Name: measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry
Uploaded: 2020-03-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry at JoVE.com

يشكر المؤلفون ماريو نومورا، دكتوراه في الطب ورودولفو دياز لمساعدتهم في علم الأنسجة، وبييرك فورنييه، دكتوراه لتعليقاته القيمة لتحسين نوعية الورقة.

تم الحصول على جميع الفئران المستخدمة في هذه المقالات من سلالات فئران BALB/c ، باستخدام الفئران الذكور والإناث بشكل عشوائي. كما تم إجراء تجارب الثقافة السابقة باستخدام سلالات أخرى، مثل FVB، الفئران السويسرية، CD-1، والفئران CsA11،,12،,14. تم إيواء ج...

<ol>
	<li>Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+biology+and+pathology.">Bone biology and pathology.</a> Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).</li><li>Clark, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).</li><li>Fournier, P. G. J., Ju&#225;rez, P., Guise, T. A., Heymann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-bone+interactions:+there+is+no+place+like+bone.">Tumor-bone interactions: there is no place like bone.</a> Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).</li><li>Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stephen+Paget+and+the+"seed+and+soil"+theory+of+metastatic+dissemination.">Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination.</a> Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).</li><li>Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vicious+cycle+of+bone+metastases.">The vicious cycle of bone metastases.</a> Journal of Musculoskeletal &amp; Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+bone+metastasis.">Mechanisms of bone metastasis.</a> Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+to+bone:+causes,+consequences+and+therapeutic+opportunities.">Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).</li><li>Chong, S. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+bone+metastasis:+Opportunities+for+the+study+of+cancer+dormancy.">Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).</li><li>Deguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+bone+to+facilitate+measurement+of+adhesion+forces+and+super-resolution+imaging+of+osteoclasts.">In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts.</a> Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).</li><li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Nordstrand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+an+in+vitro+coculture+model+to+study+the+interactions+between+bone+and+prostate+cancer+cells.">Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).</li><li>Curtin, P., Youm, H., Salih, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cancer-bone+metastasis+model+using+ex+vivo+cocultures+of+live+calvaria+bones+and+cancer+cells.">Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells.</a> Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).</li><li>Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bone+formation+using+mouse+calvarial+organ+cultures.">Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures.</a> Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).</li><li>Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+new+bone+formation+in+neonatal+calvarial+organ+cultures.">Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).</li></ol>

هنا ، ونحن نصف بروتوكول لنموذج الجسم الحي السابق calvari لتقييم تكوين العظام أو ارتشاف ودراسة تفاعلات الخلايا السرطانية مع عظم الفأر ة calvarial. الخطوات الحاسمة لهذه التقنية هي تشريح ، والثقافة ، والتضمين ، وتحليل الكالفتريا. خلال تشريح الكالفاريات ، من الأهمية بمكان قطع الهيمي -كالفاريا إ?...

