Name: measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry
Uploaded: 2020-03-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry at JoVE.com

Les auteurs remercient Mario Nomura, M.D. et Rodolfo Daaz pour leur aide à l’histologie, et Pierrick Fournier, Ph.D. pour ses précieux commentaires visant à améliorer la qualité du papier.

Toutes les souris utilisées dans ces essais ont été obtenues à partir de souches de souris BALB/c, utilisant des souris mâles et femelles sans discernement. Des expériences culturelles antérieures ont également été réalisées à l’aide d’autres souches, telles que FVB, souris suisses, CD-1, et CsA souris11,12,14. Toutes les souris ont été logées selon les directives des National Institutes of Health (NIH), l’...

<ol>
	<li>Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+biology+and+pathology.">Bone biology and pathology.</a> Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).</li><li>Clark, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).</li><li>Fournier, P. G. J., Ju&#225;rez, P., Guise, T. A., Heymann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-bone+interactions:+there+is+no+place+like+bone.">Tumor-bone interactions: there is no place like bone.</a> Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).</li><li>Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stephen+Paget+and+the+"seed+and+soil"+theory+of+metastatic+dissemination.">Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination.</a> Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).</li><li>Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vicious+cycle+of+bone+metastases.">The vicious cycle of bone metastases.</a> Journal of Musculoskeletal &amp; Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+bone+metastasis.">Mechanisms of bone metastasis.</a> Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+to+bone:+causes,+consequences+and+therapeutic+opportunities.">Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).</li><li>Chong, S. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+bone+metastasis:+Opportunities+for+the+study+of+cancer+dormancy.">Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).</li><li>Deguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+bone+to+facilitate+measurement+of+adhesion+forces+and+super-resolution+imaging+of+osteoclasts.">In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts.</a> Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).</li><li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Nordstrand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+an+in+vitro+coculture+model+to+study+the+interactions+between+bone+and+prostate+cancer+cells.">Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).</li><li>Curtin, P., Youm, H., Salih, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cancer-bone+metastasis+model+using+ex+vivo+cocultures+of+live+calvaria+bones+and+cancer+cells.">Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells.</a> Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).</li><li>Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bone+formation+using+mouse+calvarial+organ+cultures.">Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures.</a> Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).</li><li>Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+new+bone+formation+in+neonatal+calvarial+organ+cultures.">Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).</li></ol>

Ici, nous décrivons le protocole pour un modèle ex vivo calvaire pour évaluer la formation ou la résorption d’os et pour étudier les interactions des cellules cancéreuses avec l’os de souris calvaire. Les étapes critiques de cette technique sont la dissection, la culture, l’intégration et l’analyse histomorphométrique des calvarias. Pendant la dissection des calvarias, il est crucial de couper l’hémi-calvarias en trapézoïde, car il facilitera fortement l’orientation pendant l’inclusion ...

