Name: measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry
Uploaded: 2020-03-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry at JoVE.com

Forfatterne takker Mario Nomura, MD og Rodolfo Díaz for deres hjelp med histologien, og Pierrick Fournier, Ph.D. for hans verdifulle kommentarer for å forbedre kvaliteten på papiret.

Alle mus som brukes i disse analyser ble hentet fra BALB / c mus stammer, ved hjelp av mannlige og kvinnelige mus ukritisk. Tidligere kultureksperimenter har også blitt utført ved hjelp av andre stammer, for eksempel FVB, sveitsiske mus, CD-1 og CsA mus11,,12,14. Alle mus ble plassert i henhold til National Institutes of Health (NIH) retningslinjer, Vedlegg Q. Prosedyrer som involverer dyreforsøk har blitt godkjent av Institu...

<ol>
	<li>Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+biology+and+pathology.">Bone biology and pathology.</a> Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).</li><li>Clark, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).</li><li>Fournier, P. G. J., Ju&#225;rez, P., Guise, T. A., Heymann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-bone+interactions:+there+is+no+place+like+bone.">Tumor-bone interactions: there is no place like bone.</a> Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).</li><li>Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stephen+Paget+and+the+"seed+and+soil"+theory+of+metastatic+dissemination.">Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination.</a> Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).</li><li>Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vicious+cycle+of+bone+metastases.">The vicious cycle of bone metastases.</a> Journal of Musculoskeletal &amp; Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+bone+metastasis.">Mechanisms of bone metastasis.</a> Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+to+bone:+causes,+consequences+and+therapeutic+opportunities.">Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).</li><li>Chong, S. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+bone+metastasis:+Opportunities+for+the+study+of+cancer+dormancy.">Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).</li><li>Deguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+bone+to+facilitate+measurement+of+adhesion+forces+and+super-resolution+imaging+of+osteoclasts.">In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts.</a> Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).</li><li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Nordstrand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+an+in+vitro+coculture+model+to+study+the+interactions+between+bone+and+prostate+cancer+cells.">Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).</li><li>Curtin, P., Youm, H., Salih, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cancer-bone+metastasis+model+using+ex+vivo+cocultures+of+live+calvaria+bones+and+cancer+cells.">Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells.</a> Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).</li><li>Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bone+formation+using+mouse+calvarial+organ+cultures.">Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures.</a> Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).</li><li>Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+new+bone+formation+in+neonatal+calvarial+organ+cultures.">Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).</li></ol>

Her beskriver vi protokollen for en calvarial ex vivo-modell for å evaluere beindannelse eller resorpsjon og for å studere interaksjoner mellom kreftceller med calvarial musebein. De kritiske trinnene i denne teknikken er disseksjon, kultur, innebygging og histomorfometrisk analyse av calvarias. Under disseksjon av calvarias er det avgjørende å kutte hemi-calvarias i en trapes, da det sterkt vil lette orienteringen under parafininkluderingen. Når du studerer kreftcelleinteraksjoner med calvarias, er det vik...

