test edilmiş ve ayrıca RSV alt grubu B ve farklı numune tipleri için uyarlanabilen görüntüleme tabanlı mikro nötralizasyon testini açıklıyoruz.Prosedürü gösteren Reuben Tse, MCRI araştırma ekibinin bir üyesi olacaktır. İlk gün tabakları tohumlamak için, ilk olarak DMEM medyasında A549 hücrelerini yeniden askıya alın, %10 FCS ve 1, 000 adet Penisilin-Streptomisin karışımı 400 konsantrasyonda, mililitre başına 000 hücre. Sonra tohum 96-iyi düz-alt steril plakalar ile 40, 000 A459 hücreleri kuyu başına 100 mikrolitre yoğunluğu.Plakayı bir gecede %5 karbondioksit ortamında 37 derecede kuluçkaya yatırın. İkinci gün serum seyreltme hazırlamak için, ilk oda sıcaklığında insan RSV referans serum ve serum test örnekleri çözültün. Daha sonra 56 santigrat derecede 30 dakika ısıtArak aktive edin.Daha sonra, referans serumun 1 ila 100 seyreltilmesinin 110 mikrolitresinden fazlasını, referans serumun 1,5 mikrolitresini FCS içermeyen DMEM ortamı ile Penisilin-Streptomisin karışımıyla 150 mikrolitrelik son hacmikarıştırın. Pipet 110 mikrolitre bu seyreltme 96-iyi U-alt steril plaka iyi A12 içine. Plaka aşağı seri bir ila iki seyreltme yapmak için, ilk wells B12 h12 için Penisilin-Streptomisin karışımı ile FCS içermeyen DMEM medya 55 mikrolitre ekleyin.Sonra yeni bir ipucu ile iyi A12 iyi B12 55 mikrolitre aktarın. Pipet yukarı ve aşağı beş kez çözelti karıştırmak için, ve iyi H12 ulaşana kadar devam edin. Deh12 çözeltisinin fazla 55 mikrolitre kapalı Pipet.Daha sonra, serum test örneklerinden 1 ila 100 seyreltme hazırlayın ve 96 kuyulu steril plakanın A1'den A9'a ve E1'den E9'a karşılık gelen kuyulara her seyreltmenin 110 mikrolitresini ekleyin. Daha sonra penisilin-Streptomisin karışımı ile FCS içermeyen DMEM medya 55 mikrolitre ekleyin sütunlar halinde kuyular bir ile dokuz arasında. Daha önce açıklandığı gibi A satırD ve satır E'den H satırına seri bir ila iki seyreltme yapın.10 ve 11 sütunlarında bulunan kuyulara Penisilin-Streptomisin karışımı ile 55 mikrolitre FCS içermeyen DMEM ortamı ekleyin. Virüs stokhazırlamak için, ilk hızla çözülmek için 37 derece santigrat su banyosu rsv dondurulmuş bir şişe koymak, sonra buz üzerinde şişe yerleştirin. Daha sonra, 100 kuyu için 55 mililitre toplam hacmi yapmak için iyi başına yaklaşık 200 PFU penisilin-Streptomisin karışımı içeren DMEM medya ya da virüs ekleyin.Virüs serum karışımı hazırlamak için, ilk sütun 1 ile dokuz ve sütun 10 ve 11 H ile E satır kuyuları tüm kuyulara seyreltilmiş virüs 55 mikrolitre ekleyin. Daha sonra Penisilin-Streptomisin karışımı ile 55 mikrolitre FCS-Streptomycin karışımı 10 ve 11 sütunların D ile D tüm kuyuları ekleyin ve bir saat boyunca% 5 karbondioksit ortamında 37 derece santigrat plaka kuluçka. A549 hücrelerinin RSV ile aşılanmasından önce, A549 hücre monokatmanlarının %80 konfluent olduğunu doğrulamak için hücre plakasını ışık mikroskobu altında inceleyin.Daha sonra ortamı atmak için tabağı hafifçe ters çevirin ve tabağı steril emici bir kağıt havluüzerinde hafifçe lekelayın. Her biri sonra, filtrelenmiş steril PBS ile yıkayın. Sonraki el yazması sağlanan plaka şablonuna göre A549 hücre plakası üzerinde ilgili kuyulara virüs serum karışımı nın kuyu başına 100 mikrolitre ekleyin ve bir saat boyunca% 5 karbondioksit% 5 santigrat derece plaka kuluçka.Kuluçka sonunda, kuyu başına 90 mikrolitre kaldırmak için bir pipet kullanın ve Penisilin-Streptomisin karışımında 1XM199, %1,5 CMC ve %2 FCS içeren 100 mikrolitre ortam ekleyin. Plakayı 37 derecede %5 karbondioksitle üç gün boyunca kuluçkaya yatırın. Bir bir teşbik plakasını düzeltmek ve geliştirmek için, ilk olarak RsV'ye bulaşmış A549 hücre plakasını ters çevirin ve M199, CMC, %2 FCS ve Penisilin-Streptomisin karışımı içeren ortamı atın.Sonra yavaş yavaş her kuyuya