Name: measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry
Uploaded: 2020-03-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry at JoVE.com

המחברים מודים מריו Nomura, md ו Rodolfo דיז על עזרתם עם היסטולוגיה, ופירט פורנייה, Ph.D. על הערות יקרות שלו כדי לשפר את איכות הנייר.

כל העכברים המשמשים באותם מאמר הושגו מזנים BALB/c עכברים, באמצעות עכברים זכר ונקבה ללא אבחנה. ניסויים בתרבות הקודמת בוצעו גם באמצעות זנים אחרים, כגון fvb, עכברים שוויצריים, CD-1, ו csa עכברים11,12,14. כל העכברים שוכנו על פי הנחיות המכון הלאומי לבריאות (...

<ol>
	<li>Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+biology+and+pathology.">Bone biology and pathology.</a> Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).</li><li>Clark, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).</li><li>Fournier, P. G. J., Ju&#225;rez, P., Guise, T. A., Heymann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-bone+interactions:+there+is+no+place+like+bone.">Tumor-bone interactions: there is no place like bone.</a> Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).</li><li>Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stephen+Paget+and+the+"seed+and+soil"+theory+of+metastatic+dissemination.">Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination.</a> Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).</li><li>Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vicious+cycle+of+bone+metastases.">The vicious cycle of bone metastases.</a> Journal of Musculoskeletal &amp; Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+bone+metastasis.">Mechanisms of bone metastasis.</a> Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+to+bone:+causes,+consequences+and+therapeutic+opportunities.">Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).</li><li>Chong, S. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+bone+metastasis:+Opportunities+for+the+study+of+cancer+dormancy.">Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).</li><li>Deguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+bone+to+facilitate+measurement+of+adhesion+forces+and+super-resolution+imaging+of+osteoclasts.">In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts.</a> Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).</li><li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Nordstrand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+an+in+vitro+coculture+model+to+study+the+interactions+between+bone+and+prostate+cancer+cells.">Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).</li><li>Curtin, P., Youm, H., Salih, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cancer-bone+metastasis+model+using+ex+vivo+cocultures+of+live+calvaria+bones+and+cancer+cells.">Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells.</a> Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).</li><li>Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bone+formation+using+mouse+calvarial+organ+cultures.">Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures.</a> Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).</li><li>Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+new+bone+formation+in+neonatal+calvarial+organ+cultures.">Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).</li></ol>

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור מודל vivo לשעבר כיפת להערכת היווצרות העצם או ספיגת וללמוד את האינטראקציות של תאים סרטניים עם עצם העכבר כיפת. הצעדים הקריטיים של טכניקה זו הם הניתוח, התרבות, ההטבעה, ו היפוסטומיטריקל אנליזה של calvarias. במהלך הניתוח של calvarias, זה חיוני לחתוך את המי-calvarias לתוך ט?...

