Name: fully autonomous characterization and data collection from crystals of biological macromolecules
Uploaded: 2019-03-22T12:30:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules at JoVE.com

يشكر المؤلفون أسرف بيامتيمي.

ملاحظة: إنتاج وتنقية، وبلورة جكش موصوفة في التكميلية الملف 1.
1-وصف موجز لإعداد اتصال وتركيب كريستال
<ol><li>موقف حلقة نايلون أو دعم تركيب كريستال آخر الفعل ثابتة لدبوس العمود الفقري تحت بلورات واحد أو أكثر وانتشالهم من الحل هطول الأمطار (20 ميليلتر من الصوديوم 0.5 M فورمات pH 4.0 + 25 ميليلتر من حل البروتين).<ol>
<li>إزالة السائل الأكبر حول crystal(s) بلمس الجبل مع فتيلة ورقة تمتص قبالة أي سائل الزائدة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>نقع في crystal(s) في حل كريوبروتيكتيفي التي تحتوي على حل هطول الأمطار بالإضافة إلى 30% والغليسيرول؛ ثم، قم بإزالة دعم الكريستال و crystal(s).<ol>
<li>إزالة السائل الأكبر حول crystal(s) بلمس الجبل مع فتيلة ورقة تمتص قبالة أي سائل الزائدة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>يغرق في الجبل في العمود الفقري قنينة مملوءة بالنيتروجين السائل وتخزينه، جنبا إلى جنب مع أي من بلورات أخرى وبالمثل أعد، في مختبر البيولوجيا الجزيئية الأوروبي (EMBL)/نموذج أسرف مغير عفريت9 في درجة حرارة النتروجين السائل. ملاحظة: crystal(s) مستقرة في هذا الشرط حتى يتوفر بيمتيمي.</li>
</ol>2-طلب بيمتيمي على كتلة صخرية-1
<ol><li>طلب بيمتيمي لها في أقرب وقت ممكن على الصفحة الرئيسية أسرف (في http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying). ملاحظة: هناك عدة طرق ممكنة للوصول إلى بياملينيس MX أسرف. يمكن تطبيق المختبرات جماعياً كجزء من مجموعة تخصيص كتلة (حقيبة)، أن يكون بيمتيمي المخصصة لمدة 2 سنة. إذا كانت مجموعات ترغب في تطبيق على حدة، يمكن انطباقها المتداول الوصول، مما يتيح لهم إمكانية الوصول السريع إلى بيملينيس بعد استعراض الأقران. سوف استعرض على اقتراح الفريق ومسح مجموعة السلامة أسرف الذين قد يطلبون الحصول على تفاصيل إضافية. إذا تم قبول هذا الاقتراح، سوف يبلغ عدد التجربة وكلمة مرور. يمكن إجراء البحوث الملكية عن طريق شراء بيمتيمي.</li>
	<li>إكمال السلامة المطلوبة التدريب على الإنترنت (في http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).</li>
	<li>كتاب بيمتيمي على "التقويم" كتلة صخرية-1. ملاحظة: من الممكن أن الكتاب إلى حد أقصى 50 أصحاب العينة لتحليل كل نوبة.</li>
	<li>تعبئة نموذج لتعريف البريد في تجربة (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form)، جنبا إلى جنب مع معلومات الأمان المطلوبة، للعينات التي يمكن قياسها.</li>
</ol>3-وضع خطة حيود في إيسبيب
ملاحظة: الخطة حيود يحمل جميع المعلومات اللازمة عن عينة في إيسبيب ويمكن أن تحتوي على معلومات إضافية لتكييف هذه التجربة لكل عينة.