العظام هي نسيج ضام ديناميكي له عدة وظائف، بما في ذلك دعم العضلات، وحماية الأعضاء الداخلية ونخاع العظام، وتخزين وإطلاق الكالسيوم وعوامل النمو1،2. للحفاظ على سلامتها ووظيفتها السليمة ، فإن أنسجة العظام تخضع باستمرار لعملية إعادة عرض. بشكل عام ، يمكن تقسيم دورة إعادة عرض العظام إلى ارتشاف العظام وتكوين العظام1. يمكن أن يؤدي عدم التوازن بين هاتين المرحلتين من إعادة عرض العظام إلى تطور أمراض العظام. أيضا, أمراض مثل سرطان الثدي غالبا ما تؤثر على سلامة العظام; ما يقرب من 70٪ من المرضى في المراحل المتقدمة لديهم أو سيكون لديهم نقائل العظام. عندما تدخل خلايا سرطان الثدي العظام ، فإنها تؤثر على استقلاب العظام ، مما يؤدي إلى ارتشاف مفرط (آفات العظام) و / أو تشكيل (آفات العظام)3.
لفهم بيولوجيا أمراض العظام وتطوير علاجات جديدة ، من الضروري فهم الآليات التي ينطوي عليها إعادة عرض العظام. في أبحاث السرطان ، من الضروري التحقيق في عملية الانبثاث العظمي وعلاقته بالبيئة الدقيقة النقيلية. في عام 1889 ، افترض ستيفن باجيت أن الانبثاث تحدث عندما يكون هناك توافق بين الخلايا السرطانية والأنسجة المستهدفة ، واقترح أن الموقع النقيلي يعتمد على تقارب الورم للبيئة الدقيقة4. في عام 1997، قدم موندي وغيس مفهوم "الحلقة المفرغة لنقائل العظام" لشرح كيفية تعديل الخلايا السرطانية للبيئة الدقيقة للعظام لتحقيق بقائها والنمو، وكيف تعزز البيئة الدقيقة للعظام نموها من خلال توفير الكالسيوم وعوامل النمو5،6،7.
لتوصيف الآليات المشاركة في إعادة عرض العظام والانبثاث العظام وتقييم الجزيئات مع إمكانات علاجية ممكنة، فقد كان من الضروري لتطوير في المختبر وفي نماذج الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج تقدم حاليا العديد من القيود ، مثل التمثيل المبسط للبيئة الدقيقة للعظام ، وتكلفتها8،9. ثقافة العظام explants السابقين في الجسم الحي لديه ميزة الحفاظ على منظمة ثلاثية الأبعاد، فضلا عن تنوع خلايا العظام. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التحكم في الظروف التجريبية. نماذج explant تشمل ثقافة عظام مشط القدم، رؤساء الفخذ، calvarias، والنوى الفك السفلي أو trabecular10. وقد تم إثبات مزايا نماذج الجسم الحي السابقين في دراسات متنوعة. في عام 2009 ، ذكرت Nordstrand والمتعاونين إنشاء نموذج الثقافة المشتركة على أساس التفاعلات بين خلايا سرطان العظام والبروستاتا11. أيضا، في عام 2012، أفاد كورتين والمتعاونين تطوير نموذج ثلاثي الأبعاد باستخدام ex vivo cocultures12. والغرض من هذه النماذج الجسم الحي السابق هو إعادة ظروف البيئة الدقيقة العظام بأكبر قدر ممكن من الدقة لتكون قادرة على توصيف الآليات المشاركة في إعادة عرض العظام العادية أو المرضية وتقييم فعالية العوامل العلاجية الجديدة.
ويستند البروتوكول الحالي إلى الإجراءات التي نشرها غاريت13 ومحمد وآخرون14. وقد استخدمت ثقافات كالفاريا الفأر الوليدية كنموذج تجريبي، لأنها تحتفظ بالهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد للعظم قيد التطوير والخلايا العظمية، بما في ذلك الخلايا في جميع مراحل التمايز (أي العظام، والعظام، والخلايا العظمية، والخلايا النجمية) التي تؤدي إلى العظام الناضجة والعظام، فضلا عن المصفوفة المعدنية14. نموذج الجسم الحي السابق لا يمثل العملية المرضية لأمراض العظام تماما. ومع ذلك، يمكن قياس الآثار على إعادة عرض العظام أو انسياب العظام الناجم عن السرطان بدقة.
وباختصار ، يتكون هذا البروتوكول من الخطوات التالية : تشريح calvarias من الفئران القديمة 5-7 أيام ، calvaria preculture ، تطبيقات ثقافة calvaria (على سبيل المثال ، الثقافة في وجود الأنسولين والخلايا السرطانية أو المتوسطة مكيفة ، وحتى وكلاء مع الإمكانات العلاجية ، وفقا لهدف التحقيق) ، تثبيت العظام وإزالة الكلس ، معالجة الأنسجة ، التحليل النسيجي ، وتفسير النتائج.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well cell culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>15705-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovial</td>
			<td>SSI</td>
			<td>2341-S0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics-Antimycotic</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154-100GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628188</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2935-24X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal resin</td>
			<td>Richard Allen</td>
			<td>8310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (10X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebedding Cassettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z672122-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Golden</td>
			<td>26400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Workstation</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A81000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Golden</td>
			<td>60600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>JALMEK</td>
			<td>E5325-17P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>BIO-S1650-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and scissors</td>
			<td>LANCETA HG</td>
			<td>74165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides 25 x 75 mm</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris&#39;s Hematoxylin</td>
			<td>Jalmek</td>
			<td>SH025-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High profile blades</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1001259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoquinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>813150</td>
			<td>STP 120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>905200</td>
			<td>MICROM HM 355S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse food, 18% prot, 2018S</td>
			<td>Harlan</td>
			<td>T.2018S.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>OB0674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Paraplast</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Section Flotation Bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxin B</td>
			<td>Probiotek</td>
			<td>166-02072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax dispenser</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8523BX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Golden</td>
			<td>534056-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry

