Name: measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry
Uploaded: 2020-03-14T12:00:00
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저자들은 마리오 노무라, M.D. 및 로돌포 디아즈가 역학에 도움을 준 것에 대해 감사를 표하고, 피에릭 푸르니에 박사는 논문의 품질을 향상시키기 위해 그의 귀중한 의견에 감사를 표합니다.

이러한 비약에 사용된 모든 마우스는 BALB/c 마우스 균주로부터 수득되었고, 남성과 암컷 마우스를 무차별적으로 사용하였다. 이전 배양 실험은 또한 FVB, 스위스 마우스, CD-1, 및 CsA 마우스11,,12,,14와같은 다른 균주를 사용하여 수행되었다. 모든 마우스는 건강의 국가 학회 (NIH) 지침에 따라 보관되었다, 부록 Q. 동물 과목을 포함?...

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	<li>Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+biology+and+pathology.">Bone biology and pathology.</a> Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).</li><li>Clark, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).</li><li>Fournier, P. G. J., Ju&#225;rez, P., Guise, T. A., Heymann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-bone+interactions:+there+is+no+place+like+bone.">Tumor-bone interactions: there is no place like bone.</a> Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).</li><li>Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stephen+Paget+and+the+"seed+and+soil"+theory+of+metastatic+dissemination.">Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination.</a> Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).</li><li>Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vicious+cycle+of+bone+metastases.">The vicious cycle of bone metastases.</a> Journal of Musculoskeletal &amp; Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+bone+metastasis.">Mechanisms of bone metastasis.</a> Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+to+bone:+causes,+consequences+and+therapeutic+opportunities.">Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).</li><li>Chong, S. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+bone+metastasis:+Opportunities+for+the+study+of+cancer+dormancy.">Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).</li><li>Deguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+bone+to+facilitate+measurement+of+adhesion+forces+and+super-resolution+imaging+of+osteoclasts.">In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts.</a> Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).</li><li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Nordstrand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+an+in+vitro+coculture+model+to+study+the+interactions+between+bone+and+prostate+cancer+cells.">Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).</li><li>Curtin, P., Youm, H., Salih, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cancer-bone+metastasis+model+using+ex+vivo+cocultures+of+live+calvaria+bones+and+cancer+cells.">Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells.</a> Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).</li><li>Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bone+formation+using+mouse+calvarial+organ+cultures.">Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures.</a> Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).</li><li>Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+new+bone+formation+in+neonatal+calvarial+organ+cultures.">Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).</li></ol>

여기서, 우리는 뼈 형성 또는 재흡수를 평가하고 calvarial 마우스 뼈를 가진 암세포의 상호 작용을 연구하기 위하여 calvarial ex 생체 모델을 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 기술의 중요한 단계는 칼바리아의 해부, 문화, 포함 및 조직 형성 분석입니다. 칼라핀 을 포함하는 동안 방향을 강하게 촉진하기 때문에 칼바리아를 사다리꼴로 자르는 것이 중요합니다. calvarias와 암 세포 상호 작용을 공...

