Name: measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry
Uploaded: 2020-03-14T12:00:00
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著者らは、マリオ・ノムラ、M.D.、ロドルフォ・ディアスの神学の支援、ピエリック・フルニエ博士の貴重なコメントに感謝しています。

これらのアッセイで使用されるすべてのマウスは、雄マウスと雌マウスを無差別に用いて、BALB/cマウス株から得られた。これまでの培養実験は、FVB、スイスマウス、CD-1、およびCsAマウス11、12、14,などの11,他の株を用いても行われてきた。14すべてのマウスは国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従って収容され、付録Q.動?...

<ol>
	<li>Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+biology+and+pathology.">Bone biology and pathology.</a> Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).</li><li>Clark, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).</li><li>Fournier, P. G. J., Ju&#225;rez, P., Guise, T. A., Heymann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-bone+interactions:+there+is+no+place+like+bone.">Tumor-bone interactions: there is no place like bone.</a> Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).</li><li>Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stephen+Paget+and+the+"seed+and+soil"+theory+of+metastatic+dissemination.">Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination.</a> Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).</li><li>Guise, T. 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H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bone+formation+using+mouse+calvarial+organ+cultures.">Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures.</a> Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).</li><li>Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+new+bone+formation+in+neonatal+calvarial+organ+cultures.">Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).</li></ol>

ここでは、骨形成または吸収を評価し、癌細胞とカルバリア性マウスの骨との相互作用を研究するためのカルバリア式ex vivoモデルのプロトコルについて説明する。この手法の重要なステップは、カルバリアの解剖、培養、埋め込み、および組織形態測定分析である。カルバリアの解剖中、パラフィン包含中の向きを強く促進するため、ヘミカルバリアを台形に切断することが重要です...