L’os est un tissu conjonctif dynamique qui a plusieurs fonctions, y compris le soutien des muscles, la protection des organes internes et de la moelle osseuse, et le stockage et la libération de calcium et les facteurs de croissance1,2. Pour maintenir son intégrité et sa bonne fonction, le tissu osseux est continuellement en cours de remodelage. En termes généraux, un cycle de remodelage des os peut être divisé en résorption osseuse et formation osseuse1. Un déséquilibre entre ces deux phases de remodelage osseux peut conduire au développement de pathologies osseuses. En outre, les maladies telles que le cancer du sein affectent souvent l’intégrité osseuse; environ plus de 70 % des patients à un stade avancé ont ou auront des métastases osseuses. Lorsque les cellules cancéreuses du sein pénètrent dans les os, elles affectent le métabolisme osseux, ce qui entraîne une résorption excessive (lésions ostéoclastiques) et/ou une formation (lésions ostéoblastiques)3.
Pour comprendre la biologie des maladies osseuses et développer de nouveaux traitements, il est nécessaire de comprendre les mécanismes impliqués dans le remodelage des os. Dans la recherche sur le cancer, il est essentiel d’étudier le processus de métastase osseuse et sa relation avec le microenvironnement métastatique. En 1889, Stephen Paget a émis l’hypothèse que les métastases se produisent quand il y a compatibilité entre les cellules tumorales et le tissu cible, et a suggéré que le site métastatique dépend de l’affinité de la tumeur pour le microenvironnement4. En 1997, Mundy et Guise ont introduit le concept du « cercle vicieux des métastases osseuses » pour expliquer comment les cellules tumorales modifient le microenvironnement osseux pour atteindre leur survie et leur croissance, et comment le microenvironnement osseux favorise leur croissance en fournissant du calcium et des facteurs de croissance5,,6,,7.
Pour caractériser les mécanismes impliqués dans le remodelage des os et la métastase osseuse et pour évaluer les molécules ayant un potentiel thérapeutique possible, il a été nécessaire de développer des modèles in vitro et in vivo. Cependant, ces modèles présentent actuellement de nombreuses limitations, telles que la représentation simplifiée du microenvironnement osseux, et leur coût8,9. La culture des explantations osseuses ex vivo a l’avantage de maintenir l’organisation tridimensionnelle ainsi que la diversité des cellules osseuses. En outre, les conditions expérimentales peuvent être contrôlées. Les modèles explants comprennent la culture des os métatarsiens, des têtes fémorales, des calvarias et des noyaux mandibulaires ou trabecular10. Les avantages des modèles ex vivo ont été démontrés dans diverses études. En 2009, Nordstrand et ses collaborateurs ont signalé la mise en place d’un modèle de coculture basé sur les interactions entre les cellules du cancer de l’os et de la prostate11. En outre, en 2012, Curtin et ses collaborateurs ont signalé le développement d’un modèle tridimensionnel à l’aide de cocultures ex vivo 12. Le but de ces modèles ex vivo est de recréer les conditions du microenvironnement osseux aussi précisément que possible pour être en mesure de caractériser les mécanismes impliqués dans le remodelage normal ou pathologique des os et d’évaluer l’efficacité de nouveaux agents thérapeutiques.
Le protocole actuel est basé sur les procédures publiées par Garrett13 et Mohammad et coll.14. Les cultures néonatales de calvaria de souris ont été employées comme modèle expérimental, car elles conservent l’architecture tridimensionnelle de l’os sous le développement et des cellules osseuses, y compris les cellules à tous les stades de la différenciation (c.-à-d. ostéoblastes, ostéoclastes, ostéocytes, cellules stromales) qui mènent aux ostéoclastes et aux ostéoblastes matures, ainsi qu’à la matrice minéralisée14. Le modèle ex vivo ne représente pas totalement le processus pathologique des maladies osseuses. Cependant, les effets sur le remodelage des os ou l’ostéolyse osseuse induite par le cancer peuvent être mesurés avec précision.
En bref, ce protocole se compose des étapes suivantes : la dissection des calvarias de souris de 5 à 7 jours, la préculture de calvaria, les applications de la culture de la calvaria (p. ex., la culture en présence d’insuline, les cellules cancéreuses ou le milieu conditionné, et même les agents avec potentiel thérapeutique, selon le but de l’enquête), fixation osseuse et décalcification de calvaria, traitement tissulaire, analyse histologique et interprétation des résultats.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well cell culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>15705-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovial</td>
			<td>SSI</td>
			<td>2341-S0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics-Antimycotic</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154-100GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628188</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2935-24X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal resin</td>
			<td>Richard Allen</td>
			<td>8310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (10X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebedding Cassettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z672122-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Golden</td>
			<td>26400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Workstation</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A81000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Golden</td>
			<td>60600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>JALMEK</td>
			<td>E5325-17P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>BIO-S1650-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and scissors</td>
			<td>LANCETA HG</td>
			<td>74165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides 25 x 75 mm</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris&#39;s Hematoxylin</td>
			<td>Jalmek</td>
			<td>SH025-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High profile blades</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1001259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoquinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>813150</td>
			<td>STP 120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>905200</td>
			<td>MICROM HM 355S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse food, 18% prot, 2018S</td>
			<td>Harlan</td>
			<td>T.2018S.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>OB0674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Paraplast</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Section Flotation Bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxin B</td>
			<td>Probiotek</td>
			<td>166-02072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax dispenser</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8523BX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Golden</td>
			<td>534056-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry

