Name: measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry
Uploaded: 2020-03-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry at JoVE.com

Författarna tackar Mario Nomura, MD och Rodolfo Díaz för deras hjälp med histologi, och Pierrick Fournier, Ph.D. för hans värdefulla kommentarer för att förbättra kvaliteten på papperet.

Alla möss som används i dessa analyser erhölls från BALB/c möss stammar, med hjälp av manliga och kvinnliga möss urskillningslöst. Tidigare kulturexperiment har också utförts med andra stammar, såsom FVB, schweiziska möss, CD-1 och CsA möss11,12,14. Alla möss inhysts enligt National Institutes of Health (NIH) riktlinjer, bilaga Q. Förfaranden med djurämnen har godkänts av institutionella djur Care and Use Commit...

<ol>
	<li>Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+biology+and+pathology.">Bone biology and pathology.</a> Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).</li><li>Clark, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).</li><li>Fournier, P. G. J., Ju&#225;rez, P., Guise, T. A., Heymann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-bone+interactions:+there+is+no+place+like+bone.">Tumor-bone interactions: there is no place like bone.</a> Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).</li><li>Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stephen+Paget+and+the+"seed+and+soil"+theory+of+metastatic+dissemination.">Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination.</a> Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).</li><li>Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vicious+cycle+of+bone+metastases.">The vicious cycle of bone metastases.</a> Journal of Musculoskeletal &amp; Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+bone+metastasis.">Mechanisms of bone metastasis.</a> Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+to+bone:+causes,+consequences+and+therapeutic+opportunities.">Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).</li><li>Chong, S. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+bone+metastasis:+Opportunities+for+the+study+of+cancer+dormancy.">Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).</li><li>Deguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+bone+to+facilitate+measurement+of+adhesion+forces+and+super-resolution+imaging+of+osteoclasts.">In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts.</a> Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).</li><li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Nordstrand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+an+in+vitro+coculture+model+to+study+the+interactions+between+bone+and+prostate+cancer+cells.">Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).</li><li>Curtin, P., Youm, H., Salih, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cancer-bone+metastasis+model+using+ex+vivo+cocultures+of+live+calvaria+bones+and+cancer+cells.">Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells.</a> Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).</li><li>Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bone+formation+using+mouse+calvarial+organ+cultures.">Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures.</a> Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).</li><li>Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+new+bone+formation+in+neonatal+calvarial+organ+cultures.">Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).</li></ol>

Här beskriver vi protokollet för en calvarial ex vivo modell för att utvärdera benbildning eller resorption och att studera interaktioner av cancerceller med calvarial mus ben. De kritiska stegen i denna teknik är dissekering, kultur, inbäddning och histomorphommetrical analys av calvarias. Under dissekeringen av calvarias, är det viktigt att skära hemi-calvarias i en trapetsoid, eftersom det kommer starkt att underlätta orienteringen under paraffin integration. När du studerar interaktioner cancercell...