العظام هي نسيج ضام يتكون من العظام، والعظام، والعظام ومصفوفة معدنية خارج الخلية، مما يعطيها قوتها والمرونة ويسمح لها بالوفاء بوظائفها. يتعرض العظم باستمرار لمجموعة متنوعة من المحفزات ، والتي في الحالات المرضية يمكن أن تؤدي إلى تحرير إعادة عرض العظام. لدراسة بيولوجيا العظام والأمراض وتقييم العوامل العلاجية المحتملة ، كان من الضروري تطوير في المختبر وفي نماذج الجسم الحي.
تصف هذه المخطوطة عملية تشريح الكلفاريا المعزولة عن الفئران الوليدية والظروف الثقافية التي تُعزل عن الفئران الوليدية لدراسة تكوين العظام والبيئة الدقيقة لأورام العظام. على النقيض من نماذج المختبر وفي الجسم الحي ، يسمح هذا النموذج السابق للفحص الحي بالحفاظ على البيئة ثلاثية الأبعاد للأنسجة وكذلك التنوع الخلوي للعظم أثناء الزراعة في ظل ظروف محددة لمحاكاة البيئة الدقيقة المطلوبة. لذلك ، من الممكن التحقق من إعادة عرض العظام وآلياتها ، وكذلك التفاعلات مع أنواع الخلايا الأخرى ، مثل التفاعلات بين الخلايا السرطانية والعظام.
والتجارب ذكرت هنا استخدام calvarias من 5-7 اليوم القديمة BALB / C الفئران. يتم استزراع الهيمي-كالفاريا التي تم الحصول عليها في وجود الأنسولين أو خلايا سرطان الثدي (MDA-MB-231) أو المتوسطة المكيفة من ثقافات خلايا سرطان الثدي. بعد التحليل ، ثبت أن الأنسولين يسبب تكوين العظام الجديدة ، في حين أن الخلايا السرطانية وارتشاف العظام متوسط الحجم. وقد استخدم النموذج الكلوري بنجاح في البحوث الأساسية والتطبيقية لدراسة تطور العظام وأمراض العظام الناجمة عن السرطان. وعموما، بل هو خيار ممتاز لسهولة، ومفيدة، ومنخفضة التكلفة.

لتقييم تكوين العظام في نموذج الكلفاري، قمنا بزراعة الهيمي-كالفاريا في الوسائط مع أو بدون 50 ميكروغرام/مل من الأنسولين. تم إعداد أقسام الأنسجة وملطخة بـ H & E. في هذه الظروف ، أظهر علم الأنسجة أنه تم الحفاظ على السلامة الهيكلية للعظم الكلوري ، مما يسمح بتحديد مكوناته المختلف?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry at JoVE.com

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

يمكن أن تكون ثقافة الجسم الحي السابق للنباتات العظمية أداة قيمة لدراسة فسيولوجيا العظام والتقييم المحتمل للأدوية في إعادة عرض العظام وأمراض العظام. ويصف البروتوكول المقدم إعداد وثقافة الكلفاريا المعزولة عن جماجم الفئران حديثي الولادة، فضلا عن تطبيقاتها.

قياس إعادة عرض العظام وإعادة إنشاء بيئة الورم والعظام الدقيقة باستخدام ثقافة كالفاريا المشتركة والقياس الHISTOMORPHometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