뼈는 근육을 지원하고, 내부 장기와 골수를 보호하고, 칼슘과 성장 인자를 저장 및 방출하는 등 여러 기능을 가지는 동적 결합조직1,,2. 무결성과 적절한 기능을 유지하기 위해 뼈 조직은 리모델링 과정에서 지속적으로 진행됩니다. 일반적으로, 뼈 리모델링의 주기는 뼈 재흡수와 뼈 형성으로 나눌 수 있습니다1. 뼈 리모델링의 이 2단계 사이 불균형은 뼈 병리의 발달로 이끌어 낼 수 있습니다. 또한, 유방암과 같은 질병은 종종 뼈의 무결성에 영향을 미칩니다. 진보된 단계에 있는 환자의 대략 70% 이상은 뼈 전이가 있을 것입니다. 유방암 세포가 뼈에 들어가면 뼈 대사에 영향을 미치고 과도한 흡수 (파골 세포 병변) 및 / 또는 형성 (골아세포병변)3.
뼈 질환의 생물학을 이해하고 새로운 치료법을 개발하려면 뼈 리모델링과 관련된 메커니즘을 이해해야합니다. 암 연구에서, 뼈 전이 과정 및 전이성 미세 환경과의 관계를 조사하는 것이 필수적입니다. 1889년, 스티븐 파짓은 종양 세포와 표적 조직 사이에 호환성이 있을 때 전이가 발생한다고 가설하고, 전이성 부위는 미세환경4에대한 종양의 친화도에 의존한다고 제안했다. 1997년, 문디와 기즈는 종양 세포가 생존과 성장을 달성하기 위해 뼈 미세 환경을 수정하는 방법과 뼈 미세 환경이 칼슘과 성장 인자를 제공함으로써 성장을 촉진하는 방법을 설명하기 위해 "뼈 전이의 악순환"의 개념을도입했다 5,,6,,7.
뼈 리모델링 및 뼈 전이에 관여하는 메커니즘을 특성화하고 가능한 치료 잠재력을 가진 분자를 평가하기 위해 시험관 내 및 생체 내 모델을 개발할 필요가 있었습니다. 그러나, 이러한 모델은 현재 뼈 미세 환경의 단순화 된 표현과 같은 많은 제한사항을 제시하고, 그 비용8,,9. 생체내 외형의 ex vivo 배양은 골세포의 다양성뿐만 아니라 3차원 조직을 유지하는 장점이 있다. 또한, 실험 조건을 제어할 수 있다. 이식 모델은 중족골 뼈, 대퇴머리, 칼바리아, 하악골 또는 근체 또는 궤적코어(10)의배양을 포함한다. ex vivo 모델의 장점은 다양한 연구에서 입증되었습니다. 2009년, Nordstrand 및 협력자들은 뼈와 전립선암 세포 사이의 상호 작용에 기초하여 동문화 모델의 확립을 보고했다11. 또한, 2012년, 커틴과 협력자들은 생체내 코컬쳐12를이용한 3차원 모델의 개발을 보고했다. 이러한 생체내 모델의 목적은 정상 또는 병리학적 뼈 리모델링에 관여하는 메커니즘을 특성화하고 새로운 치료제의 효능을 평가할 수 있도록 가능한 한 정확하게 뼈 미세환경의 조건을 재현하는 것이다.
본 프로토콜은 Garrett13 및 Mohammad et al.14에의해 출판된 절차를 기반으로 합니다. 신생아 마우스 calvaria 배양체는 성숙한 파골세포및 파골세포로 이어지는 모든 분화 단계(즉, 골세포, 파골세포, 골혈계, 기질 세포)를 포함하여 발달 중인 뼈및 골세포의 3차원 구조를 유지하면서 실험 모델로 사용되어 왔으며, 이는 광물화된 미네랄화매트릭스뿐만아니라 1.000.00.1이다. ex vivo 모델은 뼈 질환의 병리학 적 과정을 완전히 나타내지 않습니다. 그러나, 뼈 리모델링 또는 암 유발 뼈 골용해에 미치는 영향을 정확하게 측정할 수 있습니다.
간략하게, 이 프로토콜은 다음 단계로 구성됩니다: 5-7일 된 마우스에서 calvarias의 해부, calvaria preculture, calvaria 배양 응용 프로그램 (예를 들면, 인슐린의 존재에 있는 배양, 암세포 또는 조건부 배지, 및 에이전트를 가진 조차 치료 잠재력, 조사의 목적에 따라), 뼈 고정 및 calvaria decalcification, 조직 처리, 조직 분석 및 결과 해석.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well cell culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>15705-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovial</td>
			<td>SSI</td>
			<td>2341-S0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics-Antimycotic</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154-100GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628188</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2935-24X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal resin</td>
			<td>Richard Allen</td>
			<td>8310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (10X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebedding Cassettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z672122-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Golden</td>
			<td>26400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Workstation</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A81000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Golden</td>
			<td>60600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>JALMEK</td>
			<td>E5325-17P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>BIO-S1650-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and scissors</td>
			<td>LANCETA HG</td>
			<td>74165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides 25 x 75 mm</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris&#39;s Hematoxylin</td>
			<td>Jalmek</td>
			<td>SH025-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High profile blades</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1001259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoquinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>813150</td>
			<td>STP 120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>905200</td>
			<td>MICROM HM 355S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse food, 18% prot, 2018S</td>
			<td>Harlan</td>
			<td>T.2018S.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>OB0674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Paraplast</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Section Flotation Bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxin B</td>
			<td>Probiotek</td>
			<td>166-02072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax dispenser</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8523BX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Golden</td>
			<td>534056-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry

뼈는 골세포, 골세포 및 파골세포로 구성된 결합 조직이며, 미네랄화된 세포외 매트릭스로 강도와 유연성을 제공하고 그 기능을 수행할 수 있게 합니다. 뼈는 병리학 적 조건에서 뼈 리모델링을 조절 할 수있는 다양한 자극에 지속적으로 노출됩니다. 뼈 생물학 및 질병을 연구하고 잠재적인 치료제를 평가하기 위해 시험관 내 및 생체 내 모델을 개발할 필요가 있었습니다.
이 원고는 뼈 형성 및 뼈 종양 미세 환경을 연구하기 위해 신생아 마우스로부터 분리 된 calvarias의 해부 과정 및 배양 조건을 설명합니다. 시험관 내 및 생체 내 모델과는 달리, 이 ex vivo 모델은 정의된 조건하에서 배양하는 동안 조직의 3차원 환경뿐만 아니라 뼈의 세포 다양성을 보존하여 원하는 미세 환경을 시뮬레이션할 수 있습니다. 따라서, 뼈 리모델링 및 그 메커니즘을 조사할 수 있습니다., 다른 세포 유형과의 상호 작용 뿐만 아니라, 암 세포와 뼈 사이 상호 작용 등.
여기에서 보고된 분석은 5-7 일 오래된 BALB/C 마우스에서 calvarias를 이용합니다. 수득된 헤미-칼바리아는 인슐린, 유방암 세포(MDA-MB-231) 또는 유방암 세포 배양으로부터 조절된 배지의 존재하에 배양된다. 분석 후, 인슐린이 새로운 뼈 형성을 유도하는 것으로 확립되었으며, 암세포와 이들의 조절된 배지는 뼈 흡수를 유도하였다. calvarial 모형은 뼈 발달 및 암 유도한 뼈 질병을 공부하기 위하여 기초그리고 적용한 연구에서 성공적으로 이용되었습니다. 전반적으로, 그것은 쉬운, 유익한, 그리고 저렴 한 비용 분석에 대 한 훌륭한 옵션.

칼변리 모델에서 뼈 형성을 평가하기 위해 인슐린의 50 μg/mL 유무에 관계없이 매체에서 헤미-칼바리아를 재배했습니다. 조직 절편을 H&E로 제조하고 염색하였다. 이러한 조건에서 조직학은 종아리 뼈의 구조적 무결성이 유지되어 다른 성분의 식별을 허용하는 것으로 나타났습니다(그림 1). 인슐린으로 처리된 칼바리아는 대조군과 비교하여 뼈 조직의...

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Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

뼈 이식의 ex vivo 문화 뼈 생리학 및 뼈 리모델링 및 뼈 질환에서 약물의 잠재적인 평가의 연구에 대 한 귀중 한 도구가 될 수 있습니다. 제시된 프로토콜은 신생아 마우스 두개골에서 분리 된 calvarias의 준비 및 문화뿐만 아니라 그 응용 프로그램을 설명합니다.