Ben är en dynamisk bindväv som har flera funktioner, inklusive stödja musklerna, skydda de inre organen och benmärgen, och lagra och släppa kalcium och tillväxtfaktorer1,2. För att bibehålla sin integritet och korrekta funktion är benvävnaden kontinuerligt under processen att omforma. I allmänna ordalag kan en cykel av ben ombyggnad delas in i benresorption och benbildning1. En obalans mellan dessa två faser av ben ombyggnad kan leda till utveckling av benpatologier. Också, sjukdomar som bröstcancer påverkar ofta ben integritet; cirka mer än 70% av patienterna i avancerade stadier har eller kommer att ha benmetastaser. När bröstcancerceller kommer in i benen påverkar de benmetabolismen, vilket resulterar i överdriven resorption (osteoklastiska lesioner) och/eller bildning (osteoblastiska lesioner)3.
För att förstå skelettsjukdomarnas biologi och utveckla nya behandlingar är det nödvändigt att förstå de mekanismer som är involverade i benombyggnad. Inom cancerforskningen är det viktigt att undersöka benmetastaseringsprocessen och dess relation till den metastaserande mikromiljön. I 1889, Stephen Paget hypotesen att metastaser uppstår när det finns kompatibilitet mellan tumörcellerna och målvävnaden, och föreslog att den ögonbevarande platsen beror på affiniteten av tumören för mikromiljön4. År 1997 introducerade Mundy och Guise begreppet "ond cirkel av benmetastaser" för att förklara hur tumörceller ändra benmikromiljön för att uppnå sin överlevnad och tillväxt, och hur benmikromiljön främjar deras tillväxt genom att tillhandahålla kalcium- och tillväxtfaktorer5,6,7.
För att karakterisera de mekanismer som är involverade i benremodeling och benmetastasering och att utvärdera molekyler med möjlig terapeutisk potential, har det varit nödvändigt att utveckla in vitro- och in vivo-modeller. Dessa modeller har dock för närvarande många begränsningar, såsom den förenklade representationen av benmikromiljön, och deras kostnad8,9. Kulturen av ben explants ex vivo har fördelen av att upprätthålla den tredimensionella organisationen samt mångfalden av benceller. Dessutom kan experimentella förhållanden kontrolleras. Den explant modeller inkluderar kultur av mellanfot ben, femorala huvuden, calvarias, och mandibular eller trabecular kärnor10. Fördelarna med ex vivo-modellerna har visats i olika studier. Under 2009 rapporterade Nordstrand och samarbetspartners att det upprättades en samkulturmodell baserad på samspelet mellan ben- och prostatacancerceller11. Även i 2012, Curtin och medarbetare rapporterade utvecklingen av en tredimensionell modell med ex vivo cocultures12. Syftet med sådana ex vivo-modeller är att återskapa villkoren för benmikromiljön så exakt som möjligt för att kunna karakterisera de mekanismer som är involverade i normal eller patologisk benombyggnad och utvärdera effekten av nya terapeutiska medel.
Detta protokoll bygger på de förfaranden som offentliggjorts av Garrett13 och Mohammad et al.14. Neonatal mus calvaria kulturer har använts som en experimentell modell, eftersom de behåller den tredimensionella arkitekturen i benet under utveckling och benceller, inklusive celler i alla stadier av differentiering (dvs osteoblaster, osteoklaster, osteocyter, stromalceller) som leder till mogna osteoklaster och osteoblaster, samt den mineraliseradematrisen 14. Ex vivo-modellen representerar inte den patologiska processen av bensjukdomar helt. Emellertid, effekter på ben remodeling eller cancer-inducerad ben osteolys kan mätas noggrant.
Kortfattat består detta protokoll av följande steg: dissekering av calvarias från 5-7 dagar gamla möss, calvaria förkultur, calvaria kultur applikationer (t.ex. kultur i närvaro av insulin, cancerceller eller konditionerade medium, och även medel med terapeutisk potential, enligt syftet med undersökningen), benfixering och calvaria avkalkning, vävnadsbearbetning, histologisk analys och resultattolkning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well cell culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>15705-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovial</td>
			<td>SSI</td>
			<td>2341-S0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics-Antimycotic</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154-100GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628188</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2935-24X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal resin</td>
			<td>Richard Allen</td>
			<td>8310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (10X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebedding Cassettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z672122-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Golden</td>
			<td>26400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Workstation</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A81000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Golden</td>
			<td>60600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>JALMEK</td>
			<td>E5325-17P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>BIO-S1650-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and scissors</td>
			<td>LANCETA HG</td>
			<td>74165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides 25 x 75 mm</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris&#39;s Hematoxylin</td>
			<td>Jalmek</td>
			<td>SH025-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High profile blades</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1001259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoquinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>813150</td>
			<td>STP 120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>905200</td>
			<td>MICROM HM 355S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse food, 18% prot, 2018S</td>
			<td>Harlan</td>
			<td>T.2018S.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>OB0674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Paraplast</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Section Flotation Bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxin B</td>
			<td>Probiotek</td>
			<td>166-02072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax dispenser</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8523BX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Golden</td>
			<td>534056-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry

Ben är en bindväv som består av osteoblaster, osteocyter och osteoklaster och en mineraliserad extracellulär matris, vilket ger den dess styrka och flexibilitet och gör det möjligt att uppfylla sina funktioner. Ben utsätts kontinuerligt för en mängd olika stimuli, som under patologiska förhållanden kan avreglera benombyggnad. För att studera benbiologi och sjukdomar och utvärdera potentiella terapeutiska medel har det varit nödvändigt att utveckla in vitro- och in vivo-modeller.
Detta manuskript beskriver dissekeringsprocessen och kulturförhållandena hos calvarias isolerade från neonatalmöss för att studera benbildning och bentumörmikromiljön. I motsats till in vitro- och in vivo-modeller möjliggör denna ex vivo-modell bevarande av vävnadens tredimensionella miljö samt benets cellulära mångfald medan den underdefinierade förhållanden mognar för att simulera önskad mikromiljö. Därför är det möjligt att undersöka benombyggnad och dess mekanismer, samt interaktioner med andra celltyper, såsom interaktioner mellan cancerceller och ben.
De analyser som rapporteras här använder calvarias från 5-7 dagar gamla BALB / C möss. Den hemi-calvarias erhålls odlas i närvaro av insulin, bröstcancerceller (MDA-MB-231), eller konditionerat medium från bröstcancer cellkulturer. Efter analys fastställdes det att insulin inducerade ny benbildning, medan cancerceller och deras konditionerade medium inducerad ben resorption. Calvarial modellen har framgångsrikt använts i grundläggande och tillämpad forskning för att studera benutveckling och cancer-inducerad bensjukdomar. Sammantaget är det ett utmärkt alternativ för en enkel, informativ och låg kostnad analys.