L’os est un tissu conjonctif constitué d’ostéoblastes, d’ostéocytes et d’ostéoclastes et d’une matrice extracellulaire minéralisée, qui lui donne sa force et sa flexibilité et lui permet d’accomplir ses fonctions. L’os est continuellement exposé à une variété de stimuli, qui dans des conditions pathologiques peuvent déréglementer le remodelage des os. Pour étudier la biologie osseuse et les maladies et évaluer les agents thérapeutiques potentiels, il a été nécessaire de développer des modèles in vitro et in vivo.
Ce manuscrit décrit le processus de dissection et les conditions de culture des calvarias isolés des souris néonatales pour étudier la formation osseuse et le microenvironnement de tumeur d’os. Contrairement aux modèles in vitro et in vivo, ce modèle ex vivo permet la préservation de l’environnement tridimensionnel du tissu ainsi que la diversité cellulaire de l’os tout en se chavant dans des conditions définies pour simuler le microenvironnement désiré. Par conséquent, il est possible d’étudier le remodelage des os et ses mécanismes, ainsi que les interactions avec d’autres types de cellules, tels que les interactions entre les cellules cancéreuses et les os.
Les essais signalés ici utilisent des calvarias de souris BALB/C vieilles de 5 à 7 jours. Les hémi-calvarias obtenus sont cultivés en présence d’insuline, de cellules cancéreuses du sein (MDA-MB-231), ou de milieu conditionné des cultures de cellules cancéreuses du sein. Après analyse, il a été établi que l’insuline a induit la nouvelle formation d’os, tandis que les cellules cancéreuses et leur résorption d’os induite par le milieu conditionné. Le modèle calvaire a été utilisé avec succès dans la recherche fondamentale et appliquée pour étudier le développement osseux et les maladies osseuses induites par le cancer. Dans l’ensemble, c’est une excellente option pour un essai facile, informatif et peu coûteux.

Pour évaluer la formation osseuse dans le modèle calvaire, nous avons cultivé les hémi-calvarias dans les médias avec ou sans 50 g/mL d’insuline. Des sections de tissus ont été préparées et tachées de H et E. Dans ces conditions, l’histologie a montré que l’intégrité structurale de l’os calvaire était maintenue, permettant l’identification de ses différents composants(figure 1). Les calvarias traitées à l’insuline présentaient un...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry at JoVE.com

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

La culture ex vivo des explantations osseuses peut être un outil précieux pour l’étude de la physiologie osseuse et l’évaluation potentielle des médicaments dans le remodelage des os et les maladies osseuses. Le protocole présenté décrit la préparation et la culture des calvarias isolées des crânes de souris nouveau-nés, ainsi que ses applications.

Mesurer le remodelage et la recréation du microenvironnement tumoral-os à l’aide de la co-culture Calvaria et de l’histomorphométrie

