Name: measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry
Uploaded: 2020-03-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry at JoVE.com

Yazarlar, mario Nomura, M.D. ve Rodolfo Díaz histoloji ile ilgili yardımları için teşekkür eder ve Pierrick Fournier, Ph.D. onun değerli yorum için kağıt kalitesini artırmak için.

Bu tahlillerde kullanılan tüm fareler BALB/c fare suşlarından elde edilip, erkek ve dişi farelerin gelişigüzel kullanılmasına neden oldu. Önceki kültür deneyleri de FVB, İsviçre fareler, CD-1 ve CsA fareler11,,12,14gibi diğer suşları kullanılarak yapılmıştır. Tüm fareler Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergelerine göre barındırıldı, Ek S. Hayvan denekleri içeren prosedürler Kurumsal Hayvan Bak...

<ol>
	<li>Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+biology+and+pathology.">Bone biology and pathology.</a> Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).</li><li>Clark, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).</li><li>Fournier, P. G. J., Ju&#225;rez, P., Guise, T. A., Heymann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-bone+interactions:+there+is+no+place+like+bone.">Tumor-bone interactions: there is no place like bone.</a> Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).</li><li>Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stephen+Paget+and+the+"seed+and+soil"+theory+of+metastatic+dissemination.">Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination.</a> Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).</li><li>Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vicious+cycle+of+bone+metastases.">The vicious cycle of bone metastases.</a> Journal of Musculoskeletal &amp; Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+bone+metastasis.">Mechanisms of bone metastasis.</a> Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).</li><li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+to+bone:+causes,+consequences+and+therapeutic+opportunities.">Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).</li><li>Chong, S. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+bone+metastasis:+Opportunities+for+the+study+of+cancer+dormancy.">Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).</li><li>Deguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+bone+to+facilitate+measurement+of+adhesion+forces+and+super-resolution+imaging+of+osteoclasts.">In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts.</a> Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).</li><li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Nordstrand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+validation+of+an+in+vitro+coculture+model+to+study+the+interactions+between+bone+and+prostate+cancer+cells.">Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).</li><li>Curtin, P., Youm, H., Salih, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cancer-bone+metastasis+model+using+ex+vivo+cocultures+of+live+calvaria+bones+and+cancer+cells.">Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells.</a> Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).</li><li>Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bone+formation+using+mouse+calvarial+organ+cultures.">Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures.</a> Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).</li><li>Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+new+bone+formation+in+neonatal+calvarial+organ+cultures.">Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).</li></ol>

Burada, kemik oluşumunu veya rezorpsiyonlarını değerlendirmek ve kanser hücrelerinin kalvarial fare kemiği ile etkileşimlerini incelemek için kalvarial ex vivo modelinin protokolünü açıklıyoruz. Bu tekniğin kritik adımları kalvariaların diseksiyon, kültür, katıştırma ve histomorfometrik analizidir. Calvarias diseksiyon sırasında, bir yamuk içine hemi-kalvarias kesmek için çok önemlidir, bu kuvvetle parafin dahil sırasında yönünü kolaylaştıracak gibi. Calvarias ile kanser hücre...