骨は筋肉を支え、内臓および骨髄を保護し、カルシウムおよび成長因子,1、2を貯蔵および放出することを含むいくつかの機能を有する動的結合組織1である。その完全性および適切な機能を維持するために、骨組織は連続的に改造のプロセスの下にある。一般に、骨リモデリングのサイクルは、骨吸収と骨形成1に分けることができる。骨のリモデリングのこれらの2つの段階の間の不均衡は、骨の病理の開発につながることができます。また、乳がんなどの病気は骨の完全性に影響を与えることが多い。進行期の患者の約70%以上が骨転移を有するか、または有するであろう。乳癌細胞が骨に入ると、それらは骨代謝に影響を及ぼし、過剰な吸収(破骨病変)および/または形成(骨芽細胞病変)3を生じる。
骨疾患の生物学を理解し、新しい治療法を開発するためには、骨のリモデリングに関わるメカニズムを理解する必要があります。がん研究では、骨転移過程と転移性微小環境との関係を調べるのが重要です。1889年、スティーブン・パジェトは、腫瘍細胞と標的組織との間に相溶性がある場合に転移が起こると仮定し、転移部位が微小環境4に対する腫瘍の親和性に依存することを示唆した。1997年、マンディとギーズは、腫瘍細胞が生存と成長を達成するために骨微小環境をどのように変えるか、そして骨微小環境がカルシウムおよび成長因子55、6、76,を提供することによってどのように成長を促進するかを説明する「骨転移の悪循環」という概念を導入した。
骨のリフォームや骨転移に関与するメカニズムを特徴付け、可能な治療可能性を有する分子を評価するためには、インビトロおよびインビボモデルの開発が必要であった。しかし、これらのモデルは現在、骨微小環境の簡略表示やコスト88、99など多くの制限を提示している。ex vivoの骨の培養は、骨細胞の多様性と同様に、立体的組織を維持するという利点を有する。また、実験条件も制御できる。外植モデルには、中足骨、大腿骨頭部、カルバリア、下顎または骨壁コア10の培養が含まれる。ex vivoモデルの利点は、多様な研究で実証されている。2009年、Nordstrandと共同研究者は、骨癌細胞と前立腺癌細胞11との相互作用に基づく共培養モデルの確立を報告した。また、2012年には、カーティンと共同研究者は、ex vivoのコカルチャー12を用いた立体モデルの開発を報告した。このようなex vivoモデルの目的は、正常または病理学的骨リモデリングに関与するメカニズムを特徴付け、新しい治療薬の有効性を評価することができるように、骨微小環境の条件を可能な限り正確に再現することです。
本議定書はギャレット13とモハマドらによって公表された手順に基づいている。新生児マウスカルバリア培養は、成熟した破骨細胞および骨芽細胞につながる分化のすべての段階(すなわち、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、間質細胞)の細胞を含む、発達中の骨および骨細胞の三次元アーキテクチャを保持するため、実験モデルとして使用されてきた。ex vivoモデルは、骨疾患の病理学的過程を完全に表すものではありません。しかし、骨のリモデリングや癌による骨骨の骨の骨の骨の骨の影響を正確に測定することができます。
簡単に言えば、このプロトコルは、5-7日齢マウスからのカルバリアの解剖、カルバリア前培養、カルバリア培養アプリケーション(例えば、インスリン、癌細胞または条件付け培地の存在下での培養、さらには薬剤の解剖)から構成される。治療上の可能性は、調査の目的に従って)骨固定およびカルバリア脱灰、組織処理、組織学的分析、および結果解釈。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well cell culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>15705-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovial</td>
			<td>SSI</td>
			<td>2341-S0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics-Antimycotic</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154-100GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628188</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2935-24X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal resin</td>
			<td>Richard Allen</td>
			<td>8310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (10X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebedding Cassettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z672122-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Golden</td>
			<td>26400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Workstation</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A81000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Golden</td>
			<td>60600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>JALMEK</td>
			<td>E5325-17P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>BIO-S1650-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and scissors</td>
			<td>LANCETA HG</td>
			<td>74165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides 25 x 75 mm</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris&#39;s Hematoxylin</td>
			<td>Jalmek</td>
			<td>SH025-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High profile blades</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1001259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoquinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>813150</td>
			<td>STP 120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>905200</td>
			<td>MICROM HM 355S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse food, 18% prot, 2018S</td>
			<td>Harlan</td>
			<td>T.2018S.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>OB0674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Paraplast</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Section Flotation Bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxin B</td>
			<td>Probiotek</td>
			<td>166-02072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax dispenser</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8523BX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Golden</td>
			<td>534056-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry

骨は骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、およびミネラル化された細胞外マトリックスから構成される結合組織であり、その強さと柔軟性を与え、その機能を果たすことができます。骨は様々な刺激にさらされ続け、病理学的状態では骨のリモデリングを調節緩和することができる。骨生物学や疾患を研究し、潜在的な治療薬を評価するためには、インビトロおよびインビボモデルの開発が必要であった。
本稿では、新生児マウスから分離されたカルバリアの解剖過程と培養条件について、骨形成と骨腫瘍微小環境を研究する。インビトロおよびインビボモデルとは対照的に、このex vivoモデルは、組織の3次元環境と骨の細胞多様性を維持し、所定の条件下で培養して所望の微小環境をシミュレートすることを可能にする。したがって、骨のリモデリングとそのメカニズム、ならびに癌細胞と骨の相互作用などの他の細胞型との相互作用を調べることができます。
ここで報告されたアッセイは、5-7日齢BALB/Cマウスのカルバリアを使用する。得られたヘミカルバリアは、インスリン、乳癌細胞(MDA-MB-231)、または乳癌細胞培養から調整された培地の存在下で培養される。分析後、インスリンが新しい骨形成を誘導し、癌細胞とその調整された培地が骨吸収を誘発することを確立した。このカルバリアモデルは、骨の発達やがんによる骨疾患の研究に基礎的および応用研究に成功しています。全体的に、それは容易で、有益で、低コストのアッセイのための優秀な選択である。

カルバリアモデルでの骨形成を評価するために、50μg/mLのインスリンを用いずに培地中のヘミカルバリアを培養した。組織切片を調製し、H&Eで染色した。これらの条件において、構造学は、カルバリ骨の構造的完全性が維持され、その異なる成分の同定を可能にすることを示した(図1)。インスリンで治療したカルバリアは、対照と比較して骨組?...