עצם היא רקמת חיבור דינמית שיש לה מספר פונקציות, כולל תמיכה השרירים, הגנה על האיברים הפנימיים מח עצם, ואחסון ושחרור של סידן וגורמי גדילה1,2. כדי לשמור על שלמות ותפקוד תקין, רקמת העצם היא ברציפות תחת תהליך של שיפוץ. במונחים כלליים, מחזור של שיפוץ עצם ניתן לחלק לספיגת עצם היווצרות העצם1. חוסר איזון בין שני שלבים אלה של שיפוץ העצם יכול להוביל להתפתחות של הפתווגיות העצם. כמו כן, מחלות כגון סרטן השד משפיעים לעתים קרובות על שלמות העצם; כ 70% של חולים בשלבים מתקדמים יש או יהיה גרורות העצם. כאשר התאים סרטן השד להזין את העצמות, הם משפיעים על מטבוליזם העצם, וכתוצאה מכך ספיגת מוגזם (נגעים אוסטקלאסטיים) ו/או היווצרות (נגעים osteoblastic)3.
כדי להבין את הביולוגיה של מחלות העצם ולפתח טיפולים חדשים, יש צורך להבין את המנגנונים המעורבים בעיצוב מחדש של העצם. במחקר הסרטן, זה חיוני לחקור את התהליך גרורות העצם הקשר שלה מיקרוסביבה גרורתית. בשנת 1889, סטיבן פאג'ט שיערו כי גרורות מתרחשות כאשר יש תאימות בין תאי הגידול לבין רקמת היעד, והציע כי האתר גרורתי תלוי בזיקה של הגידול עבור מיקרוסביבה4. ב 1997, מונדי וגיז הציגו את המושג "מחזור אכזרי של גרורות העצם" כדי להסביר כיצד תאים סרטניים לשנות את מיקרוסביבה העצם כדי להשיג ההישרדות שלהם צמיחה, ואיך מיקרוסביבה העצם מקדמת את הצמיחה שלהם על ידי מתן סידן וגורמי צמיחה5,6,7.
כדי לאפיין את המנגנונים המעורבים בעיצוב העצם וגרורה, ולהעריך מולקולות בעלי פוטנציאל תרפויטי אפשרי, יש צורך לפתח בתוך מבחנה ובמודלים vivo . עם זאת, מודלים אלה מציגים כיום מגבלות רבות, כגון הייצוג הפשוט של מיקרואקולוגיה העצם, והעלות שלהם8,9. התרבות של vivo העצם explants ex יש את היתרון של שמירה על ארגון תלת מימדי, כמו גם מגוון של תאי העצם. בנוסף, ניתן לשלוט בתנאים ניסיוניים. המודלים לחקור כוללים את התרבות של עצמות המסרק, ראשי הירך, calvarias, ו הלסת התחתונה או בליבת העור10. היתרונות של מודלים vivo ex הוכחו במחקרים שונים. בשנת 2009, נורסטרנד ומשתפי-פעולה דיווחו על הקמת מודל התרבות הבין-תרבותית המבוססת על האינטראקציות בין העצמות לתאי סרטן הערמונית11. גם, ב 2012, Curtin ומשתפי פעולה דיווחו על פיתוח של מודל תלת מימדי באמצעות vivo cocultures ex 12. המטרה של מודלים vivo ex לשעבר היא לשחזר את התנאים של סביבת מיקרו העצם באופן מדויק ככל האפשר כדי להיות מסוגל לאפיין את המנגנונים המעורבים בעיצוב שיפוץ נורמלי או פתולוגי בעצם ולהעריך את היעילות של הסוכנים הטיפוליים החדשים.
הפרוטוקול הנוכחי מבוסס על ההליכים שפורסמו על ידי גארט13 ומחמד ואח '.14. התרבויות הcalvaria העכברים שימשו מודל ניסיוני, כפי שהם שומרים על הארכיטקטורה תלת מימדי של העצם תחת פיתוח ותאי עצם, כולל תאים בכל שלבי הבידול (כלומר, אוסטאופיות, אוסטאופאוקיים, אוסטאופציטים, סטרומה תאים) זה להוביל אוסטאופתיות בוגרת האוסטאופתיות, כמו גם מטריצה מינרליזציה14. המודל vivo ex אינו מייצג את התהליך הפתולוגי של מחלות העצם לחלוטין. עם זאת, השפעות על שיפוץ העצם או העצמות המושרה העצם אוסטאופוליזיס יכול להיות נמדד במדויק.
בקצרה, פרוטוקול זה כולל את השלבים הבאים: הניתוח של calvarias מ 5-7 הישן ביום עכברים, calvaria טרום תרבות, calvaria יישומי תרבות (למשל, תרבות בנוכחות של אינסולין, תאים סרטניים או בינוני ממוזג, ואפילו סוכנים עם פוטנציאל תרפויטי, על פי מטרת החקירה), קיבוע עצם וcalvaria decalcification, עיבוד רקמות, ניתוח היסטולוגית, ופרשנות התוצאה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well cell culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>15705-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovial</td>
			<td>SSI</td>
			<td>2341-S0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics-Antimycotic</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154-100GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628188</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2935-24X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal resin</td>
			<td>Richard Allen</td>
			<td>8310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (10X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebedding Cassettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z672122-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Golden</td>
			<td>26400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Workstation</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A81000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Golden</td>
			<td>60600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>JALMEK</td>
			<td>E5325-17P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>BIO-S1650-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and scissors</td>
			<td>LANCETA HG</td>
			<td>74165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides 25 x 75 mm</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris&#39;s Hematoxylin</td>
			<td>Jalmek</td>
			<td>SH025-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High profile blades</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1001259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoquinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>813150</td>
			<td>STP 120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>905200</td>
			<td>MICROM HM 355S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse food, 18% prot, 2018S</td>
			<td>Harlan</td>
			<td>T.2018S.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>OB0674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Paraplast</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Section Flotation Bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxin B</td>
			<td>Probiotek</td>
			<td>166-02072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax dispenser</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8523BX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Golden</td>
			<td>534056-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry

