Name: measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry
Uploaded: 2020-03-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry at JoVE.com

De auteurs bedanken Mario Nomura, MD en Rodolfo Díaz voor hun hulp bij de histologie, en Pierrick Fournier, Ph.D. voor zijn waardevolle opmerkingen om de kwaliteit van het papier te verbeteren.

Alle muizen die in deze testen werden gebruikt, werden verkregen uit BALB/c muizenstammen, waarbij mannelijke en vrouwelijke muizen lukraak werden gebruikt. Eerdere cultuurexperimenten zijn ook uitgevoerd met andere stammen, zoals FVB, Zwitserse muizen, CD-1 en CsA muizen11,12,14. Alle muizen werden ondergebracht volgens de richtlijnen van het National Institutes of Health (NIH), Appendix Q. Procedures met betrekking tot proefpe...

<ol>
	<li>Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+biology+and+pathology.">Bone biology and pathology.</a> Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).</li><li>Clark, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).</li><li>Fournier, P. G. J., Ju&#225;rez, P., Guise, T. A., Heymann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-bone+interactions:+there+is+no+place+like+bone.">Tumor-bone interactions: there is no place like bone.</a> Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).</li><li>Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stephen+Paget+and+the+"seed+and+soil"+theory+of+metastatic+dissemination.">Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination.</a> Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).</li><li>Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vicious+cycle+of+bone+metastases.">The vicious cycle of bone metastases.</a> Journal of Musculoskeletal &amp; Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+bone+metastasis.">Mechanisms of bone metastasis.</a> Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+to+bone:+causes,+consequences+and+therapeutic+opportunities.">Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).</li><li>Chong, S. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+bone+metastasis:+Opportunities+for+the+study+of+cancer+dormancy.">Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).</li><li>Deguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+bone+to+facilitate+measurement+of+adhesion+forces+and+super-resolution+imaging+of+osteoclasts.">In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts.</a> Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).</li><li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Nordstrand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+an+in+vitro+coculture+model+to+study+the+interactions+between+bone+and+prostate+cancer+cells.">Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).</li><li>Curtin, P., Youm, H., Salih, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cancer-bone+metastasis+model+using+ex+vivo+cocultures+of+live+calvaria+bones+and+cancer+cells.">Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells.</a> Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).</li><li>Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bone+formation+using+mouse+calvarial+organ+cultures.">Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures.</a> Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).</li><li>Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+new+bone+formation+in+neonatal+calvarial+organ+cultures.">Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).</li></ol>

Hier beschrijven we het protocol voor een calvarial ex vivo model om botvorming of resorptie te evalueren en om de interacties van kankercellen met calvarial muisbot te bestuderen. De kritieke stappen van deze techniek zijn de dissectie, cultuur, inbedding en histomorfoalanalyse van de calvaria's. Tijdens de dissectie van de calvarias is het cruciaal om de hemi-calvaria's in een trapezium te snijden, omdat het de oriëntatie tijdens de paraffineopname sterk zal vergemakkelijken. Bij het bestuderen van kankercel ...

