Name: measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry
Uploaded: 2020-03-14T12:00:00
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Gli autori ringraziano Mario Nomura, M.D. e Rodolfo Daaz per il loro aiuto con l'istologia, e Pierrick Fournier, Ph.D. per i suoi preziosi commenti per migliorare la qualità della carta.

Tutti i topi utilizzati in questi saggi sono stati ottenuti da ceppi di topi BALB/c, usando indiscriminatamente topi maschi e femmine. Precedenti esperimenti di coltura sono stati eseguiti anche utilizzando altri ceppi, come FVB, topi svizzeri, CD-1 e mouse CsA11,12,14. Tutti i topi sono stati ospitati secondo le linee guida dei National Institutes of Health (NIH), le procedure dell'Appendice Q. che coinvolgono soggetti animali ...

<ol>
	<li>Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+biology+and+pathology.">Bone biology and pathology.</a> Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).</li><li>Clark, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).</li><li>Fournier, P. G. J., Ju&#225;rez, P., Guise, T. A., Heymann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-bone+interactions:+there+is+no+place+like+bone.">Tumor-bone interactions: there is no place like bone.</a> Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).</li><li>Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stephen+Paget+and+the+"seed+and+soil"+theory+of+metastatic+dissemination.">Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination.</a> Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).</li><li>Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vicious+cycle+of+bone+metastases.">The vicious cycle of bone metastases.</a> Journal of Musculoskeletal &amp; Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+bone+metastasis.">Mechanisms of bone metastasis.</a> Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+to+bone:+causes,+consequences+and+therapeutic+opportunities.">Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).</li><li>Chong, S. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+bone+metastasis:+Opportunities+for+the+study+of+cancer+dormancy.">Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).</li><li>Deguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+bone+to+facilitate+measurement+of+adhesion+forces+and+super-resolution+imaging+of+osteoclasts.">In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts.</a> Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).</li><li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Nordstrand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+an+in+vitro+coculture+model+to+study+the+interactions+between+bone+and+prostate+cancer+cells.">Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).</li><li>Curtin, P., Youm, H., Salih, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cancer-bone+metastasis+model+using+ex+vivo+cocultures+of+live+calvaria+bones+and+cancer+cells.">Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells.</a> Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).</li><li>Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bone+formation+using+mouse+calvarial+organ+cultures.">Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures.</a> Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).</li><li>Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+new+bone+formation+in+neonatal+calvarial+organ+cultures.">Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).</li></ol>

Qui, descriviamo il protocollo per un modello di ex vivo calvariale per valutare la formazione o il risurrezione ossea e per studiare le interazioni delle cellule tumorali con l'osso cavariale del topo. I passaggi critici di questa tecnica sono la dissezione, la cultura, l'incorporamento e l'analisi istomormetrica dei calvarias. Durante la dissezione delle calvarias, è fondamentale tagliare le emi-calvarias in un trapezio, in quanto faciliterà fortemente l'orientamento durante l'inclusione della paraffina. Qua...