Kemik, kasların desteklenmesi, iç organların ve kemik iliğinin korunması, kalsiyum ve büyümefaktörlerinin,depolanması ve serbest bırakılması dahil olmak üzere çeşitli işlevleri olan dinamik bir bağ dokusudur.2 Bütünlüğünü ve uygun işlevini korumak için, kemik dokusu sürekli remodeling süreci altındadır. Genel anlamda, kemik remodeling döngüsü kemik rezorpsiyonu ve kemik oluşumu1ayrılabilir. Kemik remodeling bu iki aşamaları arasında bir dengesizlik kemik patolojilerinin gelişmesine yol açabilir. Ayrıca, meme kanseri gibi hastalıklar genellikle kemik bütünlüğünü etkiler; ileri evrelerde hastaların yaklaşık %70'inde kemik metastazı vardır veya olacaktır. Meme kanseri hücreleri kemiklere girdiğinde, kemik metabolizmasını etkiler, aşırı rezorpsiyon (osteoklastik lezyonlar) ve /veya oluşum (osteoblastiklezyonlar)ile sonuçlanır 3 .
Kemik hastalıklarının biyolojisini anlamak ve yeni tedaviler geliştirmek için kemik remodeling ile ilgili mekanizmaları anlamak gerekir. Kanser araştırmalarında kemik metastazı prosesi ve metastatik mikroçevre ile ilişkisi nin araştırılması esastır. 1889 yılında, Stephen Paget metastaztümör hücreleri ve hedef doku arasında uyumluluk olduğunda meydana geldiğini hipotez, ve metastatik site mikroçevre için tümörün yakınlık bağlıdır önerdi4. 1997 yılında, Mundy ve Guise tümör hücrelerinin hayatta kalma ve büyüme elde etmek için kemik mikroçevre değiştirmek nasıl açıklamak için "kemik metastazlarının kısır döngüsü" kavramını tanıttı, ve nasıl kemik mikroçevre kalsiyum ve büyümefaktörlerisağlayarak büyümesini teşvik 5,6,7.
Kemik remodeling ve kemik metastazı ile ilgili mekanizmaları karakterize etmek ve olası terapötik potansiyele sahip molekülleri değerlendirmek için in vitro ve in vivo modellerin geliştirilmesi gerekmektedir. Ancak, bu modeller şu anda kemik mikroortamının basitleştirilmiş temsili gibi birçok sınırlamalar mevcut, ve maliyet8,9. Kemik eksektis ex vivo kültürü, kemik hücrelerinin çeşitliliğinin yanı sıra üç boyutlu organizasyonu koruma avantajına sahiptir. Buna ek olarak, deneysel koşullar kontrol edilebilir. Eksplant modelleri metatarsal kemikler, femoral kafaları, calvarias ve mandibular veya trabeküler çekirdek10kültürünü içerir. Ex vivo modellerinin avantajları çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. 2009 yılında, Nordstrand ve işbirlikçileri kemik ve prostat kanseri hücreleri arasındaki etkileşimleri dayalı bir coculture modelinin kurulması bildirdi11. Ayrıca, 2012 yılında, Curtin ve işbirlikçileri ex vivo cocultures12kullanarak üç boyutlu bir modelin geliştirilmesi rapor . Bu tür ex vivo modellerinin amacı, normal veya patolojik kemik remodeling inde yer alan mekanizmaları karakterize edebilmek ve yeni terapötik ajanların etkinliğini değerlendirmek için kemik mikroortamının koşullarını mümkün olduğunca doğru bir şekilde yeniden oluşturmaktır.
Bu protokol Garrett13 ve Mohammad ve ark.14tarafından yayınlanan prosedürlere dayanmaktadır. Yenidoğan fare kalvari kültürleri deneysel bir model olarak kullanılmıştır, onlar geliştirme ve kemik hücreleri altında kemik üç boyutlu mimarisi korumak gibi, farklılaşma tüm aşamalarında hücreleri de dahil olmak üzere (yani, osteoblastlar, osteositler, stromal hücreler) olgun osteoklastlar ve osteoblastlar yol, yanı sıra mineralize matris14. Ex vivo modeli kemik hastalıklarının patolojik sürecini tam olarak temsil etmez. Ancak, kemik remodeling veya kansere bağlı kemik osteoliz üzerindeki etkileri doğru ölçülebilir.
Kısaca, bu protokol aşağıdaki adımlardan oluşur: 5-7 günlük fareler, calvaria preculture, calvaria kültür uygulamaları (örneğin, insülin varlığında kültür, kanser hücreleri veya şartlı orta ve hatta ajanlar gelen kalvarias diseksiyon terapötik potansiyel, araştırma amacına göre), kemik fiksasyonu ve kalsifikasyon, doku işleme, histolojik analiz ve sonuç yorumu.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well cell culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>15705-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovial</td>
			<td>SSI</td>
			<td>2341-S0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics-Antimycotic</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154-100GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugue</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628188</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2935-24X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal resin</td>
			<td>Richard Allen</td>
			<td>8310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (10X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebedding Cassettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z672122-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Golden</td>
			<td>26400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Workstation</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A81000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Golden</td>
			<td>60600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>JALMEK</td>
			<td>E5325-17P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>BIO-S1650-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and scissors</td>
			<td>LANCETA HG</td>
			<td>74165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides 25 x 75 mm</td>
			<td>Premiere</td>
			<td>9105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris&#39;s Hematoxylin</td>
			<td>Jalmek</td>
			<td>SH025-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High profile blades</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1001259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoquinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>813150</td>
			<td>STP 120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>905200</td>
			<td>MICROM HM 355S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse food, 18% prot, 2018S</td>
			<td>Harlan</td>
			<td>T.2018S.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>OB0674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Paraplast</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Section Flotation Bath</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8517X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloxin B</td>
			<td>Probiotek</td>
			<td>166-02072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax dispenser</td>
			<td>Electrothermal</td>
			<td>MH8523BX1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Golden</td>
			<td>534056-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bone remodeling and recreating the tumor-bone microenvironment using calvaria co-culture and histomorphometry