Bot is een dynamisch bindweefsel dat verschillende functies heeft, waaronder het ondersteunen van de spieren, het beschermen van de inwendige organen en beenmerg, en het opslaan en vrijgeven van calcium en groeifactoren1,2. Om zijn integriteit en de juiste functie te behouden, botweefsel is voortdurend onder het proces van remodelleren. In het algemeen kan een cyclus van botremodelleren worden onderverdeeld in botresorptie en botvorming1. Een onbalans tussen deze twee fasen van botremodelleren kan leiden tot de ontwikkeling van botpathologieën. Ook ziekten zoals borstkanker beïnvloeden vaak de integriteit van het bot; ongeveer 70% van de patiënten in vergevorderde stadia hebben of zullen botmetastasen hebben. Wanneer borstkankercellen de botten binnenkomen, beïnvloeden ze het botmetabolisme, wat resulteert in overmatige resorptie (osteoclastische laesies) en/of vorming (osteoblastische laesies)3.
Om de biologie van botziekten te begrijpen en nieuwe behandelingen te ontwikkelen, is het noodzakelijk om de mechanismen te begrijpen die betrokken zijn bij botremodellering. In kankeronderzoek is het essentieel om het botmetastaseproces en de relatie tot de uitgezaaide micro-omgeving te onderzoeken. In 1889 veronderstelde Stephen Paget dat metastasen optreden wanneer er compatibiliteit is tussen de tumorcellen en het doelweefsel, en suggereerde dat de uitgezaaide site afhangt van de affiniteit van de tumor voor de micro-omgeving4. In 1997 introduceerden Mundy en Guise het concept van de "vicieuze cirkel van botmetastasen" om uit te leggen hoe tumorcellen de botmicroomgeving wijzigen om hun overleving en groei te bereiken, en hoe de botmicroomgeving hun groei bevordert door calcium- en groeifactoren5,6,7te verstrekken .
Om de mechanismen te karakteriseren die betrokken zijn bij botremodelleren en botmetastase en om moleculen met mogelijk therapeutisch potentieel te evalueren, is het noodzakelijk geweest om in vitro en in vivo modellen te ontwikkelen. Deze modellen bieden momenteel echter vele beperkingen, zoals de vereenvoudigde weergave van de botmicroomgeving, en de kosten8,9. De cultuur van botexplants ex vivo heeft het voordeel dat de driedimensionale organisatie en de diversiteit van botcellen behouden blijven. Bovendien kunnen de experimentele omstandigheden worden gecontroleerd. De explant modellen omvatten de cultuur van middenvoetsbeentje botten, dijbeenhoofden, calvarias, en mandibulaire of trabecular kernen10. De voordelen van de ex vivo modellen zijn aangetoond in diverse studies. In 2009 meldden Nordstrand en medewerkers de oprichting van een cocultuurmodel op basis van de interacties tussen bot- en prostaatkankercellen11. Ook, in 2012, Curtin en medewerkers gemeld de ontwikkeling van een driedimensionaal model met behulp van ex vivo cocultures12. Het doel van dergelijke ex vivo modellen is om de omstandigheden van de botmicroomgeving zo nauwkeurig mogelijk te recreëren om de mechanismen te kunnen karakteriseren die betrokken zijn bij normale of pathologische botremodelleren en de werkzaamheid van nieuwe therapeutische middelen te evalueren.
Het huidige protocol is gebaseerd op de procedures gepubliceerd door Garrett13 en Mohammad et al.14. Neonatale muis calvaria culturen zijn gebruikt als een experimenteel model, omdat ze de driedimensionale architectuur van het bot in ontwikkeling en botcellen behouden, met inbegrip van cellen in alle stadia van differentiatie (dat wil zeggen, osteoblasten, osteoclasten, osteocyten, stromalcellen) die leiden tot volwassen osteoclasten en osteoblasten, evenals de gemineraliseerde matrix14. Het ex vivo-model vertegenwoordigt niet volledig het pathologische proces van botziekten. Echter, effecten op bot remodelleren of kanker-geïnduceerde bot osteolyse kan nauwkeurig worden gemeten.
Kortom, dit protocol bestaat uit de volgende stappen: de dissectie van calvarias van 5-7 dagen oude muizen, calvaria precultuur, calvaria cultuur toepassingen (bijv. cultuur in aanwezigheid van insuline, kankercellen of geconditioneerd medium, en zelfs agenten met therapeutisch potentieel, volgens het doel van het onderzoek), botfixatie en calvaria ontkalking, weefselverwerking, histologische analyse en resultaatinterpretatie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well cell culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>15705-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovial</td>
			<td>SSI</td>
			<td>2341-S0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics-Antimycotic</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154-100GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628188</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2935-24X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal resin</td>
			<td>Richard Allen</td>
			<td>8310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (10X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebedding Cassettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z672122-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Golden</td>
			<td>26400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Workstation</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A81000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Golden</td>
			<td>60600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>JALMEK</td>
			<td>E5325-17P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>BIO-S1650-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and scissors</td>
			<td>LANCETA HG</td>
			<td>74165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides 25 x 75 mm</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris&#39;s Hematoxylin</td>
			<td>Jalmek</td>
			<td>SH025-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High profile blades</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1001259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoquinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>813150</td>
			<td>STP 120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>905200</td>
			<td>MICROM HM 355S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse food, 18% prot, 2018S</td>
			<td>Harlan</td>
			<td>T.2018S.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>OB0674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Paraplast</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Section Flotation Bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxin B</td>
			<td>Probiotek</td>
			<td>166-02072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax dispenser</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8523BX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Golden</td>
			<td>534056-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry

