Name: measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry
Uploaded: 2020-03-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry at JoVE.com

Forfatterne takker Mario Nomura, MD og Rodolfo Díaz for deres hjælp med histologi, og Pierrick Fournier, Ph.D. for hans værdifulde kommentarer til at forbedre kvaliteten af papiret.

Alle mus, der anvendes i disse analyser, blev fremstillet af BALB/c musstammer, der anvendte han- og hunmus vilkårligt. Tidligere dyrkningsforsøg er også blevet udført ved hjælp af andre stammer, såsom FVB, schweiziske mus, CD-1, og CsA mus11,12,14. Alle mus blev opstaldet i henhold til National Institutes of Health (NIH) retningslinjer, tillæg Q. Procedurer, der involverer dyreforsøg er blevet godkendt af Institutional ...

<ol>
	<li>Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+biology+and+pathology.">Bone biology and pathology.</a> Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).</li><li>Clark, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).</li><li>Fournier, P. G. J., Ju&#225;rez, P., Guise, T. A., Heymann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-bone+interactions:+there+is+no+place+like+bone.">Tumor-bone interactions: there is no place like bone.</a> Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).</li><li>Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stephen+Paget+and+the+"seed+and+soil"+theory+of+metastatic+dissemination.">Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination.</a> Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).</li><li>Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vicious+cycle+of+bone+metastases.">The vicious cycle of bone metastases.</a> Journal of Musculoskeletal &amp; Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+bone+metastasis.">Mechanisms of bone metastasis.</a> Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+to+bone:+causes,+consequences+and+therapeutic+opportunities.">Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).</li><li>Chong, S. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+bone+metastasis:+Opportunities+for+the+study+of+cancer+dormancy.">Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).</li><li>Deguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+bone+to+facilitate+measurement+of+adhesion+forces+and+super-resolution+imaging+of+osteoclasts.">In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts.</a> Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).</li><li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Nordstrand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+an+in+vitro+coculture+model+to+study+the+interactions+between+bone+and+prostate+cancer+cells.">Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).</li><li>Curtin, P., Youm, H., Salih, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cancer-bone+metastasis+model+using+ex+vivo+cocultures+of+live+calvaria+bones+and+cancer+cells.">Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells.</a> Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).</li><li>Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bone+formation+using+mouse+calvarial+organ+cultures.">Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures.</a> Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).</li><li>Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+new+bone+formation+in+neonatal+calvarial+organ+cultures.">Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).</li></ol>

Her beskriver vi protokollen for en calvarial ex vivo model til at evaluere knogledannelse eller resorption og til at studere samspillet mellem kræftceller med calvarial museknogle. De kritiske trin i denne teknik er dissektion, kultur, indlejring, og histomorfeanalyse af calvarias. Under dissektion af calvarias, er det afgørende at skære hemi-calvarias i en trapez, da det kraftigt vil lette orientering under paraffin optagelse. Når man studerer kræft celle interaktioner med calvarias, Er det vigtigt at bru...