Kemik osteoblastlar, osteositler ve osteoklastlar oluşan bir bağ dokusu ve onun güç ve esneklik verir ve işlevlerini yerine getirmek için izin veren bir mineralize ekstrasellüler matris vardır. Kemik sürekli olarak çeşitli uyaranlara maruz kalır ve patolojik koşullarda kemik remodelingini bozabilir. Kemik biyolojisi ve hastalıkları nın incelenmesi ve potansiyel terapötik ajanların değerlendirilmesi için in vitro ve in vivo modellerin geliştirilmesi gerekmektedir.
Bu makale, kemik oluşumu nu ve kemik tümörü mikroçevresini incelemek için neonatal farelerden izole edilen kalvariaların diseksiyon sürecini ve kültür koşullarını açıklamaktadır. In vitro ve in vivo modellerin aksine, bu ex vivo modeli istenilen mikroortamı simüle etmek için tanımlanmış koşullar altında kültürleme sırasında dokununma sırasında dokunun üç boyutlu ortamının yanı sıra kemik hücresel çeşitliliğin korunmasına olanak sağlar. Bu nedenle, kemik remodeling ve mekanizmaları, yanı sıra diğer hücre tipleri ile etkileşimleri araştırmak mümkündür, kanser hücreleri ve kemik arasındaki etkileşimler gibi.
Burada bildirilen tahliller 5-7 günlük BALB/C farelerden calvarias kullanır. Elde edilen hemi-kalvarias insülin varlığında kültürlü, meme kanseri hücreleri (MDA-MB-231), ya da meme kanseri hücre kültürlerinden klimalı orta. Analizden sonra insülinin yeni kemik oluşumuna neden olduğu, kanser hücreleri ve bunların şartlı orta indüklenen kemik rezorpsiyonu olduğu saptandı. Kalvarial model, kemik gelişimi ve kansere bağlı kemik hastalıklarının araştırılmasında temel ve uygulamalı araştırmalarda başarıyla kullanılmıştır. Genel olarak, kolay, bilgilendirici ve düşük maliyetli bir teşp için mükemmel bir seçenektir.

Kalvarial modelde kemik oluşumunu değerlendirmek için hemi-kalvariaları 50 g/mL insüliniçeren veya olmayan ortamda yetiştirdik. Doku bölümleri hazırlandı ve H&E ile boyandı. Bu koşullarda histoloji, kalvariyal kemiğin yapısal bütünlüğünün korunarak farklı bileşenlerinin tanımlanmasına olanak sağladığını göstermiştir(Şekil 1). İnsülin ile tedavi edilen kalvariler kontrole göre kemik dokusu miktarında artış gösterdiler (<...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry at JoVE.com

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Kemik eksektijinin ex vivo kültürü kemik fizyolojisi ve kemik remodeling ve kemik hastalıklarında ilaçların potansiyel değerlendirilmesi çalışmaları için değerli bir araç olabilir. Sunulan protokol, yeni doğan fare kafataslarından izole edilen calvariaların hazırlanmasını ve kültürünün yanı sıra uygulamalarını da açıklamaktadır.