Bone er et dynamisk bindevev som har flere funksjoner, inkludert å støtte musklene, beskytte indre organer og benmarg, og lagre og frigjøre kalsium- og vekstfaktorer1,2. For å opprettholde sin integritet og riktig funksjon, er beinvev kontinuerlig under prosessen med ombygging. Generelt sett kan en syklus av beinremodeling deles inn i beinresorpsjon og bendannelse1. En ubalanse mellom disse to fasene av beinremodeling kan føre til utvikling av beinpatologier. Også sykdommer som brystkreft påvirker ofte beinintegritet; omtrent 70 % av pasientene i avanserte stadier har eller vil ha beinmetastaser. Når brystkreftceller kommer inn i bein, påvirker de beinmetabolismen, noe som resulterer i overdreven resorpsjon (osteoklastiske lesjoner) og / eller dannelse (osteoblastiske lesjoner)3.
For å forstå biologien til beinsykdommer og utvikle nye behandlinger, er det nødvendig å forstå mekanismene som er involvert i beinremodellering. I kreftforskning er det viktig å undersøke beinmetastaseprosessen og dens forhold til det metastatiske mikromiljøet. I 1889, Stephen Paget hypotetisk at metastaser oppstår når det er kompatibilitet mellom tumorceller og målet vev, og foreslo at metastatisk området avhenger av affiniteten av svulsten for mikromiljøet4. I 1997 introduserte Mundy og Guise begrepet "ond syklus av beinmetastaser" for å forklare hvordan tumorceller endrer beinmikromiljøet for å oppnå overlevelse og vekst, og hvordan beinmikromiljøet fremmer veksten ved å gi kalsium- og vekstfaktorer5,6,7.
For å karakterisere mekanismene som er involvert i beinremodellering og beinmetastase og for å evaluere molekyler med mulig terapeutisk potensial, har det vært nødvendig å utvikle in vitro og in vivo-modeller. Disse modellene presenterer imidlertid for tiden mange begrensninger, for eksempel forenklet representasjon av beinmikromiljøet, og deres kostnad8,9. Kulturen av bein ex planter ex vivo har fordelen av å opprettholde den tredimensjonale organisasjonen samt mangfoldet av beinceller. I tillegg kan eksperimentelle forhold kontrolleres. Explant-modellene inkluderer kulturen av metatarsal bein, lårben, calvarias, og mandibulær eller trabecular kjerner10. Fordelene med ex vivo-modellene har blitt demonstrert i ulike studier. I 2009 rapporterte Nordstrand og samarbeidspartnere etableringen av en kokulturmodell basert på samspillet mellom ben- og prostatakreftceller11. Også i 2012 rapporterte Curtin og samarbeidspartnere utviklingen av en tredimensjonal modell ved hjelp av ex vivo cocultures12. Formålet med slike ex vivo-modeller er å gjenskape tilstandene i beinmikromiljøet så nøyaktig som mulig for å kunne karakterisere mekanismene som er involvert i normal eller patologisk beinremodellering og evaluere effekten av nye terapeutiske midler.
Den nåværende protokollen er basert på prosedyrene publisert av Garrett13 og Mohammad et al.14. Neonatal mus calvaria kulturer har blitt brukt som en eksperimentell modell, som de beholder tredimensjonal arkitektur av beinet under utvikling og bein celler, inkludert celler i alle stadier av differensiering (dvs. osteoblaster, osteoklaster, osteocytter, stromal celler) som fører til modne osteoklaster og osteoblaster, samt mineralisert matrise14. Ex vivo-modellen representerer ikke den patologiske prosessen med beinsykdommer helt. Effekter på beinremodellering eller kreftindusert beinosteokse kan imidlertid måles nøyaktig.
Kort sagt består denne protokollen av følgende trinn: disseksjon av calvarias fra 5-7 dagers gamle mus, calvaria preculture, calvaria kultur applikasjoner (f.eks kultur i nærvær av insulin, kreftceller eller betinget medium, og til og med midler med terapeutisk potensial, i henhold til målet med undersøkelsen), bein fiksering og calvaria avkalkning, vevbehandling, histologisk analyse, og resultattolkning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well cell culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>15705-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovial</td>
			<td>SSI</td>
			<td>2341-S0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics-Antimycotic</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154-100GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628188</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2935-24X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal resin</td>
			<td>Richard Allen</td>
			<td>8310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (10X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebedding Cassettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z672122-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Golden</td>
			<td>26400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Workstation</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A81000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Golden</td>
			<td>60600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>JALMEK</td>
			<td>E5325-17P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>BIO-S1650-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and scissors</td>
			<td>LANCETA HG</td>
			<td>74165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides 25 x 75 mm</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris&#39;s Hematoxylin</td>
			<td>Jalmek</td>
			<td>SH025-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High profile blades</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1001259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoquinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>813150</td>
			<td>STP 120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>905200</td>
			<td>MICROM HM 355S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse food, 18% prot, 2018S</td>
			<td>Harlan</td>
			<td>T.2018S.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>OB0674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Paraplast</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Section Flotation Bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxin B</td>
			<td>Probiotek</td>
			<td>166-02072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax dispenser</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8523BX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Golden</td>
			<td>534056-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry

Bone er et bindevev som består av osteoblaster, osteocytter og osteoklaster og en mineralisert ekstracellulær matrise, noe som gir den sin styrke og fleksibilitet og gjør det mulig å oppfylle sine funksjoner. Bein er kontinuerlig utsatt for en rekke stimuli, som under patologiske forhold kan deregulere beinremodellering. For å studere beinbiologi og sykdommer og evaluere potensielle terapeutiske midler, har det vært nødvendig å utvikle in vitro- og in vivo-modeller.
Dette manuskriptet beskriver disseksjonsprosessen og kulturforholdene til calvariaer isolert fra nyfødte mus for å studere beindannelse og mikromiljøet av beinsvulsten. I motsetning til in vitro- og in vivo-modeller, tillater denne ex vivo-modellen bevaring av det tredimensjonale miljøet i vevet, samt det cellulære mangfoldet av beinet mens det er under definerte forhold for å simulere ønsket mikromiljø. Derfor er det mulig å undersøke beinremodeling og dets mekanismer, samt interaksjoner med andre celletyper, for eksempel interaksjoner mellom kreftceller og bein.
Analysene som er rapportert her, bruker calvarias fra 5-7 dager gamle BALB/C-mus. De hemi-calvarias oppnådd er kultivert i nærvær av insulin, brystkreftceller (MDA-MB-231), eller betinget medium fra brystkreft celle kulturer. Etter analyse ble det fastslått at insulin induserte ny beindannelse, mens kreftceller og deres betingede medium induserte beinresorpsjon. Den kaloribaserte modellen har blitt brukt i grunnleggende og anvendt forskning for å studere beinutvikling og kreftinduserte beinsykdommer. Samlet sett er det et utmerket alternativ for en enkel, informativ og rimelig analyse.