Fiksasyon Tampon 200 mikrolitre ekleyin. Plakayı eksi 20 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra sabitleme tampon atın ve hafifçe emici bir kağıt havlu üzerinde leke.Tabağı yüz üstü 10 dakika kurumaya bırakın. Daha sonra 05 polisorbat 20 içeren filtrelenmiş PBS tampon ile% 5 süt engelleme çözeltisi olun. Her kuyuya 200 mikrolitre blokçözeltisi ekleyin ve tabağı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçka sonunda yavaşça çözelti atmak ve emici bir kağıt havlu üzerinde leke plaka ters. Birincil antikor yapmak için, bloklama çözeltisi 1 ila 500 keçi XRSV antikor seyreltin. Her kuyuya 50 mikrolitre ekleyin ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede plaka kuluçka.Filtrelenmiş PBS-polisorbat ile tabağı üç kez yıkayın. Sonra, bloklama çözeltisi 1-5, 000 Alexa Fluor eşek anti-keçi immünglobulin G seyrelterek ikincil antikor olun. Her kuyuya 50 mikrolitre ekleyin ve bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.Filtrelenmiş PBS-polisorbat ile plakayı beş kez yıkayın. Otomatik spot okuyucuile plakları saymak için, ilk olarak FITC kanalındaki sayım ayarlarını girerek enstrümanla işbirliği yapmak için kullanılmayan 96 kuyulu bir kültür plakası kullanın. Sonra hücre plakasını oku, folyoya sar ve dört santigrat derecede saklayın.Daha sonra, sanatsal plaklar veya bozulmuş hücre monolayers için kuyuların görüntülerini kontrol edin ve bozulmuş hücre monolayers ile kuyuları hariç. No-serum kontrol kuyularının ortalama plak sayısı hesaplandı ve virüs aktivitesinin %50 inhibisyonuna yol açacak %50 nötralizasyon kesintisini belirlemek için kullanıldı. Karşılıklı serum seyreltme x ekseni ve iki nokta arasında çizilen bir çizgiden yarı günlük grafiğin y ekseninde plak sayısı çizildi.Test serumu örneklerinin %50 nötralizasyon titreleri kırmızı, serumsuz kontrol kuyularının %50 değerinin hemen üzerinde veya altında sayımlar yapılan serum seyreltmeleri saptandı. Gambiya ve Melbourne sağlıklı gönüllüler iki farklı yetişkin kohortlar RSVAPRN tahliller Gambiya yetişkin Melbourne yetişkinlere göre daha düşük ortalama NAB titre sahip sonuçlandı. Gösterilen insan RSV-referans serum varyasyon katsayısı ile çok düşük değişkenlik gösterir 6.82%Bu geliştirilmiş yüksek iş lenme RSV plak azaltma nötralizasyon tahlil kolayca birçok laboratuvarda uygulanabilir, ve RSV nötralize antikor tahlilleri için WHO uluslararası uyum çabasını destekleyecek.Bu gelecekte yeni RSV aşısı adaylarının değerlendirilmesi için kritik olacaktır.

Research

JoVE Journal

Medicine

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

Uzaktan Yüksek throughput fenotipleme için Fare Göz Enükleasyon

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Akut Graft-Versus-Host Hastalığı Biyomarkörler onaylanması için Yüksek Verimli Sıralı ELISA

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Alternatifi olarak dilaltı immünoterapi Akut Solunum Enfeksiyonları Karşı Koruma tetikleyebilecek

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Farelerde Trakea hızlı intübasyon için geliştirilmiş bir yöntem

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Bir Yüksek Verimli, Çoklanmış ve Hedefli Proteomik BOS Deneyi nörodejeneratif Biyomarkerleri ve Apolipoprotein E İzoformları Durum belirlememize

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Murine Left Anterior Descending (LAD) Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

Murine Left Anterior Descending LAD Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

Kemirgen Sol Ön İnen (LAD) koroner arter ligasyonu: Miyokard İnfarktüsü Yönelik Gelişmiş ve Basitleştirilmiş Modeli

Ischemic heart disease (IHD), or acute coronary syndrome (ACS), is one of the leading causes of death in the United States. IHD is characterized by ...