L'osso è un tessuto connettivo dinamico che ha diverse funzioni, tra cui sostenere i muscoli, proteggere gli organi interni e il midollo osseo, e immagazzinare e rilasciare calcio e fattori di crescita1,2. Per mantenere la sua integrità e la corretta funzione, il tessuto osseo è continuamente sotto il processo di rimodellamento. In termini generali, un ciclo di rimodellamento osseo può essere diviso in risorsurare l'osso e la formazione ossea1. Uno squilibrio tra queste due fasi di rimodellamento osseo può portare allo sviluppo di patologie ossee. Inoltre, malattie come il cancro al seno spesso influenzano l'integrità ossea; circa il 70% dei pazienti in stadi avanzati ha o avrà metastasi ossee. Quando le cellule del cancro al seno entrano nelle ossa, influenzano il metabolismo osseo, con conseguente eccessiva riinstallazione (lesioni osteoclastiche) e/o formazione (lesioni osteoblastiche)3.
Per comprendere la biologia delle malattie ossee e sviluppare nuovi trattamenti, è necessario comprendere i meccanismi coinvolti nel rimodellamento osseo. Nella ricerca sul cancro, è essenziale studiare il processo di metastasi ossea e la sua relazione con il microambiente metastatico. Nel 1889, Stephen Paget ipotizzò che le metastasi si verificano quando c'è compatibilità tra le cellule tumorali e il tessuto bersaglio, e suggerì che il sito metastatico dipende dall'affinità del tumore per il microambiente4. Nel 1997, Mundy e Guise hanno introdotto il concetto di "circolo vizioso delle metastasi ossee" per spiegare come le cellule tumorali modificano il microambiente osseo per raggiungere la loro sopravvivenza e crescita, e come il microambiente osseo promuove la loro crescita fornendo fattori di calcio e crescita5,6,7.
Per caratterizzare i meccanismi coinvolti nel rimodellamento osseo e nella metastasi ossea e per valutare le molecole con un possibile potenziale terapeutico, è stato necessario sviluppare modelli in vitro e in vivo. Tuttavia, questi modelli presentano attualmente molte limitazioni, come la rappresentazione semplificata del microambiente osseo, e il loro costo8,9. La coltura degli espiatori ossei ex vivo ha il vantaggio di mantenere l'organizzazione tridimensionale e la diversità delle cellule ossee. Inoltre, le condizioni sperimentali possono essere controllate. I modelli espiantanti includono la coltura delle ossa metatarsale, teste femorali, calvarias, e nuclei mandibolari o trabecolari10. I vantaggi dei modelli ex vivo sono stati dimostrati in diversi studi. Nel 2009, Nordstrand e collaboratori hanno riferito l'istituzione di un modello di cocultura basato sulle interazioni tra le cellule tumorali ossee e prostata11. Inoltre, nel 2012, Curtin e collaboratori hanno riportato lo sviluppo di un modello tridimensionale utilizzando coculture ex vivo 12. Lo scopo di tali modelli ex vivo è quello di ricreare le condizioni del microambiente osseo nel modo più accurato possibile per poter caratterizzare i meccanismi coinvolti nel normale o patologico rimodellamento osseo e valutare l'efficacia di nuovi agenti terapeutici.
Il presente protocollo si basa sulle procedure pubblicate da Garrett13 e Mohammad etal. Le colture neovari chevariate di calvaria topo sono state utilizzate come modello sperimentale, in quanto conservano l'architettura tridimensionale dell'osso in fase di sviluppo e cellule ossee, comprese le cellule in tutte le fasi di differenziazione (cioè osteoblasti, osteoclasti, osteociti, cellule stromali) che portano a osteoclasti maturi e osteoblasti, nonché alla matrice minerale14. Il modello ex vivo non rappresenta totalmente il processo patologico delle malattie ossee. Tuttavia, gli effetti sul rimodellamento osseo o sull'osteolisi ossea indotta dal cancro possono essere misurati con precisione.
In breve, questo protocollo consiste nei seguenti passaggi: la dissezione dei calvarias da topi vecchi di 5-7 giorni, precoltura calvaria, applicazioni di coltura calvaria (ad esempio, coltura in presenza di insulina, cellule tumorali o mezzi condizionati, e persino agenti con potenziale terapeutico, secondo lo scopo dell'indagine), fissazione ossea e decalcificazione calvaria, elaborazione dei tessuti, analisi istologica e interpretazione dei risultati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well cell culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>15705-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovial</td>
			<td>SSI</td>
			<td>2341-S0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics-Antimycotic</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154-100GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628188</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2935-24X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal resin</td>
			<td>Richard Allen</td>
			<td>8310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (10X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebedding Cassettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z672122-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Golden</td>
			<td>26400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Workstation</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A81000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Golden</td>
			<td>60600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>JALMEK</td>
			<td>E5325-17P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>BIO-S1650-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and scissors</td>
			<td>LANCETA HG</td>
			<td>74165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides 25 x 75 mm</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris&#39;s Hematoxylin</td>
			<td>Jalmek</td>
			<td>SH025-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High profile blades</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1001259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoquinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>813150</td>
			<td>STP 120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>905200</td>
			<td>MICROM HM 355S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse food, 18% prot, 2018S</td>
			<td>Harlan</td>
			<td>T.2018S.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>OB0674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Paraplast</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Section Flotation Bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxin B</td>
			<td>Probiotek</td>
			<td>166-02072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax dispenser</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8523BX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Golden</td>
			<td>534056-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry

L'osso è un tessuto connettivo costituito da osteoblasti, osteociti e osteoclasti e una matrice extracellulare mineralizzata, che gli conferisce la sua forza e flessibilità e gli permette di svolgere le sue funzioni. L'osso è continuamente esposto a una varietà di stimoli, che in condizioni patologiche possono deregolare il rimodellamento osseo. Per studiare biologia e malattie ossee e valutare potenziali agenti terapeutici, è stato necessario sviluppare modelli in vitro e in vivo.
Questo manoscritto descrive il processo di dissezione e le condizioni di coltura dei calvarias isolati dai topi neonemici per studiare la formazione ossea e il microambiente tumorale osseo. A differenza dei modelli in vitro e in vivo, questo modello ex vivo consente la conservazione dell'ambiente tridimensionale del tessuto e della diversità cellulare dell'osso durante la coltura in condizioni definite per simulare il microambiente desiderato. Pertanto, è possibile studiare il rimodellamento osseo e i suoi meccanismi, nonché le interazioni con altri tipi di cellule, come le interazioni tra cellule tumorali e ossa.
I saggi qui riportati usano calvarias da topi BALB/C di 5-7 giorni. Le emi-calvarias ottenute sono coltivate in presenza di insulina, cellule del cancro al seno (MDA-MB-231), o mezzo condizionato dalle colture di cellule del cancro al seno. Dopo l'analisi, è stato stabilito che l'insulina ha indotto nuova formazione ossea, mentre le cellule tumorali e il loro rinnovano osseo medio condizionato. Il modello calvariale è stato utilizzato con successo nella ricerca di base e applicata per studiare lo sviluppo osseo e le malattie ossee indotte dal cancro. Nel complesso, è un'opzione eccellente per un saggio facile, informativo e a basso costo.