<ol><li>فتح إيسبيب (في https://exi.esrf.fr/).</li>
	<li>اختر تجارب MX.</li>
	<li>تسجيل الدخول باستخدام رقم التجربة وكلمة المرور.</li>
	<li>انقر فوق الشحن | إضافة جديدة وتوفير المعلومات اللازمة. انقر فوق حفظ.</li>
	<li>انقر فوق إضافة قطعة وتعبئة المعلومات المطلوبة. انقر فوق حفظ.</li>
	<li>ثم انقر فوق إضافة حاويةوتعطي الرمز الشريطي الصولجان كالاسم واختر عفريت العمود الفقري. انقر فوق حفظ.</li>
	<li>انقر فوق رمز حاوية و تحريرها، وملء المعلومات الضرورية، مثل اسم البروتين، سير العمل المفضل، موقف كريستال في الصولجان، وما إلى ذلك، فيما يتعلق بالعينات.</li>
	<li>اختر البروتين (على سبيل المثال، جكش أو lysozyme) التي وافقت عليها مجموعة السلامة أسرف.</li>
	<li>قم بإدخال اسم نموذج فريد لتحديد كل عينة الفردية. فمن الممكن مسح الباركود pin اختيارياً. بقية المعلومات الواردة أدناه اختياري.</li>
	<li>أدخل معلومات اختيارية.<ol>
<li>لكل عينة الفردية، أدخل نوع التجربة (أي MXPressE_SAD أو نقاط، أو مكسبريسو، إلخ، الافتراضية مكسبريسي) تحت نوع [ااكسب]. وهذا يحدد سير العمل التلقائية التي ستستخدم لمعالجة كل كريستال. نظراً لأن البلورات جكش هي الإبر، اختر مكسبريسب.</li>
		<li>أدخل مجموعة الفضاء (على سبيل المثال، C2، P1 أو P212121)، إذا كانت معروفة. إذا كانت موجودة، ستستخدم هذه لحسابات استراتيجية جمع البيانات وعن طريق خطوط الأنابيب التجهيز الآلي للبيانات المتاحة.</li>
		<li>أدخل الدقة المطلوبة (الافتراضي: ددقيقة = 2.0 Å). وهذا يحدد المسافة كريستال لكاشف لمسح الشبكة الأولى ووصف، وجمع البيانات الافتراضية.</li>
		<li>تعيين دقة الحد الأدنى المطلوب (على سبيل المثال، 1.5 Å أو 2.3Å)، لمنع مجموعة مجموعات كاملة من البلورات التي لا ديفراكت إلى هذا الحد. هذا يمكن أن يوفر تخزين البيانات الفضائية وتحليل الوقت.</li>
		<li>تعيين اكتمال المطلوب (الافتراضي: 0.99). تعيين التعدد مطلوب (الافتراضي: 4). إذا كان كريستال أكثر من يرد على دعم عينة، تعيين العدد الأقصى من بلورات يتم تحليلها. القيمة الافتراضية هي 1 أو 5 مكسبريسب.</li>
		<li>حدد حجم الحزمة المناسبة (الافتراضي: 50 ميكرومتر). إذا لم يتم تحديد قيمة محددة، سيتم إجراء أشعة X التوسيط وحسابات استراتيجية جمع البيانات مع حجم شعاع 50 ميكرومتر. ملاحظة: أثناء أي جمع مجموعات البيانات اللاحقة، حجم الحزمة سيتم تكييفها تلقائياً.</li>
		<li>وضع في مجموعة الفضاء، إذا كان معروفا، في العمود المجموعة الفضاء القسري. تعيين الإشعاع-حساسية البلورات (0.5-2.0 لحساسية على ارتفاع منخفض، مع قيمة افتراضية 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>إذا رغبت في ذلك، بتعيين زاوية الاستدارة الإجمالية التي سيتم جمعها لجمع البيانات الكاملة (الافتراضي: زاوية الاستدارة المجموع يحدده عيدنا).</li>
	<li>حفظ القيم. انقر فوق العودة إلى الشحنات. اضغط على إرسال الشحنة إلى أسرف.</li>
	<li>طباعة التسمية الشحن وإرسال العينات. وينبغي ترتيب المستخدمين سيارة بيك آب مع ساعي، باستخدام معلومات حساب أسرف. ملاحظة: من المهم جداً لتحديد تضمين تسمية العودة السماح بعودة السلس من عينات (انظر https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).</li>
</ol>4-جمع البيانات وعرضها واسترجاعها
ملاحظة: اليوم من التجربة، يتم نقل العينات إلى كتلة صخرية-1 عالية القدرة ديوار (HCD). ثم إطلاق العلماء بيمليني في جمع البيانات، والتي يمكن اتباعها من قبل المستخدمين عن بعد. لكل نوع من أنواع مختلفة من عينة يتلقى المستخدمون رسالة بريد إلكتروني تم إبلاغهم بأنه قد بدأت عملية جمع البيانات. كما سبقت الإشارة، يمكن أن يتبع تنفيذ كافة الخطوات في كافة مهام سير العمل على الإنترنت وفي الوقت الحقيقي بالمستخدم عن طريق إيسبيب، الذي يمكن عرض النتائج وتحميلها.