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Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

骨外植の元生体培養は、骨生理学の研究や骨のリモデリングや骨疾患における薬物の潜在的な評価のための貴重なツールとなり得る。提示されたプロトコルは、新生児マウスの頭蓋骨から分離されたカルヴァリアの調製および培養、ならびにその用途を記述する。

カルバリア共培養と組織病量を用いた骨リモデリングと腫瘍-骨微小環境の再現

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

この手順の目的は、骨のリモデリングを評価し、カルバリア培養または癌細胞との共培養を用いて腫瘍-骨微小環境を再現するex vivoモデルを有することである。最もカルバリアの技術は、新生児マウスのカルバリア骨を使用して骨のリモデリングを評価する臓器培養系である。多様な分子の治療可能性をテストしたり、がん細胞との共培養を行う場合は骨腫瘍微小環境を再現することもできます。そのすべては、短時間で簡単にアッセイし、低コストで。この技術の目的は、マウスのカルバリア臓器培養のex vivoモデルを用いて、癌骨微小環境における骨再生を評価するツールを有することである。まず、マウスの子犬を選択し、フードの下に置きます。私たちは、5〜7日齢のマウスの子犬からカルバリアを使用しています。注射器で頭を取り、皮膚を切断し、カルバリアを解剖するのに十分な頭皮領域をクリアします。頭蓋骨、矢状、冠状動脈、およびラムドイドの縫合糸を特定します。ラムドイド縫合糸に沿ってまっすぐにカットし、目の高さにします。両側に、子羊の縫合糸からコロナ縫合糸に向かって切る。45角度で、もう一つのカットを行い、前のフォントのカットで作られたカットの端を接続します。正しい組織包入および組織学分析を保証するために、頭蓋骨縫合糸、矢状、前頭、コロナ、ラムドイドを定義することは非常に重要です。細かい先端鉗子で、カルヴァリアを取り外し、ペトリ皿カバーの上に置きます。メスで、冠状縫合糸を通して矢状縫合に沿って後部フォンタネルからまっすぐにカットします。2つのヘミカルバリアが得られる。鉗子で各カルバリアをピックアップし、PBSと新しいペトリ皿に入れます。培養のために、1ミリリットルの培地を含む24ウェル組織培養プレートにヘミカルバリアを入れ、37度で24時間インキュベートする。また、原発性カルバリア培養を用い、骨吸収のための腫瘍-骨微小環境を再現することもできます。そのために、カルバリアをがん細胞、またはがん細胞のコンディショ条件付き培地と共培養します。24時間後、メディアを取り出し、テストしたい治療を含む培地に交換してください。がん細胞と骨の相互作用を評価したい場合、または腫瘍骨微小環境を再現したい場合は、カルバリアを低細胞付着プレートに渡し、癌細胞のプレートへの付着を避けます。がん細胞をトリプシン化し、数え、ヘミカルバリアの上部に慎重に配置します。また、がん細胞の条件付き培地を使用し、それを使用してヘミカルバリアをインキュベートすることもできます。37度で6~7日間インキュベートし、CO2は5%です。3日目に、メディアを交換し、インキュベートを続けます。共培養で使用する細胞の数は、癌細胞株に依存する。まず、応答を誘導するために必要な細胞の数を最適化する必要があります。培養後、カルバリアは固定、脱灰、パラフィン埋め込みのプロセスを通過します。また、組織をミクロトームで切り離し、染色し、組織形態測定解析を行う。カルバリアを含めることは難しい場合があります。包み込み中に組織が保護されていることを確認するには、スポンジの間に組織を置くか、ティッシュペーパーまたは他の吸収性紙を使用してカセットに入れることができます。組織処理の場合は、ヘミカルバリアをティッシュペーパーで包みます。次に、それを埋め込みカセットに入れ、ホルマリン中の中性バッファーに4度で24時間固定します。カルバリアを脱灰するには、カセットを10%EDTAに4度で48時間置きます。自動組織プロセッサでヘミカルバリアで組織カセットを処理します。規則的な日の回転サイクルに従い、次いで、パラフィンに含める。断面化のために、マイクロトームで4つのマイクロチックセクションを切断し、ガラス顕微鏡スライドにセクションを取り付け、ヘマトキシリン、エオジンで染色します。