עצם היא רקמת חיבור היוו האוסטאופאוקיים, אוסטאופציטים, ו osteoclasts ו מטריצה החילוץ מינרליזציה, אשר נותן לו את כוחה וגמישות ומאפשר לו להגשים את תפקידיה. עצם הוא נחשף ברציפות למגוון של גירויים, אשר בתנאים פתולוגיים יכול deregulate העצם שיפוץ. כדי ללמוד ביולוגיה של עצם ומחלות ולהעריך את הסוכנים הטיפוליים הפוטנציאליים, יש צורך לפתח בתוך מבחנה ובמודלים vivo .
כתב יד זה מתאר את תהליך הניתוח ותנאי התרבות של calvarias מבודדים מעכברי המין לחקור את היווצרות העצם ואת מיקרוסביבה הגידול בעצם. בניגוד למבחנה במודלים vivo , זה לשעבר מודל vivo מאפשר שימור של הסביבה תלת ממדית של הרקמה, כמו גם את הגיוון הסלולר של העצם תוך הימנעות תחת תנאים מוגדרים כדי לדמות את מיקרוהסביבה הרצויה. לכן, ניתן לחקור את שיפוץ העצם ואת המנגנונים שלה, כמו גם את האינטראקציות עם סוגי תאים אחרים, כגון האינטראקציות בין תאים סרטניים ועצם.
הבחני דיווחו כאן להשתמש calvarias מ 5-7 ביום הישן balb/C עכברים. המי-calvarias שהתקבלו הם מתורבתים בנוכחות של אינסולין, תאי סרטן השד (מד א-MB-231), או בינוני ממוזג מתרביות תאים של סרטן השד. לאחר הניתוח, זה הוקם כי אינסולין המושרה היווצרות העצם החדשה, בעוד תאים סרטניים המדיום הממוזג שלהם המושרה ספיגת העצם. מודל כיפת בוצע בהצלחה במחקר בסיסי ויישם כדי ללמוד פיתוח עצם ומחלות העצם המושרה בסרטן. באופן כללי, זוהי אפשרות מצוינת עבור שיטת קל, אינפורמטיבי, ובעלות נמוכה.

כדי להעריך את היווצרות העצם במודל כיפת, טיפצנו את המי-קלווריון במדיה עם או בלי 50 μg/mL של אינסולין. מקטעי רקמות היו מוכנים מוכתם עם H & E. בתנאים אלה, היסטולוגיה הראו כי השלמות המבנית של עצם הקאלוריון נשמרה ומאפשרת זיהוי של מרכיביה השונים (איור 1). הקלווריון שטו?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry at JoVE.com

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

התרבות vivo ex של explants העצם יכול להיות כלי רב ערך לחקר הפיזיולוגיה של העצם ואת הערכה פוטנציאלית של תרופות שיפוץ העצם ומחלות העצם. הפרוטוקול המוצג מתאר את ההכנה והתרבות של calvarias מבודדים מגולגלות העכברים היילוד, כמו גם את יישומיה.

שיפוץ עצם מדידה ויצירה משולבת של מיקרוסביבה של עצם הגידול באמצעות Calvaria Co-תרבות והימאנורמוטוריקה