Per valutare la formazione ossea nel modello calvariale, abbiamo coltivato le emi-calvarias nei media con o senza 50 g/mL di insulina. Le sezioni dei tessuti sono state preparate e macchiate di H&E. In queste condizioni, l'istologia ha dimostrato che l'integrità strutturale dell'osso calvariale è stata mantenuta, consentendo l'identificazione dei suoi diversi componenti (Figura 1). Le calvarias trattate con insulina presentavano un aumento della quantità d...

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Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

La coltura ex vivo degli espianti ossei può essere uno strumento prezioso per lo studio della fisiologia ossea e la potenziale valutazione dei farmaci nel rimodellamento osseo e nelle malattie ossee. Il protocollo presentato descrive la preparazione e la cultura delle calvarias isolate dai crani dei topi neonati, nonché le sue applicazioni.

Misurare il rimodellamento osseo e ricreare il microambiente tumore-osso utilizzando la co-cultura Calvaria e l'ibitorometria

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Lo scopo di questa procedura è quello di avere un modello ex vivo per valutare il rimodellamento osseo e ricreare il microambiente tumorale-osseo utilizzando la coltura calvaria o la co-coltura con cellule tumorali. La maggior parte della tecnica calvaria è un sistema di coltura di organi che utilizza ossa di calvaria di topi neonatali per valutare il rimodellamento osseo. Si può testare il potenziale terapeutico di diverse molecole, o addirittura ricreare il microambiente osseo-tumorale quando si usano co-colture con cellule tumorali.Tutto questo in un saggio semplice e facile in breve tempo e a basso costo. Lo scopo di questa tecnica è quello di avere uno strumento per valutare la rigenerazione ossea nel microambiente osseo tumorale, utilizzando un modello ex vivo di coltura dell'organo calvariale del topo. Per prima cosa, seleziona un cucciolo di topo e posizionalo sotto il cofano.Usiamo calvaria da cuccioli di topo di cinque-sette giorni. Prendi la testa con la siringa, taglia la pelle e libera l'area del cuoio capelluto abbastanza da sezionare la calvaria. Identificare le suture del cranio, sagittale, coronale e lambdoidi.Fai un taglio dritto lungo le suture lambdoidi, a circa il livello dell'occhio. Tagliare su ciascun lato, dalle suture lambdoidi verso la sutura coronale. Con un angolo di 45, fare un altro taglio per collegare l'estremità del taglio realizzato con il taglio della fontanella anteriore.È estremamente importante definire le suture cranica, sagittale, frontale, coronale, lambdoide, per garantire la corretta inclusione tissutale e l'analisi istologico. Con punte sottili forza, rimuovere la calvaria e metterla su una copertura della piastra di Petri. Con un bisturi, fai un taglio dritto dalla fontanella posteriore lungo la sutura sagittale attraverso la sutura coronale.Si ottengono due emicalvarias. Raccogli ogni calvaria con le forcep e mettile in una nuova piastra di Petri con PBS. Per la coltura, posizionare l'emicalvaria in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti, contenente un millilitro di mezzo, e incubare per 24 ore a 37 gradi.Possiamo anche usare colture calvariali primarie per riprodurre il microambiente tumorale-osseo per il riassorbimento osseo. Per fare questo, co-coltimo le calvarias con cellule tumorali, o con mezzi condizionati da cellule tumorali. 24 ore dopo, rimuovere il supporto e sostituirlo con supporti contenenti il trattamento che si desidera testare.Se si desidera valutare le cellule tumorali e le interazioni ossee, o ricreare il microambiente tumorale-osseo, passare la calvaria a una piastra di attacco cellulare bassa, per evitare l'attaccamento delle cellule tumorali alla piastra. Tripinare le cellule tumorali, contarle e posizionarle con attenzione nella parte superiore dell'emicalvaria. È inoltre possibile utilizzare supporti condizionali provenienti da cellule tumorali e utilizzarli per incubare l'emicalvaria.Incubare per sei-sette giorni a 37 gradi, con il 5% di CO2. Il terzo giorno, cambia i media e continua a incubare. Il numero di cellule che usano nella co-coltura dipende dalla linea cellulare del cancro.