والغرض من هذا الإجراء هو أن يكون نموذج السابقين vivo لتقييم العظام إعادة عرض وإعادة البيئة الدقيقة الورم العظام باستخدام ثقافة الكالفاريا أو ثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية. معظم تقنية الكالفاريا هي نظام استزراع الأعضاء باستخدام عظام الكالفاريا من فئران حديثي الولادة لتقييم إعادة عرض العظام. يمكنك اختبار الإمكانات العلاجية للجزيئات المتنوعة، أو حتى إعادة إنشاء بيئة الورم العظمي الدقيقة عند استخدام الثقافات المشتركة مع الخلايا السرطانية.كل ذلك في بسيطة وسهلة في وقت قصير وتكلفة منخفضة. والهدف من هذه التقنية هو أن يكون أداة لتقييم تجديد العظام في بيئة العظام السرطانية، وذلك باستخدام نموذج فيفو السابقين من ثقافة الجهاز الكالفاري الماوس. أولاً، حدد الجرو الماوس وضعه تحت غطاء محرك السيارة.نستخدم الكالفاريا من جرو فأر عمره خمسة إلى سبعة أيام. خذ الرأس مع الحقنة، وقطع الجلد، ومسح منطقة فروة الرأس بما فيه الكفاية لتشريح الكالفاريا. التعرف على خياطة الجمجمة، القوس، الإكلالي، و لامدويد.جعل قطع مستقيم على طول الغرز lambdoid، إلى حوالي مستوى العين. قطع على كل جانب، من الغرز لامدويد نحو خياطة التاجية. في زاوية 45، وجعل قطع آخر لربط نهاية القطع مع قطع من fontanel الأمامية.من المهم للغاية تحديد خياطة الجمجمة ، القوس ، الجبهية ، الإكليلية ، اللمدويد ، لضمان إدراج الأنسجة الصحيحة وتحليل الأنسجة. مع النصائح الدقيقة ملقط، وإزالة الكالفاريا، ووضعها على غطاء طبق بيتري. مع مشرط، وجعل قطع مستقيم من فونتانيل الخلفي على طول خياطة القوس من خلال خياطة الإكلال.يتم الحصول على اثنين من الهيمكالفاريا. اختيار كل كالفاريا مع ملقط، ووضعها في طبق بيتري جديد مع برنامج تلفزيوني. بالنسبة للثقافة، ضع الهيمكالفاريا في طبق ثقافة من الأنسجة يحتوي على 24 بئرًا، ويحتوي على ملليلتر واحد من الوسائط، وحضن لمدة 24 ساعة عند درجة 37 درجة.يمكننا أيضا استخدام الثقافات الكالفاري الأولية لإعادة إنتاج البيئة الدقيقة الورم العظام لارتشاف العظام. للقيام بذلك، ونحن شارك في زراعة الكالفاريات مع الخلايا السرطانية، أو مع وسائل الإعلام مكيفة من الخلايا السرطانية. بعد 24 ساعة، قم بإزالة الوسائط واستبدلها بوسائط تحتوي على العلاج الذي ترغب في اختباره.إذا كنت ترغب في تقييم الخلايا السرطانية وتفاعلات العظام، أو إعادة إنشاء بيئة الورم العظام الدقيقة، تمرير الكالفاريا إلى لوحة مرفق خلوي منخفضة، لتجنب تعلق الخلايا السرطانية إلى لوحة. تبسينيزي الخلايا السرطانية، عدها، ووضعها بعناية في الجزء العلوي من هيميكيلافاريا. يمكنك أيضا استخدام وسائل الإعلام الشرطية من الخلايا السرطانية، واستخدامها لاحتضان hemicalvaria.احتضان لمدة ستة إلى سبعة أيام في 37 درجة، مع خمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الثالث، قم بتغيير الوسائط ومتابعة الحضانة. يعتمد عدد الخلايا التي تستخدم في الثقافة المشتركة على الخط الخلوي السرطاني.تحتاج، أولا، لتحسين عدد الخلايا التي هناك حاجة إلى ذلك للحث على استجابة في واحد. بعد الثقافة، والكالفاريا تمر من خلال عملية التثبيت، decalcification، والparffin جزءا لا يتجزأ. وعلاوة على ذلك، يتم تقسيم الأنسجة في microtome، ملطخة، ويتم إجراء تحليل الهستومورومتري.إدراج الكالفاريا يمكن أن تكون خادعة. للتأكد من أن الأنسجة محمية أثناء إدراج، يمكنك وضع الأنسجة بين الإسفنج أو استخدام ورقة الأنسجة أو ورقة ماصة أخرى من قبل لوضعها في الكاسيت. لمعالجة الأنسجة، التفاف hemicalvaria في ورقة الأنسجة.ثم، وضعه في شريط التضمين، وإصلاح في المخزن المؤقت المحايد في formalin، لمدة 24 ساعة في أربع درجات. لتجمّع الكالفاريّة، ضع الكاسيت في 10٪ EDTA لمدة 48 ساعة بأربع درجات. معالجة كاسيت الأنسجة مع hemicalvaria في معالج الأنسجة التلقائي.اتبع دورة تناوب يومية منتظمة ، ثم ، وتشمل في البارافين. للقطع، وقطع أربعة أقسام microtic مع microtome، جبل المقاطع على الشرائح المجهر الزجاجي، وصمة عار مع الهماتكسلين، إيوسين. تم استخدام تحليل الأنسجة لإجراء التحليل الكمي لسطح العظام ومناطق إعادة عرض العظام.تم تحليل صور الكالفاريا في الأيام السبعة باستخدام برنامج التصوير. بالنسبة للتقييم الكمي، أولاً، حدد المجال للتحليل. ننظر في أقسام على telopa حيث أربعة X لتحديد التوجه وخيوط.حدد خياطة الإكلال، وحدد سطح العظام الطويل على جانب واحد، ثم السطح القصير على الجانب الآخر. تحت التكبير 40X، وتحديد خياطة الإكليلية ونقل اثنين أو ثلاثة حقول بصرية بعيدا عن خياطة، على طول السطح الطويل. التقاط صورة من هذه المنطقة لتحليلها.يمكنك استخدام برامج الصور لتحليل السلامة الهيكلية للعظم. التحليل الهستوموروميتري الكمي للسمك ومنطقة العظام في هيميكيلا يمكن القيام به. يعتمد تحليل الكالفاريا الصحيح على تضمين جيد وتوجه مناسب للحصول على نتائج هِسولوجية متسقة.تأكد من استخدام ما لا يقل عن ثلاثة كالفاريا لكل حالة تجريبية. هنا، يمكننا أن نرى هيكل العظام. في البرتقال، لوحظ العظام.يمكننا أيضا أن نرى وجود periosteum، ostocyte، إندوستيوم، وأجزاء أخرى من العظام. في حالتنا، نستخدم الأنسولين لزيادة إعادة عرض العظام. مقارنة مع السيطرة، يمكننا أن نرى زيادة كبيرة في منطقة العظام.هنا، يمكننا أن نرى تأثير MDA-MB-231 خط الخلية على نموذج كالفاريا. يمكننا أن نرى، بالمقارنة مع السيطرة، أن وجود الخلايا السرطانية تحفز العوامل العظمية التي تحفز تدمير العظام. استخدمنا نموذج الكالفاريا لقياس تجديد العظام وتفاعلات الخلايا السرطانية العظمية من خلال الثقافات المشتركة مع الخلايا السرطانية وعلم الأنسجة.كما نقوم أيضاً بالتحقق من صحة بياناتنا عن طريق التحقق الكمي من معدل الـ PCR في الوقت الحقيقي. هذا النموذج السابقين vivo لديها ميزة كثيرة، مثل منظمة ثلاثية الأبعاد ويتم الحفاظ على التنوع الخلوي للعظم، ويمكن التحكم في الظروف التجريبية. إلى جانب ذلك، فإن النموذج بسيط، يمكنك أن ترى النتائج في فترة قصيرة من الزمن، وأنها منخفضة التكلفة.ويمكن دمجها مع تقنيات أخرى، مثل الـ PCR الكمية في الوقت الحقيقي، والمجهر، والمجهرية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