<ol><li>لكل عينة تم تحليلها، دراسة نتائج التجربة التلقائية في إيسبيب (https://exi.esrf.fr/).<ol>
<li>تسجيل الدخول، باستخدام رقم التجربة وكلمة المرور، ثم انقر فوق الدورة التجريبية المطلوبة في ID30A-1.</li>
		<li>حدد المفضلة (سجل أعلى) حدث خط الأنابيب (على سبيل المثال، قنابل يدوية أو XDS_APP) وتحميل البيانات المكتوبة في مجموعة الفضاء الصحيح مع اكتمال أعلى وأعلى دقة بالنقر فوق نتائج جمع آخر ، ثم تحميل. ملاحظة: جميع الصور مش، والخط، وتوصيف في دليل فرعي لكل عينة، ودعا/MXPressE_01. أسرف تلقائياً بتشغيل خمس مجموعات معالجة منفصلة، هي: EDNA_proc12وقنابل12، XDS_APP14، أوتوبروك15و XIA216. تكامل البيانات يستند إلى XDS، باستثناء XIA2، الذي يرتكز على الأوجه. يتم تشغيل كافة الحزم أيضا في أوضاع شاذة ونونانومالوس، مما يتيح الكشف التلقائي لإشارة شاذة، إذا كانت موجودة في البيانات، التي ستستخدم في الساحل والتدريجي للبروتوكولات. كل حزمة يستخدم معلمات مختلفة وأشجار القرار، مما يعني أن بعض مجموعات تعمل بشكل أفضل مع بعض العينات. ومع ذلك، هذا يمكن أن يجعل لعدد كبير من النتائج عندما يحسب عدد الحزم والمجموعات الفضائية المحتملة. ولذلك، أن النتائج تصنف تقريبا على أساس القرار والمقاييس النوعية الأخرى، مثل البحث والتطويردمج في شل القرار أدنى، CC(1/2)، واكتمال. وهذا يهدف إلى توجيه المستخدم إلى مجموعات بيانات أفضل، ولكن جميع المجموعات الفضائية المحتملة والنتائج ينبغي تفتيشها بدقة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>فك مجلد التحميل، التي ستشمل جميع ملفات السجل و XDS_ASCII غير مدمجة. HKL وملفات.mtz المدمجة وتوسيع نطاقها. ملاحظة: في حال تم إيداع الهيكل (في تنسيق PDB) البروتين الفائدة أو هومولوج وثيق إيسبيب في بداية التجربة، خط الأنابيب حدث في أسرف سوف تلقائياً إجراء بديل جزيئية (السيد) تشغيل استخدام هذه البنية نموذج البحث عن أفضل سجل الحل. نتائج خط الأنابيب السيد يتم عرضها في إيسبيب ويمكن العثور في مجلد البيانات المجهزة (على سبيل المثال،/data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ mrpipe_dir/). وهنا سيتم تسمية النموذج النهائي coot1.pdb و sidechains.mtz بيانات الانعكاس. لاحظ أن خط الأنابيب قد تقلل من التماثل للخلية (الحد من خلية بدائية) من أجل زيادة احتمالات التوصل إلى حل. في الحال هنا، كتب السيد خط الأنابيب إلى الحل في خلية أحادي ميل (C2) بدلاً من خلية أورثورهومبيك (C2221). تفاصيل حول كيفية القيام باستبدال جزيئية تشغيل يدوياً (مثال للحل الثاني حدث أفضل سجل) مضمنة في ملفات تكميلية.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hui, R., Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+protein+crystallization.">High-throughput protein crystallization.</a> Journal of Structural Biology. 142 (1), 154-161 (2003).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASSIF-1:+a+beamline+dedicated+to+the+fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).</li><li>Svensson, O., Malbet-Monaco, S., Popov, A., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">Fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (8), 1757-1767 (2015).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrystalDirect:+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films.">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68, 1393-1399 (2012).</li><li>Nurizzo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RoboDiff:+combining+a+sample+changer+and+goniometer+for+highly+automated+macromolecular+crystallography+experiments.">RoboDiff: combining a sample changer and goniometer for highly automated macromolecular crystallography experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (8), 966-975 (2016).</li><li>Bowler, M. W., Svensson, O., Nurizzo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automatic+macromolecular+crystallography:+the+impact+of+MASSIF-1+on+the+optimum+acquisition+and+quality+of+data.">Fully automatic macromolecular crystallography: the impact of MASSIF-1 on the optimum acquisition and quality of data.</a> Crystallography Reviews. 22 (4), 233-249 (2016).