For å evaluere beindannelse i kalorimodellen dyrket vi hemi-calvarias i media med eller uten 50 μg/ml insulin. Vevsseksjoner ble tilberedt og farget med H&E. Under disse forholdene viste histologien at den strukturelle integriteten til calvarialbenet ble opprettholdt, slik at identifiseringen av de ulike komponentene (figur 1). Calvarias behandlet med insulin ga en økning i mengden beinvev sammenlignet med kontrollen (figur 2<...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry at JoVE.com

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Ex vivo kulturen av bein planter kan være et verdifullt verktøy for studiet av bein fysiologi og den potensielle evalueringen av legemidler i bein remodeling og bein sykdommer. Den presenterte protokollen beskriver forberedelsen og kulturen til calvarias isolert fra nyfødte mus hodeskaller, samt dens applikasjoner.

Måle beinremodellering og gjenskape tumor-bone mikromiljøet ved hjelp av Calvaria co-kultur og histomorfometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Formålet med denne prosedyren er å ha en ex vivo modell for å evaluere bein remodeling og gjenskape tumor-bein mikromiljø ved hjelp av calvaria kultur eller co-kultur med kreftceller. De fleste calvaria teknikk er et organ kultursystem ved hjelp av calvaria bein fra neonatal mus for å evaluere bein remodeling. Du kan teste det terapeutiske potensialet til ulike molekyler, eller til og med gjenskape mikromiljøet for beinsvulsten når du bruker samkulturer med kreftceller.Alt dette på en enkel og enkel analyse på kort tid og en lav pris. Målet med denne teknikken er å ha et verktøy for å evaluere beinregenerering i kreftbenmikromiljøet, ved hjelp av en ex vivo modell av muskalvarial organkultur. Først velger du en musevalp og plasserer den under panseret.Vi bruker calvaria fra fem til syv dager gamle musevalper. Ta hodet med sprøyten, kutt huden og tøm hodebunnsområdet nok for dissekere calvaria. Identifiser suturer av skallen, sagittal, koronar og lambdoider.Lag et rett kutt langs lambdoid suturer, til omtrent nivået av øyet. Klipp på hver side, fra lambdoid suturer mot koronal sutur. I 45 vinkel, gjør et annet kutt for å koble enden av kuttet laget med kutt av fremre fontanel.Det er ekstremt viktig å definere skallen suturer, sagittal, frontal, koronar, lambdoid, for å garantere riktig vev inkludering og histologi analyse. Med fine tips tang, fjern calvaria, og legg den på en Petri skåldeksel. Med en skalpell, gjør et rett kutt fra bakre fontanel langs sagittal sutur gjennom koronar sutur.To hemicalvarias er oppnådd. Plukk hver calvaria opp med tang, og legg dem i en ny petriskål med PBS. For kultur, plasser hemicalvaria i en 24-brønns vevskulturplate, som inneholder en milliliter media, og inkuber i 24 timer ved 37 grader.Vi kan også bruke primære calvarial kulturer for å reprodusere tumor-bein mikromiljø for bein resorpsjon. For å gjøre det, samarbeider vi med kreftceller, eller med bevisste medier fra kreftceller. 24 timer senere, fjern mediet og erstatt det med medier som inneholder behandlingen du ønsker å teste.Hvis du ønsker å evaluere kreftceller og bein interaksjoner, eller gjenskape tumor-bein mikromiljø, passere calvaria til en lav cellulær vedlegg plate, for å unngå vedlegg av kreftcellene til platen. Prøv å bruke kreftcellene, telle dem og legg dem forsiktig på toppen av hemicalvaria. Du kan også bruke betingede medier fra kreftceller, og bruke den til å inkubere hemicalvaria.Inkuber i seks til syv dager ved 37 grader, med fem prosent CO2. På den tredje dagen, endre media og fortsette å inkubere. Antall celler som bruker i co-kulturen avhenger av kreftcellulær linje.Du trenger først å optimalisere antall celler som det er nødvendig for å indusere et svar i den ene. Etter kulturen passerer calvaria gjennom en prosess med fiksering, dekalsifisering og parafin-innebygd. Videre er vevet seksjonert i en mikrotom, farget, og histomorphometrisk analyse utføres.Inkluderingen av calvaria kan være vanskelig. For å sikre at vevet er beskyttet under inkluderingen, kan du sette vevet mellom svamper eller bruke et vevpapir eller annet absorberende papir før du legger det i kassetten. For vevsbehandling, pakk hemicalvaria i silkepapir.Deretter