Bone er en dynamisk bindevæv, der har flere funktioner, herunder støtte musklerne, beskytte de indre organer og knoglemarv, og lagring og frigivelse af calcium og vækstfaktorer1,2. For at bevare sin integritet og korrekte funktion, knoglevæv er løbende under processen med remodeling. Generelt kan en cyklus af knogleremodellering opdeles i knogleresorption og knogledannelse1. En ubalance mellem disse to faser af knogleremodellering kan føre til udvikling af knoglepatologier. Også, sygdomme som brystkræft ofte påvirker knogleintegritet; ca. 70 % af patienterne på fremskredne stadier har eller vil have knoglemetastaser. Når brystkræftceller kommer ind i knoglerne, påvirker de knoglestofskiftet, hvilket resulterer i overdreven resorption (osteoklastiske læsioner) og/eller dannelse (osteoblastiske læsioner)3.
For at forstå biologi knoglesygdomme og udvikle nye behandlinger, er det nødvendigt at forstå de mekanismer, der er involveret i knogle remodeling. I kræftforskning er det vigtigt at undersøge knoglemetastaseprocessen og dens relation til det metastatiske mikromiljø. I 1889, Stephen Paget hypotese, at metastaser opstår, når der er kompatibilitet mellem tumorceller og målvæv, og foreslog, at det metastatiske sted afhænger af affinitet af tumoren for mikromiljøet4. I 1997 introducerede Mundy og Guise begrebet "ond cirkel af knoglemetastaser" for at forklare, hvordan tumorceller ændrer knoglemikromiljøet for at opnå deres overlevelse og vækst, og hvordan knoglemikromiljøet fremmer deres vækst ved at give calcium og vækstfaktorer5,6,7.
For at karakterisere de mekanismer, der er involveret i knogleremodellering og knoglemetastase og til at evaluere molekyler med muligt terapeutisk potentiale, har det været nødvendigt at udvikle in vitro og in vivo modeller. Men disse modeller i øjeblikket præsenterer mange begrænsninger, såsom den forenklede repræsentation af knoglemikromiljø, og deres omkostninger8,9. Kulturen af knogle explants ex vivo har den fordel at opretholde den tre-dimensionelle organisation samt mangfoldigheden af knogleceller. Desuden kan forsøgsbetingelser styres. Den explant modeller omfatter kultur af metatarsal knogler, lårbenshoveder, calvarias, og mandibulære eller trabecular kerner10. Fordelene ved ex vivo-modellerne er blevet påvist i forskellige undersøgelser. I 2009 rapporterede Nordstrand og samarbejdspartnere etableringen af en coculture model baseret på samspillet mellem knogle-og prostatakræft celler11. Også, i 2012, Curtin og samarbejdspartnere rapporterede udviklingen af en tre-dimensionel model ved hjælp af ex vivo cocultures12. Formålet med sådanne ex vivo-modeller er at genskabe forholdene i knoglemikromiljøet så nøjagtigt som muligt for at kunne karakterisere de mekanismer, der er involveret i normal eller patologisk knoglersremodellering, og vurdere effekten af nye terapeutiske midler.
Denne protokol er baseret på de procedurer, der er offentliggjort af Garrett13 og Mohammad et al.14. Neonatal mus calvaria kulturer er blevet brugt som en eksperimentel model, da de bevarer de tre-dimensionelle arkitektur af knoglen under udvikling og knogleceller, herunder celler på alle stadier af differentiering (dvs. osteoblaster, osteoklaster, osteocytter, stromale celler), der fører til modne osteoklaster og osteoblaster, samt mineraliserede matrix14. Ex vivo-modellen repræsenterer ikke den patologiske proces med knoglesygdomme helt. Men, virkninger på knogle remodeling eller kræft-induceret knogleosteolyse kan måles nøjagtigt.
Kort sagt består denne protokol af følgende trin: dissektion af calvarier fra 5-7 dage gamle mus, calvariaprækultur, calvariakulturapplikationer (f.eks. kultur i nærvær af insulin, kræftceller eller konditioneret medium, og selv terapeutiske potentiale, i henhold til formålet med undersøgelsen), knoglefiksering og calvaria afkalkning, vævsbehandling, histologisk analyse, og resultatfortolkning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well cell culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>15705-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovial</td>
			<td>SSI</td>
			<td>2341-S0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics-Antimycotic</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154-100GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628188</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2935-24X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal resin</td>
			<td>Richard Allen</td>
			<td>8310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (10X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebedding Cassettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z672122-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Golden</td>
			<td>26400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Workstation</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A81000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Golden</td>
			<td>60600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>JALMEK</td>
			<td>E5325-17P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>BIO-S1650-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and scissors</td>
			<td>LANCETA HG</td>
			<td>74165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides 25 x 75 mm</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris&#39;s Hematoxylin</td>
			<td>Jalmek</td>
			<td>SH025-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High profile blades</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1001259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoquinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>813150</td>
			<td>STP 120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>905200</td>
			<td>MICROM HM 355S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse food, 18% prot, 2018S</td>
			<td>Harlan</td>
			<td>T.2018S.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>OB0674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Paraplast</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Section Flotation Bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxin B</td>
			<td>Probiotek</td>
			<td>166-02072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax dispenser</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8523BX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Golden</td>
			<td>534056-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry

Bone er en bindevæv består af osteoblaster, osteocytter, og osteoklaster og en mineraliseret ekstracellulær matrix, som giver det sin styrke og fleksibilitet og gør det muligt at opfylde sine funktioner. Bone er konstant udsat for en række stimuli, som i patologiske forhold kan deregulere knogle remodeling. For at studere knoglebiologi og -sygdomme og evaluere potentielle terapeutiske midler har det været nødvendigt at udvikle in vitro- og in vivo-modeller.
Dette manuskript beskriver dissektionsprocessen og dyrkningsbetingelserne for calvarier isoleret fra neonatale mus for at studere knogledannelse og knogletumormikromiljøet. I modsætning til in vitro og in vivo modeller, denne ex vivo model giver bevarelse af de tre-dimensionelle miljø af vævet samt cellulære mangfoldighed af knoglen, mens dyrkning under definerede betingelser for at simulere den ønskede mikromiljø. Derfor er det muligt at undersøge knoglerremodellering og dens mekanismer samt samspillet med andre celletyper, såsom samspillet mellem kræftceller og knogler.
De analyser, der rapporteres her, bruger calvarias fra 5-7 dage gamle BALB/C mus. De opnåede hemi-calvarier dyrkes i nærværelse af insulin, brystkræftceller (MDA-MB-231), eller konditioneret medium fra brystkræft cellekulturer. Efter analyse blev det fastslået, at insulin induceret ny knogledannelse, mens kræftceller og deres konditionerede medium induceret knogle resorption. Den calvarial model er blevet anvendt med succes i grundforskning og anvendt forskning til at studere knogleudvikling og kræft-induceret knoglesygdomme. Samlet set er det en glimrende mulighed for en nem, informativ og billig analyse.