För att utvärdera benbildning i calvarialmodellen odlade vi hemi-calvarias i media med eller utan 50 μg/ml insulin. Vävnadssektioner na har förberetts och färgats med H&E. Under dessa förhållanden visade histologiatt den strukturella integriteten hos calvarialbenet bibehölls, vilket gjorde det möjligt att identifiera dess olika komponenter (figur 1). De calvarior som behandlades med insulin gav en ökning av mängden benvävnad jämfört med kontrol...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry at JoVE.com

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Ex vivo-kulturen av benexplantor kan vara ett värdefullt verktyg för studier av benfysiologi och den potentiella utvärderingen av läkemedel vid benombyggnad och bensjukdomar. Det presenterade protokollet beskriver beredningen och kulturen av calvarias isolerade från nyfödda möss skallar, liksom dess tillämpningar.

Mätning av benremodeling och återskapa tumör-ben mikromiljö med Calvaria Co-kultur och Histomorphometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Syftet med detta förfarande är att ha en ex vivo modell för att utvärdera ben remodeling och återskapa tumör-ben mikromiljö med hjälp av calvaria kultur eller co-kultur med cancerceller. De flesta calvaria teknik är ett organ kultur system med hjälp av calvaria ben från neonatal möss att utvärdera ben remodeling. Du kan testa den terapeutiska potentialen hos olika molekyler, eller till och med återskapa ben-tumörmikromiljö när du använder samkulturer med cancerceller.Allt detta på ett enkelt och lätt analys på kort tid och en låg kostnad. Syftet med denna teknik är att ha ett verktyg för att utvärdera benregenerering i cancerbenets mikromiljö, med hjälp av en ex vivo-modell av muskalarial orgelkultur. Först väljer du en musvalp och placerar den under huven.Vi använder calvaria från fem till sju dagar gamla musungar. Ta huvudet med sprutan, skär huden, och rensa hårbotten området tillräckligt för dissekera calvaria. Identifiera sytorna av skallen, sagittal, koronal, och lambdoids.Gör en göra en rak skärning längs lambdoid suturer, till ungefär nivån på ögat. Skär på varje sida, från lambdoid suturer mot korona suturen. Vid 45 vinkel, gör en annan klippa för att ansluta slutet av snittet görs med snittet av den främre fontanel.det är oerhört viktigt att definiera skallen suturer, sagittal, frontal, korona, lambdoid, att garantera korrekt vävnad integration och histologi analys. Med fina tips tyns, ta bort calvaria, och lägg den på en Petri-skålen täcka. Med en skalpell, gör ett rakt snitt från den bakre fontanel längs sagittal sutur genom korona suturen.Två hemicalvarias erhålls. Plocka varje calvaria upp med tärnor, och placera dem i en ny Petriskål med PBS. För kultur, placera hemicalvaria i en 24-brunn vävnad kultur tallrik, som innehåller en milliliter media, och inkubera i 24 timmar vid 37 grader.Vi kan också använda primära calvarial kulturer att återge tumör-ben mikromiljö för benresorption. För att göra det samkulturar vi calvarias med cancerceller, eller med konditionerade medier från cancerceller. 24 timmar senare, ta bort media och ersätta det med media som innehåller den behandling som du skulle vilja testa.Om du vill utvärdera cancerceller och ben interaktioner, eller återskapa tumör-ben mikromiljö, passera calvaria till en låg cellulär fästplatta, för att undvika fastsättning av cancercellerna till plattan. Trypsinize cancercellerna, räkna dem, och placera dem försiktigt på toppen av hemicalvaria. Du kan också använda villkorsmedia från cancerceller, och använda den för att inkubera hemicalvaria.Inkubera i sex till sju dagar vid 37 grader, med fem procent CO2. På den tredje dagen, ändra media och fortsätta ruva. Antalet celler som använder i samkulturen beror på cancer celllinjen.Du behöver först för att optimera antalet celler som det behövs för att framkalla ett svar i den. Efter kulturen passerar calvariaen genom en process av fixering, dekalcifiering och paraffininbäddad. Vidare är vävnaderna avsnitt i en mikrotom, färgas, och histomorphometric analys utförs.Införandet av calvaria kan vara knepigt. För att försäkra dig om att vävnaden är skyddad under inklusionen kan du lägga vävnaden mellan svampar eller använda ett mjukpapper eller annat absorberande papper innan du lägger den i kassetten. För