</li><li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography.">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li><li>Svensson, O., Gilski, M., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-position+data+collection+and+dynamic+beam+sizing:+recent+improvements+to+the+automatic+data-collection+algorithms+on+MASSIF-1.">Multi-position data collection and dynamic beam sizing: recent improvements to the automatic data-collection algorithms on MASSIF-1.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74, 433-440 (2018).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB:+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Monaco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+processing+of+macromolecular+crystallography+X-ray+diffraction+data+at+the+ESRF.">Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).</li><li>Kikuchi, G., Motokawa, Y., Yoshida, T., Hiraga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+cleavage+system:+reaction+mechanism,+physiological+significance,+and+hyperglycinemia.">Glycine cleavage system: reaction mechanism, physiological significance, and hyperglycinemia.</a> Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and Biological Sciences. 84 (7), 246-263 (2008).</li><li>Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDSAPP2.0.">XDSAPP2.0.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).</li><li>Vonrhein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+and+analysis+with+the+autoPROC+toolbox.">Data processing and analysis with the autoPROC toolbox.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xia2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Higashiura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+X-ray+crystal+structure+of+bovine+H-protein+at+0.88+&#197;+resolution.">High-resolution X-ray crystal structure of bovine H-protein at 0.88 &#197; resolution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (6), 698-708 (2010).</li><li>Sanishvili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+7+&#181;m+mini-beam+improves+diffraction+data+from+small+or+imperfect+crystals+of+macromolecules.">A 7 &#181;m mini-beam improves diffraction data from small or imperfect crystals of macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (4), 425-435 (2008).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffraction+cartography:+applying+microbeams+to+macromolecular+crystallography+sample+evaluation+and+data+collection.">Diffraction cartography: applying microbeams to macromolecular crystallography sample evaluation and data collection.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (8), 855-864 (2010).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+Experience+of+Controlled+Crystal+Dehydration:+Results+from+the+European+Synchrotron+HC1+Collaboration.">Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration.</a> Crystal Growth &amp; Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+harvesting+and+processing+of+protein+crystals+through+laser+photoablation.">Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

بياملينيس التلقائي بالكامل توفر الآلي توصيف وجمع البيانات من إعداد كبيرة من بلورات الجزيئات دون الوجود عالم، أما في بيامليني أو عن بعد، يجري المطلوبة. وقد بياملينيس مؤتمتة بالكامل باستخدام العديد من المزايا مقارنة بالتشغيل اليدوي. المثال، النموذج الآلي التوسيط، استناداً إلى شبكة الأشعة السينية، وخط المسح الضوئي، وهو أكثر دقة من التي يؤديها بالعين البشرية أنه لا يتأثر بالتأثيرات الحرارية أو الضوئية. في الواقع، توفر هذه الشبكة وخط بمسح بيانات إضافية (أي أبعاد مفصلة للبلورة وأفضل ديفراكتينج منطقة الكريستال) التي تعتبر هامة في تحديد حجم الحزمة الصحيحة لاستخدامها لجمع البيانات – خاصة بالنسبة لبلورات صغيرة 18-وكثيراً ما يؤدي إلى تحسين نوعية البيانات الحيود التي تم الحصول عليها. وعلاوة على ذلك، بالاستفادة من المعلمات المعرفة من قبل المستخدم في إعداد تجارب التلقائي، خطوات سير العمل المحددة في يمكن تكييفها لتناسب النظام قيد الدراسة، وبالتالي زيادة تحسين معدل نجاح التجربة.