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Le but de cette procédure est d’avoir un modèle ex vivo pour évaluer le remodelage d’os et recréer le microenvironnement tumeur-os utilisant la culture de calvaria ou la co-culture avec des cellules cancéreuses. La plupart de la technique de calvaria est un système de culture d’organe utilisant des os de calvaria des souris néonatales pour évaluer le remodelage d’os. Vous pouvez tester le potentiel thérapeutique de diverses molécules, ou même recréer le microenvironnement os-tumeur lorsque vous utilisez des co-cultures avec des cellules cancéreuses.Tout cela dans un essai simple et facile en peu de temps et un faible coût. Le but de cette technique est d’avoir un outil pour évaluer la régénération osseuse dans le microenvironnement des os du cancer, en utilisant un modèle ex vivo de la culture des organes calvariaux de souris. Tout d’abord, sélectionnez un chiot de souris et placez-le sous le capot.Nous utilisons des calvaria de chiots souris de cinq à sept jours. Prenez la tête avec la seringue, couper la peau, et effacer la zone du cuir chevelu assez pour disséquer la calvaria. Identifier les sutures du crâne, du sagittal, du coronal et des lambdoids.Faire une coupe droite le long des sutures lambdoid, à peu près le niveau de l’œil. Couper de chaque côté, des sutures lambdoid vers la suture coronale. À 45 angle, faire une autre coupe pour connecter l’extrémité de la coupe faite avec la coupe de la fontanel antérieure.Il est extrêmement important de définir les sutures du crâne, sagittales, frontales, coronal, lambdoid, pour garantir l’inclusion correcte des tissus et l’analyse histologique. Avec des pointes fines forceps, retirer la calvaria, et le mettre sur un couvercle de boîte de Pétri. À l’aide d’un scalpel, faire une coupe droite à partir du fontanel postérieur le long de la suture sagittale à travers la suture coronale.Deux hemicalvarias sont obtenus. Choisissez chaque calvaria avec les forceps, et placez-les dans une nouvelle boîte de Pétri avec PBS. Pour la culture, placez l’hemicalvaria dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits, contenant un millilitre de médias, et incubez pendant 24 heures à 37 degrés.Nous pouvons également employer les cultures calvariales primaires pour reproduire le microenvironnement tumeur-os pour la résorption d’os. Pour ce faire, nous co-culture calvarias avec les cellules cancéreuses, ou avec des médias conditionnés à partir de cellules cancéreuses. 24 heures plus tard, retirez le média et remplacez-le par des supports contenant le traitement que vous souhaitez tester.Si vous souhaitez évaluer les cellules cancéreuses et les interactions osseuses, ou recréer le microenvironnement tumeur-os, passez la calvaria à une plaque d’attachement cellulaire basse, afin d’éviter l’attachement des cellules cancéreuses à la plaque. Essayez de trypsiniser les cellules cancéreuses, de les compter et de les placer soigneusement au sommet de l’hemicalvaria. Vous pouvez également utiliser des supports conditionnels à partir de cellules cancéreuses, et l’utiliser pour incuber l’hemicalvaria.Incuber pendant six à sept jours à 37 degrés, avec cinq pour cent de CO2. Le troisième jour, changez les médias et continuez à couver. Le nombre de cellules utilisant dans la co-culture dépend de la lignée cellulaire du cancer.Vous devez, tout d’abord, optimiser le nombre de cellules dont il est nécessaire pour induire une réponse dans l’un. Après la culture, la calvaria passe par un processus de fixation, de décalcification et d’encastrement paraffine. En outre, les tissus sont sectionnés dans un microtome, taché, et l’analyse histomorphométrique est effectuée.L’inclusion de la calvaria peut être délicate. Pour vous assurer que le tissu est protégé pendant l’inclusion, vous pouvez mettre le tissu entre les éponges ou utiliser un papier de soie ou tout autre papier absorbant avant de le mettre dans la cassette. Pour le traitement des tissus, envelopper l’hemicalvaria dans du papier de soie.Ensuite, placez-le dans une cassette d’intégration, et fixez-le en tampon neutre en formaline, pendant 24 heures à quatre degrés. Pour décalcifier la calvaria, placez la cassette dans un 10%EDTA pendant 48 heures à quatre degrés. Traiter les cassettes tissulaires avec l’hemicalvaria dans un processeur de tissu automatique.Suivez un cycle de rotation régulier d’une journée, puis, inclure dans la paraffine. Pour le sectionnement, couper quatre sections microtiques à l’aide