mjukpappersbearbetning, linda hemicalvaria i mjukpapper.Placera den sedan i en inbäddningskassett, och fixera i neutral buffert i formalin, i 24 timmar vid fyra grader. För att avkalka calvaria, placera kassetten i en 10%EDTA i 48 timmar vid fyra grader. Bearbeta vävnadskassetterna med hemicalvaria i en automatisk vävnadsprocessor.Följ en vanlig dag rotation cykel, sedan, inkludera i paraffin. För snittning, skär fyra mikrotiska sektioner med en mikrotom, montera sektionerna på glasmikroskop diabilder, och fläck med hematoxylin, eosin. Histologi analys användes för att utföra kvantitativ analys av ben ytan och ben ombyggnad områden.Bilderna av calvaria på de sju dagarna analyserades med hjälp av bildhanteringsprogram. För kvantitativ bedömning, först, definiera området för analysen. Titta i avsnitten på telopa där fyra X för att identifiera orienteringen och suturerna.Definiera koronasuturen, och identifiera den långa benytan på ena sidan, och sedan den korta ytan på den andra. Under 40X-förstoringen ska du identifiera koronasuturen och flytta två eller tre optiska fält bort från suturen, längs den långa ytan. Fånga bilden av detta område för analysera.Du kan använda bilder programvara för att analysera den strukturella integriteten av benet. Kvantitativa histomorphometric analys för tjockleken och benområdet av hemicalvaria kan göras. Den korrekta calvaria analysen beror på en bra inbäddning och korrekt orientering för konsekvent histologiska resultat.Var noga med att använda minst tre calvaria per experimentellt tillstånd. Här kan vi se benets struktur. I orange observeras benet.Vi kan också se närvaron av benhinnan, ostocyte, endosteum, och en annan delar av benet. I vårt fall använder vi insulin för att öka ben ombyggnad. Jämfört med en kontroll kan vi se en betydande ökning av benområdet.Här kan vi se effekten av MDA-MB-231 cellinje på modell calvaria. Vi kan se, jämfört med kontrollen, att förekomsten av cancerceller inducerar osteolytiska faktorer som stimulerar benförstörelse. Vi använde calvaria modell för att mäta ben förnyelse och cancer cell-ben interaktioner av samkulturer med cancer cell och histologi.Vi validerar också våra data genom kvantitativ realtids-PCR. Denna ex vivo modell har många fördel, som den tredimensionella organisationen och den cellulära mångfalden av benet bevaras, och de experimentella förhållandena kan kontrolleras. Förutom, modellen är enkel, kan du se resultat på kort tid, och det är låg kostnad.Och det kan kombineras med andra tekniker, som kvantitativa realtid PCR, mikroskopi, och mikro-CT.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattande protokoll till prov och processen benmärg för att mäta mätbara kvarvarande sjukdom och leukemiska stamceller i akut myeloisk leukemi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymala stamceller isolering från massa vävnad och samtidig kultur med cancerceller för att studera deras interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Studera effekterna av Tumörutsöndras Paracrine ligander på Makrofagaktivering med hjälp av co-kultur med permeabla membran stöder

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analys av sidopopulation i solida tumör cellinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modellering av primära bentumörer och benmetastaser med solid tumörtransplantatimplantation i ben

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolering av proximala vätskor för att undersöka tumörmikromiljön i bukspottskörtelns adenokarcinom

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Samkultur av Glioblastoma stamliknande celler på mönstrade nervceller för att studera migration och cellulära interaktioner

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Samkultur av glutamaterga nervceller och pediatriska högkvalitativa gliomceller till mikrofluidiska enheter för att bedöma elektriska interaktioner

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Utöka förståelsen av tumörmikromiljön med hjälp av masspektrometriavbildning av formalinfixerade och paraffininbäddade vävnadsprover

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Industrialiserad, artificiell intelligensstyrd lasermikrodissektion för mikroskalad proteomisk analys av tumörmikromiljön

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...