آخذا معا، موثوقية مهام سير العمل المتوفرة، الوصول مباشرة إلى بيمليني (المستخدمين جدولة ذاتيا، باستخدام تقويم [انظر أعلاه])، ونهج مؤتمتة بالكامل لكتلة صخرية-1 يوفر صارمة، الفائق، وتوفير الوقت بديل لتجارب MX العملي الكلاسيكي والقدرة على تنفيذ إجراءات أكثر تقدما والتطبيقات في مهام سير العمل التلقائية. في المستقبل القريب، سيتم تنفيذ كريستال رسم الخرائط في 3D19 لتحسين الدقة من الأشعة السينية التوسيط، بينما سيكون آليا بروتوكولات أكثر تعقيداً، مثل كريستال الجفاف تجارب20،. ويؤمل أن تصبح جمع بيانات مستقلة تماما أسلوب قياسي في MX، توفير بيانات عالية الجودة للشاشات جزء جزيء صغير، والاستفادة المثلى من فحص عدد كبير من سوء ديفراكتينج بلورات وتوفير المرحلة تلقائياً مزيد من المعلومات لحل الكريستال هياكل حيثياته. في تركيبة مع التطورات في حصاد الآلي لبلورات21، بإمكانية حل بنية بلورية البروتين كخدمة الآلي يمكن أن يصبح حقيقة واقعة.

تحديد هيكل ثلاثي الأبعاد للبروتينات معينة أمر حاسم في علم الأحياء. المعلومات مشتق من القيام حتى يلقي الضوء على الوظيفة البيولوجية وعلى الشكل والنوعية للمواقع النشطة و/أو الملزمة الواردة في جزيء قيد الدراسة. في كثير من الحالات، وهذا ما يسمح آليات العمل تحديد، أو عند الاقتضاء، المحتملة جزيئات علاجية توضع. الإرسال المتعدد هو الأسلوب الأكثر استخداماً للحصول على المعلومات الهيكلية، ولكن عنق زجاجة هو تحديد الظروف المثلى للحصول على بلورات ديفراكتينج جيدا. ولذلك، تبلور المحاكمات تجري في ظروف مختلفة عديدة وفرزا، ثم العثور على بلورات أفضل التي ستستخدم لجمع البيانات الحيود. أتمتة برنامج الإعداد من بلورة تجارب1 وضوح ساعد في هذا الصدد. ومع ذلك، الخطوات اللاحقة (أي تركيب الكريستال والفرز الحيود وجمع البيانات الحيود) عادة ما تنفذ يدوياً، تناول الكثير من الوقت والجهد والموارد. أتمتة حيود التحري وجمع البيانات، لذلك، يعني مكسب هائل في الوقت والكفاءة.