Bot is een bindweefsel gevormd uit osteoblasten, osteocyten, en osteoclasten en een gemineraliseerde extracellulaire matrix, die het zijn kracht en flexibiliteit geeft en het in staat stelt om zijn functies te vervullen. Bot wordt continu blootgesteld aan een verscheidenheid aan stimuli, die in pathologische omstandigheden botremodelleren kunnen dereguleren. Om botbiologie en ziekten te bestuderen en potentiële therapeutische middelen te evalueren, was het noodzakelijk om in vitro en in vivo modellen te ontwikkelen.
Dit manuscript beschrijft het dissectieproces en de kweekomstandigheden van calvaria's geïsoleerd van neonatale muizen om botvorming en de bottumormicroomgeving te bestuderen. In tegenstelling tot in vitro en in vivo modellen, dit ex vivo model maakt het behoud van de driedimensionale omgeving van het weefsel, evenals de cellulaire diversiteit van het bot, terwijl het kweken onder gedefinieerde omstandigheden om de gewenste micro-omgeving te simuleren. Daarom is het mogelijk om botremodellering en de mechanismen ervan te onderzoeken, evenals de interacties met andere celtypen, zoals de interacties tussen kankercellen en bot.
De testen hier gemeld gebruik calvarias van 5-7 dagen oude BALB / C muizen. De verkregen hemi-calvarias worden gekweekt in aanwezigheid van insuline, borstkankercellen (MDA-MB-231), of geconditioneerd medium uit borstkankercelculturen. Na analyse werd vastgesteld dat insuline nieuwe botvorming veroorzaakte, terwijl kankercellen en hun geconditioneerde medium geïnduceerde botresorptie. Het calvariële model is met succes gebruikt in fundamenteel en toegepast onderzoek om botontwikkeling en door kanker veroorzaakte botziekten te bestuderen. Kortom, het is een uitstekende optie voor een eenvoudige, informatieve en low-cost test.

Om botvorming in het calvariële model te evalueren, cultiveerden we de hemi-calvaria's in media met of zonder 50 μg/mL insuline. Weefselsecties werden bereid en bevlekt met H&E. In deze omstandigheden toonde de histologie aan dat de structurele integriteit van het calvariale bot werd gehandhaafd, waardoor de verschillende componenten ervan kunnen worden geïdentificeerd (figuur 1). De calvarias behandeld met insuline presenteerde een toename van de hoeveelh...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry at JoVE.com

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

De ex vivo cultuur van botexplants kan een waardevol instrument zijn voor de studie van de botfysiologie en de mogelijke evaluatie van geneesmiddelen bij botremodellering en botziekten. Het gepresenteerde protocol beschrijft de voorbereiding en cultuur van calvarias geïsoleerd van pasgeboren muizen schedels, evenals de toepassingen ervan.