組織学分析は、骨表面および骨のリモデリング領域の定量分析を行うために使用された。7日間のカルバリアの画像をイメージングソフトウェアを用いて分析した。定量的評価の場合は、まず分析の領域を定義します。4つのXがあるテロパのセクションを見て、方向と縫合糸を特定します。コロナ縫合を定義し、片側の長い骨の表面を特定し、次に他方の短い面を特定します。40倍率の下で、コロナ縫合を特定し、長い表面に沿って縫合線から離れて2つまたは3つの光学フィールドを移動します。解析のためにこの領域の画像をキャプチャします。イメージ ソフトウェアを使用して、ボーンの構造的な整合性を分析できます。ヘミカルバリアの厚さと骨面積に関する定量的組織形態解析が可能です。正しいカルバリア解析は、一貫した組織学的結果を得るために、良好な埋め込みと適切な方向に依存します。実験条件ごとに少なくとも3つのカルバリアを使用してください。ここでは、骨の構造を見ることができます。オレンジ色では、骨が観察される。また、骨膜、オストーサイト、エンドステウム、および骨の別の部分の存在を見ることができます。私たちの場合、骨のリモデリングを増加させるためにインスリンを使用しています。コントロールと比較すると、骨領域の有意な増加を見ることができます。ここでは、MDA-MB-231細胞株がモデルカルバリアに及ぼす影響を確認できる。コントロールと比較して、がん細胞の存在が骨破壊を刺激する骨分解因子を誘導していることがわかります。カルバリアモデルを用いて、がん細胞や細胞学との共培養による骨再生とがん細胞と骨の相互作用を測定しました。定量的リアルタイム PCR でデータを検証します。このex vivoモデルは、骨の立体組織や細胞の多様性が保持され、実験条件を制御することができるような多くの利点を有する。また、モデルはシンプルで、短時間で結果を見ることができ、低コストです。定量的リアルタイム PCR、顕微鏡、マイクロ CT などの他の手法と組み合わせることができます。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

サンプルおよび測定可能な残存病変と急性骨髄性白血病の白血病幹細胞を測定するプロセス骨髄に対する包括的なプロトコル

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

それらの相互作用を研究する歯髄組織と癌細胞との共培養から間葉系幹細胞の分離

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

透過性膜支持体との共培養を用いたマクロファージ活性化に及ぼす腫瘍分泌パラクリンリガンドの効果の研究

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

固形腫瘍細胞株における側集団の解析

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

固形腫瘍移植による骨原発性骨腫瘍と骨転移のモデリング

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

膵臓腺癌の腫瘍微小環境を調べるための近位液の分離

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

パターン化ニューロン上の神経膠芽腫幹細胞の共培養による移動と細胞相互作用の研究

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

グルタミン酸ニューロンと小児の高品位グリオーマ細胞の微小流体デバイスへの共培養による電気的相互作用の評価

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織サンプルの質量分析イメージングを用いた腫瘍微小環境の理解を広げる

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

腫瘍微小環境のマイクロスケールプロテオミクス分析のための工業化された人工知能誘導レーザーマイクロダイセクション

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...