حيود التحري وجمع البيانات في نطاق يتم في أغلب الأحيان في بيملينيس السنكروتروني MX التي سهلت التشغيل الآلي إلى حد كبير هذه العملية. ومع ذلك، في معظم الحالات، من الضروري للعلماء أن يكونوا موجودين في بيمليني أثناء تجربة أو لتشغيلها عن بعد. جيل جديد من بيملينيس MX مؤتمتة بالكامل في الآونة الأخيرة نمواً2. وهنا، لا يحتاج المستخدمون يكون حاضرا، أما جسديا أو عن بعد، خلال جلسة تجريبية. يسمح هذا العلماء إلى أنفاق المزيد من الوقت على أقل من المهام الروتينية، بدلاً من أيام أسرة الإنفاق، وكثيراً ما ليال وبلورات التحري وجمع البيانات الحيود. بيامليني مؤتمتة بالكامل الأول في العالم هو "واسع الآلي عينة مختارة متكاملة مرفق" (ماسيف-1، ID30A-1)2،3 في مرفق الإشعاع السنكروتروني الأوروبية (أسرف). أنها بيئة عينة فريدة من نوعها التي تعمل فيها ديوار المحتوية على العينة ذات قدرة عالية بالترادف مع مغير عينة روبوتية التي تعمل أيضا بيمليني جونيوميتير4،5. كتلة صخرية-1 هو بيمليني أوندولاتور مجهزة بمفرده-فوتون-عد هجين بكسل كاشف6، التي تعمل في موجه ثابتة من 0.969 (12.84 كيلو إلكترون فولط) مع شعاع الأشعة سينية مكثفة (2 × 1012 الفوتونات/s). يمكن ضبط حجم الحزمة في الموضع عينة بين الحد أدنى من 10 ميكرون (جولة شعاع) بحد أقصى 100 ميكرومتر x 65 ميكرومتر (الأفقية بحجم شعاع عمودي). في المتوسط، يمكن بيمليني العملية، في تلقائية تماما أزياء بلورات 120 (انظر أدناه)، في 24 ساعة. تشغيل بيامليني يستند إلى سلسلة من مهام سير العمل7، كل منها يأخذ قرارات ذكية استناداً إلى نتائج الخطوات السابقة في سير العمل، لضمان قياس أفضل البيانات الممكنة من العينة قيد الدراسة. على وجه الخصوص، تقييم خصائص الحيود عينة فردية تأخذ بعين الاعتبار كريستال حجم والتمويه ويضمن، حيث الكريستال أكبر من شعاع الأشعة السينية، أن يستخدم فقط المنطقة أفضل من الكريستال للبيانات اللاحقة جمع. وهكذا، الأمثل مجموعات البيانات الحيود للقرار كحد أقصى مع الإشعاع المصغر الأضرار2،3. تطالب بروتوكولات جمع البيانات، مثل استراتيجيات جمع حلزونية الزائفة (موقف متعدد) البيانات لكلا حيود الشاذة الأصلية وطول موجي واحد (SAD) جمع البيانات، وهي أيضا متاحة8.
تجارب تلقائية تماما في كتلة صخرية-1 إشراك كريوكولينج وتركيب البلورات على جبل مغناطيسي عينة مناسبة لمستوى المعدات المطلوب بيامليني دبابيس العمود الفقري9، إدخال المعلمات التجريبية المرغوب في ' الحيود خطة 'الجدول في"النظام المتكامل""البروتين البلوري" بيملينيس (إيسبيب)10، نظام إدارة معلومات المستندة إلى ويب لتجارب MX، وإرسال العينات إلى بيمليني. في أسرف، جميع تكاليف النقل للعينات من بيامليني التي يدعمها "مكتب المستخدم أسرف" (انظر الموقع الإلكتروني ل أسرف11 لمزيد من التفاصيل). كتلة صخرية-1، لا توجد قيود على حجم التكرار الحلقي أو نوعية الكريستال. عند اختيار خطة حيود لبلورة معين، يمكن للمستخدم استخدام الإعدادات الافتراضية أما أو اختر من سير العمل المحددة، والتي يمكن أن تكون مخصصة لكل عينة. وتتوفر العديد من مهام سير العمل مبرمجة مسبقاً. في سير العمل مكسبريسي3 ، تتم محاذاة الحلقة المحتوية على عينة أولاً إلى موقف العينة استخدام التوسيط الضوئية. ثم، المستندة إلى أشعة X توسيط يضمن أن المنطقة أفضل من الكريستال يتم توسيط لشعاع الأشعة السينية. ثم تحسب استراتيجيات جمع البيانات استخدام عيدنا، إطارا لتطوير التطبيقات المستندة إلى البرنامج المساعد خاصة لتحليل البيانات على شبكة الإنترنت في مجال تجارب الأشعة السينية، آخذا في الاعتبار كريستال حجم والتمويه في الوقت الحقيقي في بيمليني. عقب جمع مجموعة من البيانات حيود كامل، هذا هو ثم معالجتها باستخدام سلسلة من أنابيب معالجة البيانات الأوتوماتيكية12 وتتاح النتائج التفتيش وتحميل في إيسبيب. سير العمل3 SAD مكسبريسيتهدف إلى سيلينوميثيونيني التي تحتوي على بلورات البروتين المستهدف ويستغل حقيقة أن الطاقة التشغيلية من كتلة صخرية-1 فقط فوق حافة ك سراج الدين. هنا، هو استراتيجية جمع البيانات عيدنا مكسبريسي الأمثل لجمع البيانات حزين (أي التكرار عالية، ومع قرار تعيين إلى حيث Rالدمج بين أزواج بيجفوت أقل من 5%). شاشة خصائص الحيود سلسلة من بلورات دون جمع البيانات اللاحقة، يمكن استخدام سير العمل3 مكسسكوريلإجراء تقييم جودة كاملة من بلورات تحليلها. في سير العمل3 مكسبريسي، جمعت 180 ° للتناوب البيانات باستخدام ذبذبات 0.2 ° واستخدام زاوية phi البداية والقرار تحدد استراتيجية عيدنا. مكسبريسو 3 يتضمن قرارا بريوبسيرفيد في سير العمل (الافتراضي: ددقيقة = 2). جعل تقييما أولياً لبلورات الناتجة عن بلورة لمحاكمة، وتقدم سير العمل3 مكسبريسم. وهذا ينفذ شبكة جرعة عالية المسح الضوئي عبر اتجاه أوسع لدعم نموذج مع لا جمع البيانات أو توسيط. في الآونة الأخيرة، كانت اثنين سير التجربة الجديدة، مكسبريسب ، و MXPressP_SAD، والقيام بعمليات جمع البيانات بسيودوهيليكال، نفذت8. تنفيذ كافة الخطوات في كافة مهام سير العمل التي يمكن اتباعها على الإنترنت وفي الوقت الحقيقي من المستخدم، وعن طريق إيسبيب.