Calvaria 공동 배양 및 조직 학을 사용하여 뼈 리모델링 및 종양 - 뼈 미세 환경 재현

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

이 절차의 목적은 뼈 리모델링을 평가하고 암세포와 함께 칼바리아 배양 또는 공동 배양을 사용하여 종양 뼈 미세 환경을 재현하는 전 생체 모델입니다. 대부분의 calvaria 기술은 뼈 리모델링을 평가하기 위하여 신생아 마우스에서 calvaria 뼈를 사용하여 기관 배양 시스템입니다. 당신은 다양한 분자의 치료 잠재력을 테스트 할 수 있습니다, 또는 암세포와 공동 배양을 사용할 때 뼈 종양 미세 환경을 재현.이 모든 것은 짧은 시간과 저렴한 비용으로 간단하고 쉬운 분석으로. 이 기술의 목적은 마우스 calvarial 장기 배양의 전 생체 모델을 사용하여 암 뼈 미세 환경에서 뼈 재생을 평가하는 도구를 갖는 것입니다. 먼저 마우스 새끼를 선택하고 후드 아래에 놓습니다.우리는 5 일에서 7 일 된 마우스 새끼에서 calvaria를 사용합니다. 주사기로 머리를 가지고 피부를 잘라 내고 칼바리아를 해부할 만큼 두피 부위를 치웁울 수 있습니다. 두개골, 처상, 관상 및 람도이드의 봉합사를 식별합니다.눈의 정도에 따라, 람도이드 봉합사를 따라 직선 컷을 합니다. 양두엽 봉합사에서 관상 봉합사쪽으로 양쪽을 잘라냅니다. 45 각도에서 전방 폰타넬의 컷으로 만든 컷의 끝을 연결하는 또 다른 컷을 만듭니다.정확한 조직 포함 및 조직학 분석을 보장하기 위해 두개골 봉합사, 처진, 정면, 관상, 람도이드를 정의하는 것이 매우 중요합니다. 미세한 팁 집게로 칼바리아를 제거하고 페트리 접시 커버에 넣습니다. 메스를 사용하면 관상 봉합사를 통해 처진 봉합사를 따라 후방 폰타넬에서 직선으로 자른다.두 개의 단면이 얻어진다. 각 칼바리아를 집게로 집어 들고 PBS가 있는 새로운 페트리 접시에 넣습니다. 문화의 경우, 24웰 조직 배양 판에 자단을 놓고 1밀리리터의 미디어가 들어 있고 37도에서 24시간 동안 배양합니다.우리는 또한 뼈 재흡수를 위한 종양 뼈 미세 환경을 재현하기 위하여 1 차적인 calvarial 배양을 사용할 수 있습니다. 이를 위해, 우리는 암세포또는 암세포에서 조건부 된 매체와 calvarias를 공동 배양합니다. 24 시간 후, 미디어를 제거하고 테스트할 치료가 포함된 미디어로 대체하십시오.암세포와 뼈 상호 작용을 평가하거나 종양 뼈 미세 환경을 재현하고자 하는 경우, 칼바리아를 낮은 세포 부착 판으로 전달하여 암세포의 부착을 플레이트에 부착하지 않도록 한다. 암세포를 트립시화하고, 계산하고, 자단변의 꼭대기에 조심스럽게 놓습니다. 또한 암세포에서 조건부 미디어를 사용하고, hemicalvaria를 배양하는 데 사용할 수 있습니다.37도에서 6~7일 동안 인큐베이션을 하고, CO2는 5%입니다. 셋째 날에는 미디어를 변경하고 인큐베이팅을 계속합니다. 공동 배양에서 사용하는 세포의 수는 암 세포 라인에 따라 달라집니다.먼저 하나에서 반응을 유도하는 데 필요한 셀 수를 최적화해야 합니다. 문화 가 끝난 후, 칼바리아는 고정, 탈화 및 파라핀 임베디드 과정을 통과합니다. 또한, 조직은 마이크로토메, 염색, 조직형태 분석으로 단면화된다.칼바리아의 포함은 까다로울 수 있습니다. 조직이 포함 되는 동안 보호 되도록, 스폰지 사이 조직을 넣어 또는 카세트에 넣어 전에 티슈 종이 또는 다른 흡수 종이를 사용할 수 있습니다. 조직 처리를 위해, 조직 종이에 자단변이를 감쌉시다.그런 다음 포함 된 카세트에 넣고 포르말린의 중립 버퍼로 4도에서 24 시간 동안 수정하십시오. 칼바리아를 탈칼로치하려면 카세트를 4도에서 48시간 동안 10%EDTA에 넣습니다. 자동 조직 프로세서에서 자단변과 조직 카세트를 처리합니다.규칙적인 일일 회전 주기를 따라 파라핀에 포함하십시오. 단면을 위해 마이크로톤으로 4개의 미세한 부분을 자르고, 단면을 유리 현미경 슬라이드에 장착하고, 헤마톡슬린, 에오신을 사용하여 얼룩을 장착합니다. 