Het meten van bot remodelleren en recreëren van de Tumor-Bone Microenvironment Met behulp van Calvaria Co-cultuur en Histomorphometrie

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Het doel van deze procedure is om een ex vivo model te hebben om bot remodelleren te evalueren en de tumor-bone micro-omgeving te recreëren met behulp van calvaria cultuur of co-cultuur met kankercellen. De meeste calvaria techniek is een orgaancultuur systeem met behulp van calvaria botten van neonatale muizen om bot remodelleren te evalueren. U het therapeutisch potentieel van diverse moleculen testen, of zelfs de bot-tumor micro-omgeving nabootsen wanneer u coculturen met kankercellen gebruikt.Dat alles in een eenvoudige en eenvoudige test in een korte tijd en een lage kosten. Het doel van deze techniek is om een hulpmiddel te hebben om botregeneratie in de kankerbotmicro-omgeving te evalueren, met behulp van een ex vivo model van de calvariale orgaancultuur van de muis. Selecteer eerst een muispup en plaats deze onder de motorkap.We gebruiken calvaria van vijf- tot zeven dagen oude muizenpups. Neem het hoofd met de spuit, snijd de huid, en duidelijk de hoofdhuid genoeg voor de calvaria ontleden. Identificeer de hechtingen van de schedel, sagittale, coronale en lambdoïden.Maak een rechte snede langs de lambdoid hechtingen, tot ongeveer het niveau van het oog. Snijd aan elke kant, van de lambdoïde hechtingen naar de coronale hechting. Maak onder een hoek van 45 een andere snede om het uiteinde van de snede te verbinden met de snede van de voorste fontanel.Het is uiterst belangrijk om de schedelhechtingen, sagittale, frontale, coronale, lambdoïde te definiëren, om de juiste weefselinclusie en histologieanalyse te garanderen. Met fijne tips tangen, verwijder de calvaria, en zet het op een petrischaal deksel. Maak met een scalpel een rechte snede van de achterste fontanel langs de sagittale hechting door de coronale hechting.Er worden twee hemicalvarias verkregen. Pak elke calvaria met de tangen, en leg ze in een nieuwe petrischaal met PBS. Voor cultuur, plaats de hemicalvaria in een 24-well weefsel kweekplaat, met een milliliter van de media, en incubeer gedurende 24 uur op 37 graden.We kunnen ook primaire calvarial culturen gebruiken om de tumor-bot micro-omgeving te reproduceren voor botreptie. Om dat te doen, we co-cultuur calvarias met kankercellen, of met geconditioneerde media uit kankercellen. 24 uur later, verwijder de media en vervang deze door media met de behandeling die u wilt testen.Als u kankercellen en botinteracties wilt evalueren, of de micro-omgeving van het tumorbot opnieuw wilt maken, geef de calvaria dan door aan een lage cellulaire bevestigingsplaat, om de bevestiging van de kankercellen aan de plaat te voorkomen. Trypsinize de kankercellen, tel ze, en plaats ze zorgvuldig op de top van de hemicalvaria. U ook gebruik maken van voorwaardelijke media van kankercellen, en gebruik het om de hemicalvaria uit te broeden.Zes tot zeven dagen incubeer bij 37 graden, met vijf procent CO2. Op de derde dag, verander de media en blijven broeden. Het aantal cellen dat in de co-cultuur wordt gebruikt, is afhankelijk van de cellijn van kanker.U moet eerst het aantal cellen optimaliseren dat nodig is om een reactie in de ene te induceren. Na de cultuur, de calvaria passeren een proces van fixatie, ontkalking, en paraffine-embedded. Verder worden de weefsels geneist in een microtome, gekleurd, en histomorphometrische analyse wordt uitgevoerd.De opname van de calvaria kan lastig zijn. Om ervoor te zorgen dat het weefsel wordt beschermd tijdens de opname, u het weefsel tussen sponzen of gebruik een tissue papier of ander absorberend papier voordat het in de cassette. Voor weefselverwerking, wikkel de hemicalvaria in tissue papier.Plaats het vervolgens in een inbeddingscassette en bevestig het in neutrale buffer in formaline, gedurende 24 uur op vier graden. Om de calvaria te ontkalken, plaatst u de cassette gedurende 48 uur bij vier