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

מטרת הליך זה היא להיות מודל vivo לשעבר כדי להעריך את שיפוץ העצם ולשחזר את microenvironment עצם הגידול באמצעות תרבות קלבריה או שיתוף תרבות עם תאים סרטניים. רוב טכניקת calvaria היא מערכת תרבות איברים באמצעות עצמות calvaria מעכברים יילודים כדי להעריך את שיפוץ העצם. אתה יכול לבדוק את הפוטנציאל הטיפולי של מולקולות מגוונות, או אפילו לשחזר את microenvironment גידול העצם כאשר אתה משתמש בתרבויות שיתוף עם תאים סרטניים.כל זה בהתראה פשוטה וקלה בזמן קצר ועלות נמוכה. מטרת טכניקה זו היא לקבל כלי להערכת התחדשות העצם ב microenvironment עצם סרטן, באמצעות מודל vivo לשעבר של תרבות איברים קלבריאליים העכבר. ראשית, בחר גור עכבר והצב אותו מתחת למכסה המנוע.אנחנו משתמשים בגולגולתא מגורי עכברים בני חמישה עד שבעה ימים. קח את הראש עם המזרק, לחתוך את העור, ולנקה את אזור הקרקפת מספיק כדי לנתח את הקלבריה. זהה את התפרים של הגולגולת, קשת, קורונדל, ו lambdoids.לעשות חתך ישר לאורך התפרים lambdoid, על רמת העין. חותכים מכל צד, מתפרים lambdoid לכיוון התפר קורונטל. ב 45 זווית, לעשות חתך נוסף כדי לחבר את הקצה של החתך עשה עם החתך של fontanel הקדמי.חשוב מאוד להגדיר את תפרי הגולגולת, קשתית, פרונטלית, קורונאלית, lambdoid, כדי להבטיח את הכללת הרקמה הנכונה וניתוח היסטולוגיה. עם מדפים טיפים עדין, להסיר את calvaria, ולשים אותו על כיסוי צלחת פטרי. עם אזמל, לעשות חתך ישר מן fontanel האחורי לאורך התפר sagittal דרך התפר קורונאל.שני hemicalvarias מתקבלים. הרם כל קלבריה עם המדפים, והצב אותם בצלחת פטרי חדשה עם PBS. לתרבות, מניחים את hemicalvaria בצלחת תרבות רקמות 24 באר, המכיל מיליליטר אחד של מדיה, ודגירה במשך 24 שעות ב 37 מעלות.אנחנו יכולים גם להשתמש בתרבויות עגליות ראשוניות כדי לשחזר את microenvironment עצם הגידול עבור resorption העצם. כדי לעשות זאת, אנו שיתוף תרבות calvarias עם תאים סרטניים, או עם מדיה מותנה של תאים סרטניים. 24 שעות לאחר מכן, להסיר את המדיה ולהחליף אותו עם מדיה המכילה את הטיפול שאתה רוצה לבדוק.אם ברצונך להעריך תאים סרטניים ואינטראקציות עצם, או לשחזר את microenvironment עצם הגידול, להעביר את calvaria לצלחת התקשרות הסלולר נמוך, כדי למנוע את ההחזקה של תאים סרטניים לצלחת. טריפסיניזציה של התאים הסרטניים, לספור אותם, ולמקם אותם בזהירות בחלק העליון של hemicalvaria. אתה יכול גם להשתמש במדיה מותנית מתאים סרטניים, ולהשתמש בו כדי להחפיר את hemicalvaria.דגירה במשך שישה עד שבעה ימים ב 37 מעלות, עם חמישה אחוזים CO2. ביום השלישי, לשנות את התקשורת ולהמשיך דגירה. מספר התאים המשתמשים בתרבות השיתוף תלוי בקו התאי של הסרטן.אתה צריך, תחילה, כדי למטב את מספר התאים הדרושים כדי לגרום לתגובה באחד. לאחר התרבות, הקלבריה עוברת תהליך של קיבעון, דקלציה ופרפין מוטבע. יתר על כן, הרקמות חתוכו במיקרוטום, מוכתמות, וניתוח היסטומורפי מבוצע.הכללת הקלבריה יכולה להיות מסובכת. כדי לוודא כי הרקמה מוגנת במהלך ההכללה, אתה יכול לשים את הרקמה בין ספוגים או להשתמש בנייר טישו או נייר סופג אחר לפני לשים אותו בקלטת. לעיבוד רקמות, לעטוף את hemicalvaria בנייר טישו.לאחר מכן, למקם אותו לתוך קלטת הטבעה, ולתקן במאגר ניטרלי בפורמלין, במשך 24 שעות בארבע מעלות. כדי לתקן את הקלבריה, הנח את הקלטת ב- 10%EDTA למשך 48 שעות בארבע מעלות. לעבד את קלטות הרקמה עם hemicalvaria במעבד רקמות אוטומטי.בצע מחזור סיבוב יום רגיל, ולאחר מכן, כלול בפרפין. לצורך חתך, לחתוך ארבעה חלקים מיקרוטיים עם microtome, לעלות את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית, וכתם עם hematoxylin, אאוסין. ניתוח היסטולוגיה שימש לביצוע ניתוח כמותי של משטח העצם ושטחי שיפוץ העצמות.התמונות של הקלבריה בשבעת הימים נותחו באמצעות תוכנת ההדמיה. עבור הערכה כמותית, ראשית, הגדר את האזור לניתוח. תסתכל בקטעים על הטלופה שבו ארבעה X כדי לזהות את האוריינטציה ואת התפרים.הגדר את התפר התותח, וזהה את משטח העצם הארוך בצד אחד, ולאחר מכן את המשטח הקצר בצד השני. תחת ההגדלה 40X, לזהות את התפר הכתר ולהזיז שניים או שלושה שדות אופטיים מן התפר, לאורך פני השטח הארוכים. צלם את התמונה של אזור זה לצורך ניתוח.אתה יכול להשתמש בתוכנת תמונות כדי לנתח את השלמות המבנית של העצם. ניתוח היסטומורפי כמותי לעובי ולאזור העצם של ההמיקלוואריה יכול להיעשות. ניתוח הקלבריה הנכון תלוי בהטבעה טובה ובכיוון הנכון לתוצאות היסטולוגיות עקביות.הקפד להשתמש לפחות שלושה קלבריה לכל מצב ניסיוני. כאן, אנו יכולים לראות את מבנה העצם. בכתום, העצם נצפית.אנחנו יכולים גם לראות את הנוכחות של periosteum, ostocyte, אנדוסטיום, וחלקים אחרים של העצם. במקרה שלנו, אנו משתמשים באינסולין כדי להגדיל את שיפוץ העצם. בהשוואה לשליטה, אנו יכולים לראות עלייה משמעותית באזור העצם.כאן, אנו יכולים לראות את ההשפעה של קו תא מד"א-MB-231 על קלבריה מודל. אנו יכולים לראות, בהשוואה לשליטה, כי נוכחותם של תאים סרטניים לגרום גורמים osteolytic הממריצים הרס העצם. השתמשנו במודל קלבריה כדי למדוד התחדשות עצם ואינטראקציות סרטן בין עצם התא על ידי תרבויות שיתוף עם תאים סרטניים והיסטולוגיה.אנו גם מאמתים את הנתונים שלנו לפי PCR כמותי בזמן אמת. למודל האקס ויוו הזה יש יתרונות רבים, כמו הארגון התלת מימדי והמגוון התאי של העצם נשמרים, ותנאים ניסיוניים יכולים להיות נשלטים. חוץ מזה, המודל הוא פשוט, אתה יכול לראות תוצאות בתקופה קצרה של זמן, וזה בעלות נמוכה.וזה יכול להיות משולב עם טכניקות אחרות, כמו PCR כמותי בזמן אמת, מיקרוסקופיה, מיקרו-CT.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