هنا نعرض كيفية إعداد تجربة MX مؤتمتة بالكامل في كتلة صخرية-1 وكيفية استرجاع وتحليل البيانات الناتجة عن هذه التجربة. على سبيل مثال، نحن نستخدم جليكاين المتقدرية البشرية الانقسام ونظام البروتين ح (جكش). هذا البروتين الذي يحتوي على حامض يبويتش جزء من نظام الانقسام جليكاين المسؤولة عن تدهور جليكاين. يتضمن هذا النظام كذلك البروتين ف، decarboxylase بيريدكسال جليكاين تعتمد على الفوسفات والبروتين T، إنزيم تيتراهيدروفولاتي-التي تتطلب والبروتين L، نازعة ليبواميدي. جكش ينقل مجموعة ميثيلاميني جليكاين من البروتين ف للبروتين T. عيوب في البروتين ح هي السبب في هايبرجليسينيميا نونكيتوتيك (نخ) في13من البشر.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline MASSIF-1</td>
			<td>ESRF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21DE3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzing membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>132655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loop</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MonoQ 5/50 GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5166-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINE pucks</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CSM003-0001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1064430500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCSH purification buffer</td>
			<td>20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCSH cryo-protection buffer</td>
			<td>0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MxCube</td>
			<td></td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCube2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES workflow server</td>
			<td></td>
			<td>Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLISS beamline control</td>
			<td></td>
			<td>Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AUTO processing of images</td>
			<td></td>
			<td>Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEST and EDNA</td>
			<td></td>
			<td>Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phaser MR</td>
			<td></td>
			<td>McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td></td>
			<td>Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refmac5</td>
			<td></td>
			<td>Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240--255 (1997).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matthews</td>
			<td></td>
			<td>Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully autonomous characterization and data collection from crystals of biological macromolecules

الحزم الأشعة السينية عالية-تألق مقترنة بأتمتة أدت إلى استخدام بيملينيس على أساس السنكروتروني البلورات بالأشعة السينية الجزيئات (MX) للمشاريع الأكثر تحديا حتى في الأحياء الهيكلية. ومع ذلك، معظم المرافق لا تزال تتطلب وجود عالم في الموقع لإجراء التجارب. جيل جديد من بياملينيس الآلي مخصصة لتوصيف التلقائي بالكامل، وجمع البيانات من بلورات الجزيئات البيولوجية الكبرى قد وضعت مؤخرا. وتمثل هذه بياملينيس أداة جديدة لعلماء الأحياء الهيكلية لفحص نتائج المحاكمات تبلور الأولية و/أو جمع عدد كبير من مجموعات البيانات الحيود، المستعملين دون الحاجة إلى التحكم في بيامليني بأنفسهم. هنا نعرض كيفية إعداد تجربة للفرز التلقائي، وجمع البيانات، وكيف يتم إجراء تجربة على بيمليني، كيفية معالجة مجموعات البيانات الناتجة عن ذلك، وكيف، عندما يكون ذلك ممكناً، يتم حلها بنية بلورية جزيء ضخم البيولوجية.