graden in een EDTA van 10%EDTA. Verwerk de weefselcassettes met de hemicalvaria in een automatische weefselprocessor.Volg een regelmatige dag rotatie cyclus, dan, omvatten in paraffine. Voor het doorsnijden, snijd vier microtische secties met een microtome, monteer de secties op glazen microscoop dia's, en vlek met hematoxylin, eosine. Histologie analyse werd gebruikt om kwantitatieve analyse van het botoppervlak en het bot remodelleren gebieden uit te voeren.De beelden van de calvaria op de zeven dagen werden geanalyseerd met behulp van de imaging software. Voor kwantitatieve beoordeling, in de eerste plaats, definiëren het gebied voor de analyse. Kijk in de secties op de telopa waar vier X om de oriëntatie en de hechtingen te identificeren.Definieer de coronale hechting en identificeer het lange botoppervlak aan de ene kant en vervolgens het korte oppervlak aan de andere kant. Onder de 40X vergroting, identificeer de coronale hechting en beweeg twee of drie optische velden uit de buurt van de hechting, langs het lange oppervlak. Leg het beeld van dit gebied vast om te analyseren.U afbeeldingensoftware gebruiken om de structurele integriteit van het bot te analyseren. Kwantitatieve histomorfometrische analyse voor de dikte en het botgebied van de hemicalvaria kan worden gedaan. De juiste calvaria-analyse hangt af van een goede inbedding en de juiste oriëntatie voor consistente histologische resultaten.Zorg ervoor dat u ten minste drie calvaria per experimentele aandoening gebruikt. Hier kunnen we de structuur van het bot zien. In oranje wordt het bot waargenomen.We kunnen ook de aanwezigheid van het periosteum, ostocyte, endosteum en andere delen van het bot zien. In ons geval gebruiken we insuline om de botremodellering te verhogen. Vergeleken met een controle, kunnen we een aanzienlijke toename van het botgebied zien.Hier zien we het effect van MDA-MB-231 cellijn op modelcalvaria. We kunnen zien, in vergelijking met de controle, dat de aanwezigheid van kankercellen osteolytische factoren induceert die botvernietiging stimuleren. We gebruikten calvaria model om botregeneratie en kankercel-bot interacties te meten door co-culturen met kankercel en histologie.We valideren onze gegevens ook op kwantitatieve real-time PCR. Dit ex vivo model heeft veel voordeel, zoals de driedimensionale organisatie en de cellulaire diversiteit van het bot worden bewaard, en de experimentele omstandigheden kunnen worden gecontroleerd. Bovendien is het model eenvoudig, u resultaten zien in een korte periode van tijd, en het is low-cost.En het kan worden gecombineerd met andere technieken, zoals kwantitatieve real-time PCR, microscopie en micro-CT.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymale stamcellen isolatie uit Pulp weefsel en co cultuur met kankercellen te bestuderen van hun interacties

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse van zijpopulatie in vaste tumorcellijnen

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modellering van primaire bottumoren en botmetastase met implantatie van solide tumortransplantaten in bot

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolatie van proximale vloeistoffen om de tumormicro-omgeving van pancreasadenocarcinoom te onderzoeken

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-cultuur van Glioblastoom Stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Co-cultuur van glutamaterge neuronen en pediatrische hoogwaardige glioomcellen in microfluïdische apparaten om elektrische interacties te beoordelen

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Uitbreiding van het begrip van de tumormicro-omgeving met behulp van massaspectrometrie Beeldvorming van formaline-vaste en paraffine-ingebedde weefselmonsters

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Geïndustrialiseerde, kunstmatige intelligentie-geleide lasermicrodissectie voor proteomische analyse op microschaal van de tumormicro-omgeving

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...