For at vurdere knogledannelsen i calvarialmodellen dyrkede vi hemi-calvarias i medier med eller uden 50 μg/ml insulin. Vævsektioner blev forberedt og plettet med H&E. Under disse omstændigheder viste histologien, at den strukturelle integritet af kalvarialknoglen blev opretholdt, hvilket gjorde det muligt at identificere dens forskellige komponenter (figur 1). De calvarier, der blev behandlet med insulin, viste en stigning i mængden af knoglevæv sammenli...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry at JoVE.com

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Ex vivo-kulturen af knogleexplanter kan være et værdifuldt redskab til undersøgelse af knoglefysiologi og den potentielle evaluering af lægemidler i knogleremodellering og knoglesygdomme. Den præsenterede protokol beskriver forberedelse og kultur af calvarias isoleret fra nyfødte mus kranier, samt dens anvendelser.

Måling Bone Remodeling og genskabe Tumor-Bone Microenvironment Brug Calvaria Co-kultur og Histomorphometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Formålet med denne procedure er at have en ex vivo model til at evaluere knogle remodeling og genskabe tumor-knogle mikromiljø ved hjælp af calvaria kultur eller co-kultur med kræftceller. De fleste calvaria teknik er et organ kultur system ved hjælp af calvaria knogler fra neonatal mus til at evaluere knogle remodeling. Du kan teste det terapeutiske potentiale af forskellige molekyler, eller endda genskabe knogle-tumor mikromiljø, når du bruger co-kulturer med kræftceller.Alt dette i en enkel og nem analyse på kort tid og en lav pris. Formålet med denne teknik er at have et værktøj til at evaluere knogle regenerering i kræft knogle mikromiljø, ved hjælp af en ex vivo model af mus calvarial organkultur. Først skal du vælge en mus hvalp og placere den under kølerhjelmen.Vi bruger calvaria fra fem til syv dage gamle museunger. Tag hovedet med sprøjten, skær huden, og ryd hovedbunden området nok til dissekere calvaria. Identificer suturerne i kraniet, sagittal, koronal, og lambdoids.Lav en lave en lige snit langs lambdoid suturer, at omkring niveauet af øjet. Skær på hver side, fra lambdoid suturer mod koronal sutur. På 45 vinkel, gøre et andet snit til at forbinde slutningen af snittet lavet med snittet af den forreste fontanel.Det er yderst vigtigt at definere kraniet suturer, sagittal, frontal, koronal, lambdoid, at garantere den korrekte væv inklusion og histologi analyse. Med fine tips beslag, fjerne calvaria, og sætte det på en petriskål dække. Med en skalpel, lave en lige snit fra den bageste fontanel langs sagittal sutur gennem koronale sutur.Der opnås to hemicalvarias. Pick hver calvaria op med de vices, og læg dem i en ny petriskål med PBS. For kultur, placere hemicalvaria i en 24-godt væv kultur plade, der indeholder en milliliter af medier, og inkubere i 24 timer ved 37 grader.Vi kan også bruge primære calvarial kulturer til at reproducere tumor-knogle mikromiljø for knogle resorption. For at gøre det, vi co-kultur calvarias med kræftceller, eller med betinget medier fra kræftceller. 24 timer senere skal du fjerne mediet og erstatte det med medier, der indeholder den behandling, du gerne vil teste.Hvis du ønsker at evaluere kræftceller og knogle interaktioner, eller genskabe tumor-knogle mikromiljø, videregive calvaria til en lav cellulære vedhæftet fil plade, for at undgå fastgørelse af kræftceller til pladen. Trypsinize kræftcellerne, tælle dem, og placere dem omhyggeligt på toppen af hemicalvaria. Du kan også bruge betingede medier fra kræftceller, og bruge det til at inkubere hemicalvaria.Inkubere i seks til syv dage ved 37 grader, med fem procent CO2. På den tredje dag, ændre medierne og fortsætte inkubering. Antallet af celler, der bruger i co-kultur afhænger af kræft cellulære linje.Du skal først optimere antallet af celler, som det er nødvendigt for at fremkalde et svar i den ene. Efter kulturen passerer calvaria gennem en proces med fiksering, afkalkning og paraffin-indlejret. Endvidere er vævene sektionsopdelt i en mikrotom, farves, og histomorphometric analyse udføres.Inddragelsen af calvaria kan være vanskelig. For at sikre, at vævet er beskyttet under optagelsen, kan du sætte vævet mellem svampe eller bruge et silkepapir eller andet absorberende papir før at sætte det i kassetten. For væv behandling, wrap