Calvaria Co-culture ve Histomorfometri Kullanarak Kemik Remodeling ve Tümör-Kemik Mikroortamı yeniden oluşturma

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Bu işlemin amacı, kemik remodeling değerlendirmek ve tümör-kemik mikroçevre calvaria kültürü veya kanser hücreleri ile co-kültür kullanarak yeniden oluşturmak için bir ex vivo modeli olmasıdır. Kalvari tekniğinin çoğu, kemik remodelingini değerlendirmek için yenidoğan farelerden kalvaria kemikleri kullanan bir organ kültür sistemidir. Farklı moleküllerin terapötik potansiyelini test edebilir, hatta kanser hücreleri ile co-kültürleri kullandığınızda kemik tümörü mikroortamı yeniden.Tüm bu kısa bir süre ve düşük bir maliyetle basit ve kolay bir tayiş. Bu tekniğin amacı, fare kalvariyal organ kültürünün ex vivo modelini kullanarak, kanser kemik mikroortamında kemik rejenerasyonu değerlendirmek için bir araç olmasıdır. İlk olarak, bir fare yavrusu seçin ve başlık altına yerleştirin.5-7 günlük fare yavrularından calvaria kullanıyoruz. Şırıngayla baş alın, deriyi kesin ve kalvariyi incelemek için kafa derisi alanını temizleyin. Kafatası, sagittal, koronal ve lambdoids dikişleri tanımlayın.Göz seviyesine lambdoid dikişler boyunca düz bir kesim yapmak. Lambdoid sütürlerden koronal dikişe doğru her iki tarafı da kesin. 45 açı, ön fontanel kesim ile yapılan kesim ucunu bağlamak için başka bir kesim yapmak.Doğru doku dahil etme ve histoloji analizini garanti altına almak için kafatası sütür, sagittal, frontal, koronal, lambdoid tanımlamak son derece önemlidir. Ince ipuçları forceps ile, calvaria çıkarın ve petri çanak kapağı üzerine koyun. Bir neşter ile, koronal sütür ile sagittal sütür boyunca posterior fontanel düz bir kesim yapmak.İki hemicalvarias elde edilir. Her calvaria'yı çifenler ile toplayın ve PBS'li yeni bir Petri kabına yerleştirin. Kültür için, 24-iyi doku kültür plakası, medya bir mililitre içeren hemicalvaria yerleştirin ve 37 derece 24 saat kuluçka.Ayrıca kemik rezorpsiyonu için tümör-kemik mikroçevresini yeniden üretmek için birincil kalvarial kültürleri de kullanabiliriz. Bunu yapmak için, biz kanser hücreleri ile ortak kültür calvarias, ya da kanser hücrelerinden koşullu medya ile. 24 saat sonra, ortamı çıkarın ve test etmek istediğiniz tedaviyi içeren ortamla değiştirin.Kanser hücrelerini ve kemik etkileşimlerini değerlendirmek veya tümör-kemik mikroçevresini yeniden oluşturmak istiyorsanız, kanser hücrelerinin tabağa bağlanmasını önlemek için kalvariyi düşük hücresel bağlanma plakasına geçirin. Kanser hücrelerini deneyin, sayılayın ve hemicalvarianın en üstüne dikkatlice yerleştirin. Ayrıca kanser hücrelerinden koşullu medya kullanabilirsiniz, ve hemicalvaria kuluçka için kullanabilirsiniz.37 derecede 6-7 gün kuluçkaya yat, %5 CO2 ile. Üçüncü gün, medya yıkın ve kuluçkaya devam edin. Co-kültür kullanan hücrelerin sayısı kanser hücresel hattına bağlıdır.Öncelikle, bir yanıt ı ikna etmek için gereken hücre sayısını optimize etmek gerekir. Kültürden sonra, calvaria fiksasyon, kireçlenme ve parafin gömülü bir süreçten geçer. Ayrıca dokular mikrotom, lekeli olarak kesitlenir ve histomorfometrik analiz yapılır.Calvaria dahil zor olabilir. Doku dahil sırasında korunduğundan emin olmak için, süngerler arasında doku koymak veya kaset koymak için önce bir doku kağıt veya diğer emici kağıt kullanabilirsiniz. Doku işleme için, kağıt mendil hemicalvaria sarın.Sonra, bir gömme kaset içine yerleştirin ve formalin nötr tampon düzeltmek, dört derece 24 saat boyunca. Calvaria dekalsitif etmek için, dört derece 48 saat boyunca% 10 EDTA içine kaset yerleştirin. Bir otomatik doku işlemci içinde hemicalvaria ile doku kasetleri