히스토로지 분석은 뼈 표면과 뼈 리모델링 영역의 정량적 분석을 수행하기 위해 사용되었다.7일 칼바리아의 이미지는 이미징 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 정량적 평가의 경우 먼저 분석 영역을 정의합니다. 4개의 X가 방향과 봉합사를 식별하는 텔로파의 섹션을 살펴봅니다.관상 봉합사를 정의하고 한쪽의 긴 뼈 표면을 식별한 다음 다른 쪽의 짧은 표면을 식별합니다. 40X 배율 하에서 관상 봉합사를 식별하고 긴 표면을 따라 봉합사에서 두 개 또는 세 개의 광학 필드를 이동합니다. 분석을 위해 이 영역의 이미지를 캡처합니다.이미지 소프트웨어를 사용하여 골격의 구조적 무결성을 분석할 수 있습니다. 자막변의 두께 및 뼈 영역에 대한 정량적 조직학적 분석을 수행할 수 있다. 올바른 calvaria 분석은 일관된 조직학적 결과를 위해 좋은 포함과 적절한 방향에 달려 있습니다.실험 조건당 적어도 3개의 calvaria를 사용해야 합니다. 여기에서 뼈의 구조를 볼 수 있습니다. 주황색에서 뼈가 관찰됩니다.우리는 또한 골막, ostocyte, 내스트리움 및 뼈의 다른 부분의 존재를 볼 수 있습니다. 우리의 경우, 우리는 뼈 리모델링을 증가시키기 위해 인슐린을 사용합니다. 대조군과 비교하여 뼈 부위가 크게 증가하는 것을 볼 수 있습니다.여기서는 MDA-MB-231 세포주 모델 칼바리아의 효과를 확인할 수 있습니다. 우리는 암세포의 존재가 뼈 파괴를 자극하는 골성 계수를 유도한다는 것을, 대조군과 비교하는 것을 볼 수 있습니다. 우리는 암세포 및 히스토로지와의 공동 배양에 의한 뼈 재생 및 암 세포 뼈 상호 작용을 측정하기 위하여 calvaria 모형을 이용했습니다.또한 정량적 실시간 PCR을 통해 데이터를 검증합니다. 이러한 전 생체 내 모델은 3차원 조직 및 뼈의 세포 다양성이 보존되고 실험 조건을 조절할 수 있는 등 많은 장점을 가지고 있다. 게다가, 모델은 간단하고, 짧은 시간 동안 결과를 볼 수 있으며, 저렴한 비용입니다.그리고 정량적 실시간 PCR, 현미경 검사법 및 마이크로 CT와 같은 다른 기술과 결합 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

연구

암 연구학

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

펄프 조직 문화와 공동 암 세포와 그들의 상호 작용을 공부 하에서 중간 엽 줄기 세포 분리

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

고형 종양 세포주에서 측면 인구의 분석

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

원발성 뼈 종양 및 뼈에 이식된 고형 종양을 통한 뼈 전이 모델링

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

췌장 선암의 종양 미세 환경을 조사하기위한 근위액 분리

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

이동 및 세포 상호 작용을 연구하기 위해 패턴 뉴런에 교모 세포 종 줄기 와 같은 세포의 공동 배양

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

글루타미터기뉴런과 소아 고학년 신경교세포의 공동 배양을 미세유체 장치로 결합하여 전기 적 상호 작용을 평가합니다.

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

포르말린 고정 및 파라핀 임베디드 조직 샘플의 질량 분광법 이미징을 사용하여 종양 미세 환경에 대한 이해 확대

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

종양 미세환경의 미세스케일 프로테오믹 분석을 위한 산업화된 인공 지능 유도 레이저 미세 해부

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...