È necessario, in primo luogo, ottimizzare il numero di celle necessarie per indurre una risposta in quella. Dopo la cultura, la calvaria passa attraverso un processo di fissazione, decalcificazione e paraffina incorporata. Inoltre, i tessuti sono sessati in un microtomo, macchiato e viene eseguita un'analisi istomorfometrica.L'inclusione della calvaria può essere complicata. Per assicurarsi che il tessuto sia protetto durante l'inclusione, è possibile mettere il tessuto tra le spugne o utilizzare una carta velina o altra carta assorbente prima di metterlo nella cassetta. Per la lavorazione dei tessuti, avvolgere l'emicalvaria in carta velina.Quindi, posizionarlo in una cassetta di incorporamento e fissare in buffer neutro in formalina, per 24 ore a quattro gradi. Per decalcificare la calvaria, posizionare la cassetta in un EDTA al 10% per 48 ore a quattro gradi. Elaborare le cassette tissutali con l'emicalvaria in un processore automatico dei tessuti.Seguire un normale ciclo di rotazione giornaliera, quindi, includere nella paraffina. Per la sessatura, tagliare quattro sezioni microtiche con un microtomo, montare le sezioni su vetrini al microscopio e macchiare con ematossilina, eosina. L'analisi istologia è stata utilizzata per eseguire analisi quantitative della superficie ossea e delle aree di rimodellamento osseo.Le immagini della calvaria nei sette giorni sono state analizzate utilizzando il software di imaging. Per la valutazione quantitativa, in primo luogo, definire l'area per l'analisi. Guarda nelle sezioni della telopa dove quattro X per identificare l'orientamento e le suture.Definire la sutura coronale e identificare la lunga superficie ossea su un lato, e quindi la superficie corta dall'altro. Sotto l'ingrandimento 40X, identificare la sutura coronale e spostare due o tre campi ottici lontano dalla sutura, lungo la superficie lunga. Acquisire l'immagine di quest'area per l'analisi.È possibile utilizzare il software di immagini per analizzare l'integrità strutturale dell'osso. Si può fare un'analisi istomorfometrica quantitativa per lo spessore e l'area ossea dell'emicalvaria. La corretta analisi della calvaria dipende da un buon incorporamento e da un corretto orientamento per risultati istologici coerenti.Assicurati di usare almeno tre calvaria per condizione sperimentale. Qui, possiamo vedere la struttura dell'osso. In arancione, si osserva l'osso.Possiamo anche vedere la presenza del periostio, dell'ostocita, dell'endosteo e di altre parti dell'osso. Nel nostro caso, usiamo l'insulina per aumentare il rimodellamento osseo. Rispetto a un controllo, possiamo vedere un aumento significativo dell'area ossea.Qui, possiamo vedere l'effetto della linea cellulare MDA-MB-231 sul modello calvaria. Possiamo vedere, rispetto al controllo, che la presenza di cellule tumorali induce fattori osteolitici che stimolano la distruzione ossea. Abbiamo usato il modello calvaria per misurare la rigenerazione ossea e le interazioni cellule-ossa tumorali attraverso co-colture con cellule tumorali e istologia.Convalidiamo anche i nostri dati tramite PCR quantitativa in tempo reale. Questo modello ex vivo ha molti vantaggi, come l'organizzazione tridimensionale e la diversità cellulare dell'osso sono preservati, e le condizioni sperimentali possono essere controllate. Inoltre, il modello è semplice, puoi vedere i risultati in un breve periodo di tempo ed è a basso costo.E può essere combinato con altre tecniche, come PCR quantitativa in tempo reale, microscopia e micro-TC.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Studiare gli effetti dei ligandi paracrini setosecreti dal tumore sull'attivazione dei macrofagi utilizzando la co-cultura con i supporti membrana permeabili

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analisi della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee con impianto di innesto tumorale solido nell'osso

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolamento di fluidi prossimali per studiare il microambiente tumorale dell'adenocarcinoma pancreatico

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-coltura di cellule simili a staminali di glioblastoma su neuroni modellati per studiare la migrazione e le interazioni cellulari

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Co-coltura di neuroni glutamatergici e cellule di glioma pediatrico di alto grado in dispositivi microfluidici per valutare le interazioni elettriche

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Espansione della comprensione del microambiente tumorale mediante spettrometria di massa Imaging di campioni di tessuto fissati in formalina e incorporati in paraffina

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Microdissezione laser industrializzata guidata dall'intelligenza artificiale per l'analisi proteomica microscalata del microambiente tumorale

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...