بروتوكول شامل للعينة ونخاع العظام عملية قياس الأمراض المتبقية قابلة للقياس والخلايا الجذعية ليوكيميك في سرطان الدم النقوي الحاد

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة اللب والثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية لدراسة التفاعلات الخاصة بها

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

دراسة اثار الورم الذي يفرز الأورام الليفية علي تنشيط الضامة باستخدام الثقافة المشتركة مع غشاء نفاذيه يدعم

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

تحليل السكان الجانبية في خطوط الخلايا السرطانية الصلبة

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

نمذجة أورام العظام الأولية وورم خبيث في العظام مع زرع طعم الورم الصلب في العظام

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

عزل السوائل القريبة للتحقيق في البيئة الدقيقة للورم من سرطان البنكرياس الغدي

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

الثقافة المشتركة للخلايا الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية المنقوشة لدراسة الهجرة والتفاعلات الخلوية

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

الثقافة المشتركة للخلايا العصبية الغلوتاماترجية وخلايا الورم الدبقي عالية الجودة للأطفال في الأجهزة الدقيقة لتقييم التفاعلات الكهربائية

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

توسيع فهم البيئة الدقيقة للورم باستخدام تصوير قياس الطيف الكتلي لعينات الأنسجة الثابتة بالفورمالين والبارافين المضمنة

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

التشريح المجهري بالليزر الصناعي الموجه بالذكاء الاصطناعي للتحليل البروتيني المجهري للبيئة الدقيقة للورم

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...