işleme.Normal bir gün dönüş döngüsü izleyin, sonra, parafin ekleyin. Kesit için, bir mikrotom ile dört mikrotik bölüm kesti, cam mikroskop slaytlar üzerine bölümleri monte ve hematoksilin, eozin ile leke. Histoloji analizi kemik yüzeyi ve kemik remodeling alanlarının kantitatif analizini yapmak için kullanıldı.Calvaria'nın yedi gün deki görüntüleri görüntüleme yazılımı kullanılarak analiz edildi. Nicel değerlendirme için öncelikle analiz alanını tanımlayın. Telopa'daki bölümlere bakın, oryantasyonu ve dikişleri tanımlamak için dört X.Koronal sütür tanımlayın ve bir tarafta uzun kemik yüzeyi tanımlamak, ve sonra diğer kısa yüzey. 40X büyütme altında, koronal sütür tanımlayın ve uzun yüzey boyunca, dikiş uzak iki veya üç optik alanları hareket ettirin. Analiz için bu alanın görüntüsünü yakalayın.Kemiğin yapısal bütünlüğünü analiz etmek için görüntü yazılımı kullanabilirsiniz. Hemicalvarianın kalınlığı ve kemik bölgesi için kantitatif histomorfometrik analiz yapılabilir. Doğru kalvari analizi, tutarlı histolojik sonuçlar için iyi bir katıştırma ve uygun oryantasyona bağlıdır.Deneysel durum başına en az üç calvaria kullandığınızdan emin olun. Burada kemiğin yapısını görebiliyoruz. Turuncuda kemik gözlenir.Ayrıca periost, ostosit, endosteum ve kemiğin başka bir bölümünün varlığını da görebiliriz. Bizim durumumuzda, biz kemik remodeling artırmak için insülin kullanın. Bir kontrol le karşılaştırıldığında, kemik bölgesinde önemli bir artış görebiliriz.Burada MDA-MB-231 hücre hattının model kalvaria üzerindeki etkisini görebiliriz. Biz görebilirsiniz, kontrol ile karşılaştırıldığında, kanser hücrelerinin varlığı kemik yıkımını teşvik osteolitik faktörlere neden. Biz kanser hücresi ve histoloji ile co-kültürler tarafından kemik rejenerasyonu ve kanser hücre-kemik etkileşimlerini ölçmek için calvaria modeli kullanılır.Ayrıca verilerimizi nicel gerçek zamanlı PCR ile de doğrularız. Bu ex vivo modeli, üç boyutlu organizasyon ve kemiğin hücresel çeşitliliği korunur gibi birçok avantajı vardır, ve deneysel koşullar kontrol edilebilir. Ayrıca, model basit, kısa bir süre içinde sonuçları görebilirsiniz, ve düşük maliyetli.Ve diğer tekniklerle kombine edilebilir, kantitatif gerçek zamanlı PCR, mikroskopi ve mikro-BT gibi.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Örnek ve işlem kemik iliği ölçülebilir artık hastalık ve akut Myeloid lösemi lösemik kök hücre ölçmek için kapsamlı iletişim kuralı

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mezenkimal kök hücre izolasyon hamuru doku ve kanser hücreleri ile ortak kültür ilişkileri incelemek için

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Solid Tümör Hücre Hatlarında Yan Popülasyon analizi

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Primer Kemik Tümörleri ve Kemik Metastazlarının Solid Tümör Grefti İmplantasyonu ile Modellenmesi

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Pankreatik adenokarsinomun tümör mikroçevresini araştırmak için proksimal sıvıların izolasyonu

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Glutamaterjik Nöronların ve Pediatrik Yüksek Dereceli Glioma Hücrelerinin Mikroakışkan Cihazlara Ortak Kültürü Elektriksel Etkileşimleri Değerlendirmek İçin

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Formalin-Sabit ve Parafin-Gömülü Doku Örneklerinin Kütle Spektrometrisi Görüntülemesini Kullanarak Tümör Mikroçevresinin Kavranmasının Genişletilmesi

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Tümör Mikroçevresinin Mikro Ölçekli Proteomik Analizi için Endüstriyelleşmiş, Yapay Zeka Rehberliğinde Lazer Mikrodiseksiyonu

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...