hemicalvaria i silkepapir.Derefter placere den i en indlejring kassette, og fix i neutral buffer i formalin, i 24 timer ved fire grader. For at afkalke calvaria, placere kassetten i en 10% EDTA i 48 timer ved fire grader. Betjen vævskassetterne med hemicalvaria i en automatisk vævsprocessor.Følg en regelmæssig dag rotation cyklus, derefter, omfatter i paraffin. Til skæring skæres fire mikrotiske sektioner med en mikrotom, monteres sektionerne på glasmikroskopdias og pletter med hematoxylin, eosin. Histologi analyse blev brugt til at udføre kvantitativ analyse af knoglen overflade og knogle remodeling områder.Billederne af calvaria på de syv dage blev analyseret ved hjælp af billedbehandling software. For kvantitativ vurdering, for det første, definere området for analysen. Kig i afsnittene på telopa, hvor fire X for at identificere orientering og suturer.Definer koronal sutur, og identificere den lange knogleoverflade på den ene side, og derefter den korte overflade på den anden. Under 40X forstørrelse, identificere koronale sutur og flytte to eller tre optiske felter væk fra suturen, langs den lange overflade. Tag billedet af dette område til analyse.Du kan bruge billeder software til at analysere den strukturelle integritet af knoglen. Kvantitativ histomorfmetrisk analyse for tykkelsen og knogleområdet af hemicalvaria kan gøres. Den korrekte calvaria analyse afhænger af en god indlejring og korrekt orientering for konsekvente histologiske resultater.Sørg for at bruge mindst tre calvaria pr eksperimentel tilstand. Her kan vi se knoglens struktur. I orange observeres knoglen.Vi kan også se tilstedeværelsen af periosteum, ostocyt, endosteum, og en anden del af knoglen. I vores tilfælde bruger vi insulin til at øge knogle remodeling. Sammenlignet med en kontrol, kan vi se en betydelig stigning i knogleområdet.Her kan vi se effekten af MDA-MB-231 celle linje på model calvaria. Vi kan se, sammenlignet med den kontrol, at tilstedeværelsen af kræftceller fremkalde osteolytiske faktorer, der stimulerer knogleødelæggelse. Vi brugte calvaria model til at måle knogle regenerering og kræft celle-knogle interaktioner ved co-kulturer med kræft celle og histologi.Vi validerer også vores data ved hjælp af kvantitative PCR i realtid. Denne ex vivo model har mange fordele, ligesom de tre-dimensionelle organisation og den cellulære mangfoldighed af knoglen bevares, og de eksperimentelle betingelser kan kontrolleres. Desuden er modellen enkel, du kan se resultater på kort tid, og det er dyrt.Og det kan kombineres med andre teknikker, som kvantitative real-time PCR, mikroskopi, og mikro-CT.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattende protokol til prøven og proces knoglemarven til at måle målbare Residual sygdom og Leukemic stamceller i akut Myeloid leukæmi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymale stamceller isoleret fra Pulp væv og fælles kultur med kræftceller til at studere deres interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Undersøgelse af virkningerne af tumor-Udskillede paracrine Ligands på makrofag aktivering ved hjælp af co-kultur med permeable membran støtter

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse af sidepopulation i faste tumorcellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modellering af primære knogletumorer og knoglemetastase med implantation af fast tumortransplantat i knogle

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolering af proksimale væsker for at undersøge tumormikromiljøet af pancreas adenocarcinom

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-kultur af Glioblastoma Stamceller på mønstrede neuroner til at studere migration og cellulære interaktioner

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Co-kultur af glutamatergiske neuroner og pædiatriske høj kvalitet Glioma celler i mikrofluidiske enheder til at vurdere elektriske interaktioner

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Udvidelse af forståelsen af tumormikromiljøet ved hjælp af massespektrometribilleddannelse af formalinfaste og paraffinindlejrede vævsprøver

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Industrialiseret, kunstig intelligens-styret lasermikrodissektion til mikroskaleret proteomisk analyse af tumormikromiljøet

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...