פרוטוקולים מקיפה לדוגמה, מח עצם תהליך למדידת מחלה שיורית מדיד, לוקמיה בתאי גזע לוקמיה מיאלואידית חריפה

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

בידוד תאי גזע mesenchymal זולה רקמות, תרבות משותפת עם תאים סרטניים ללמוד אינטראקציות שלהם

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

לומד את ההשפעות של הקרנף המופרש ליגרין המקרופאג הפעלה באמצעות תרבות שיתוף עם ממברנה חדיר תומך

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

ניתוח אוכלוסיית הצד בקווי תאים סרטניים מלאים

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

מידול גידולי עצם ראשוניים וגרורות עצם עם השתלת גידול מוצק השתלת עצם לעצם

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

בידוד של נוזלים פרוקסימליים כדי לחקור את המיקרו-סביבה של הגידול של אדנוקרצינומה של הלבלב

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

תרבות משותפת של תאים דמויי גזע גליובלסטומה על נוירונים בדוגמת ללמוד הגירה ואינטראקציות הסלולר

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

תרבית משותפת של נוירונים גלוטמטריים ותאי גליומה ברמה גבוהה לילדים למכשירים מיקרופלואידיים להערכת אינטראקציות חשמליות

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

הרחבת ההבנה של המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה של דגימות רקמה קבועות פורמלין ומשובצות פרפין

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

מיקרו-דיסקציה מתועשת, מונחית בינה מלאכותית בלייזר לניתוח פרוטאומי בקנה מידה זעיר של המיקרו-סביבה של הגידול

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...