plasserer du den i en innbyggingskassett, og fikser i nøytral buffer i formalin, i 24 timer ved fire grader. For å avkalne calvaria, plasser kassetten i en 10% EDTA i 48 timer ved fire grader. Behandle vevskassettene med hemicalvaria i en automatisk vevsprosessor.Følg en vanlig dag rotasjonssyklus, deretter, inkludert i parafin. For snitting, kutt fire mikrotiske seksjoner med en mikrotom, monter seksjonene på glassmikroskopsklier og flekk med hematoksylin, eosin. Histologianalyse ble brukt til å utføre kvantitativ analyse av beinoverflaten og beinremodelingsområdene.Bildene av calvaria på de syv dagene ble analysert ved hjelp av bildeprogramvaren. For kvantitativ vurdering definerer du først området for analysen. Se i seksjonene på telopa hvor fire X for å identifisere orientering og suturer.Definer koronar suturen, og identifiser den lange beinoverflaten på den ene siden, og deretter den korte overflaten på den andre. Under 40X forstørrelse, identifisere koronal sutur og flytte to eller tre optiske felt bort fra suturen, langs den lange overflaten. Ta bildet av dette området for analyse.Du kan bruke bildeprogramvare til å analysere den strukturelle integriteten til beinet. Kvantitativ histomorfmetrisk analyse for tykkelsen og beinområdet til hemicalvaria kan gjøres. Den riktige calvaria analysen avhenger av en god innebygging og riktig orientering for konsistente histologiske resultater.Pass på å bruke minst tre calvaria per eksperimentell tilstand. Her kan vi se strukturen av beinet. I oransje observeres beinet.Vi kan også se tilstedeværelsen av periosteum, ostocyte, endosteum og en annen del av beinet. I vårt tilfelle bruker vi insulin for å øke benremodeling. Sammenlignet med en kontroll, kan vi se en betydelig økning i beinområdet.Her kan vi se effekten av MDA-MB-231 cellelinje på modell calvaria. Vi kan se, sammenlignet med kontrollen, at tilstedeværelsen av kreftceller induserer osteolytiske faktorer som stimulerer beinødeleggelse. Vi brukte calvaria modell for å måle bein regenerering og kreft celle-bein interaksjoner av co-kulturer med kreftcelle og histologi.Vi validerer også dataene våre ved å kvantitativ pcr i sanntid. Denne ex vivo modellen har mange fordeler, som den tredimensjonale organisasjonen og det cellulære mangfoldet av beinet er bevart, og de eksperimentelle forholdene kan kontrolleres. Dessuten er modellen enkel, du kan se resultater på kort tid, og det er rimelig.Og det kan kombineres med andre teknikker, som kvantitativ sanntids PCR, mikroskopi og mikro-CT.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattende protokoll for å prøve og prosessen benmarg for å måle målbare gjenværende sykdom og Leukemic stamceller i akutt myelogen leukemi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal stamceller isolert fra cellulose vev og co kultur kreftceller å studere deres samhandling

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Studere effekter av tumor-utskilt paracrine ligander på macrophage aktivisering bruker co-kultur med gjennomtrengelig membran støtter

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse av sidepopulasjon i faste tumorcellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modellering av primære beintumorer og benmetastase med implantasjon av solid tumortransplantat i bein

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolering av proksimale væsker for å undersøke tumormikromiljøet i bukspyttkjerteladenokarsinom

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Samkultur av Glioblastoma stamceller på mønstrede nevroner for å studere migrasjon og cellulære interaksjoner

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Samkultur av glutamatergeiske nevroner og pediatriske gliomaceller av høy kvalitet til mikrofluidiske enheter for å vurdere elektriske interaksjoner

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Utvide forståelsen av tumormikromiljøet ved hjelp av massespektrometriavbildning av formalinfikserte og parafin-innebygde vevsprøver

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Industrialisert, kunstig intelligens-guidet lasermikrodesisseksjon for mikroskalert proteomisk analyse av tumormikromiljøet

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...