d’une microtome, monter les sections sur des toboggans au microscope en verre et tacher avec de l’hématoxyline, de l’éosine. L’analyse d’histologie a été employée pour effectuer l’analyse quantitative de la surface d’os et des secteurs de remodelage d’os.Les images de la calvaria sur les sept jours ont été analysées à l’aide du logiciel d’imagerie. Pour l’évaluation quantitative, tout d’abord, définissez le domaine pour l’analyse. Regardez dans les sections sur la télopa où quatre X pour identifier l’orientation et les sutures.Définissez la suture coronale, et identifiez la longue surface osseuse d’un côté, puis la surface courte de l’autre. Dans le cadre du grossissement 40X, identifiez la suture coronale et éloignez deux ou trois champs optiques de la suture, le long de la longue surface. Capturez l’image de cette zone pour analyse.Vous pouvez utiliser un logiciel d’images pour analyser l’intégrité structurelle de l’os. L’analyse histomorphométrique quantitative pour l’épaisseur et la zone osseuse de l’hemicalvaria peut être faite. L’analyse correcte de calvaria dépend d’une bonne intégration et d’une orientation appropriée pour des résultats histologiques cohérents.Assurez-vous d’utiliser au moins trois calvaria par condition expérimentale. Ici, nous pouvons voir la structure de l’os. En orange, l’os est observé.Nous pouvons également voir la présence du périoste, de l’ostocyte, de l’endostée, et d’autres parties de l’os. Dans notre cas, nous utilisons l’insuline pour augmenter le remodelage osseux. Par rapport à un contrôle, nous pouvons voir une augmentation significative de la zone osseuse.Ici, nous pouvons voir l’effet de la ligne cellulaire MDA-MB-231 sur le modèle calvaria. Nous pouvons voir, par rapport au contrôle, que la présence de cellules cancéreuses induit des facteurs ostéolytiques qui stimulent la destruction osseuse. Nous avons utilisé le modèle calvaria pour mesurer la régénération osseuse et les interactions cellules-os cancéreuses par des co-cultures avec les cellules cancéreuses et l’histologie.Nous validons également nos données par PCR quantitative en temps réel. Ce modèle ex vivo ont de nombreux avantages, comme l’organisation tridimensionnelle et la diversité cellulaire de l’os sont préservés, et les conditions expérimentales peuvent être contrôlées. En outre, le modèle est simple, vous pouvez voir les résultats dans un court laps de temps, et il est à faible coût.Et il peut être combiné avec d’autres techniques, comme la PCR quantitative en temps réel, la microscopie et la micro-CT.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Protocole complet d’échantillon et de la moelle osseuse processus pour mesurer la maladie résiduelle mesurable et des cellules souches leucémiques dans la leucémie myéloïde aiguë

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu de pulpe et co-culture avec les cellules cancéreuses afin d’étudier leurs Interactions

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Étudier les effets des ligands paracriné sécrétés par les tumeurs sur l'activation du macrophage à l'aide de la co-culture avec des supports membranaires perméables

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse de la population latérale dans les variétés de cellule de tumeur solide

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modélisation des tumeurs osseuses primaires et des métastases osseuses avec implantation d’une greffe de tumeur solide dans l’os

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolement de liquides proximaux pour étudier le microenvironnement tumoral de l’adénocarcinome pancréatique

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-culture de cellules souches de glioblastome sur des neurones à motifs pour étudier la migration et les interactions cellulaires

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Co-culture de neurones glutamatergiques et de cellules de gliome pédiatrique de haut grade dans des dispositifs microfluidiques pour évaluer les interactions électriques

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Élargir la compréhension du microenvironnement tumoral à l’aide de l’imagerie par spectrométrie de masse d’échantillons de tissus fixés au formol et incorporés à la paraffine

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Microdissection laser industrialisée guidée par l’intelligence artificielle pour l’analyse protéomique à micro-échelle du microenvironnement tumoral

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...