تم استخدام سير العمل مكسبريسب في بيامليني أسرف ماسيف-1 تلقائياً تماما، جبل، مركز في شعاع الأشعة السينية، تميز، وتجميع مجموعات البيانات حيود الكامل من سلسلة من بلورات جكش البشرية. تم تحميل العينات وتحليل الحلقة لمنطقة المسح الضوئي (الشكل 1، يسار). وبعد تحليل حيود، اختيرت أربع نقاط داخل البلورة لجمع البيانات (الشكل 1، حق). معالجة بواسطة أنابيب التحليل الآلي للبيانات، بما في ذلك خط الأنابيب السيد، تسفر عن مجموعات بيانات عالية الجودة (الجدول 1) التي عثر على حل السيد اللاحقة. هذا الأخير يسمح للمستخدمين بسرعة تقييم ما إذا كانت مجموعة البيانات التي تم الحصول عليها ونموذج البحث المستخدمة مناسبة للتخلص التدريجي قبل الاستبدال الجزيئي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الحكم وجود يغاندس، مما يتيح للمستخدم التركيز فقط على مجموعات البيانات الأكثر تبشيرا بالنجاح لمزيد من التحليل. تصميم بنية دليل بالسيد أسفرت عن خارطة كثافة الإلكترونات عالية الجودة بعد واحد الآلي دورة الصقل (الشكل 2a). قطع خط الأنابيب الآلي dataset هذه البيانات في 1.32 القرار؛ ومع ذلك، يمكن للمستخدمين تحديد ما زال قص البيانات بدقة أقل للوصول إلى إحصاءات نوعية مختلفة (CC R1/2، < I/σ(I) >،الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) في شل القرار أعلى. بنية بلورية البشرية جكش هيكل شبيه بالبروتين البقري (3KlR)16.
كثافة الإلكترونات المستمر مرئياً لسلسلة كاملة من الأحماض الأمينية، وبصرف النظر عن علامة الحامض الأميني الطرفي ن. استبدالات الأربع التي تميز جكش البشري والبقري، ثلاثة يمكن تحديدها بسهولة في كثافة الإلكترونات (إيل/Val66، وآسيا والمحيط الهادئ/Glu98، ولوي/Phe149؛ الشكل 2 -د). وهذا أقل وضوحاً لاستبدال Asp/Lys125 التي كثافة الإلكترونات سلسلة الجانب يتم حلها جزئيا فقط بسبب المرونة (الشكل 1e). النموذج الذي تم الحصول عليه حاليا قد آرالعمل وقيم Rمجاناً من 20.4 في المائة و 23.8 في المائة، على التوالي، ويمكن أن يكون الأمثل المزيد من دورات إضافية لبناء نموذج الآلية واليدوية وصقل.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>أنابيب قنابل يدوية</td>
			<td>أنبوب XDS_APP</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">جمع البيانات وتجهيزها</td>
		</tr>
<tr>
<td>الأشعة السينية المصدر/شعاع خط</td>
			<td colspan="2">أسرف/ماسيف-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>الطول الموجي (Å)</td>
			<td colspan="2">0.966</td>
		</tr>
<tr>
<td>القرار (Å)</td>
			<td>41.88 – 1.48 (1.53 – 1.48)</td>
			<td>41.86-1.32 (1.39-1.32)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">المجموع/فريد التأملات</td>
			<td>127670/28644</td>
			<td>177332/40134</td>
		</tr>
<tr>
<td>(12178/2775)</td>
			<td>(23772/5714)</td>
		</tr>
<tr>
<td>مجموعة الفضاء للفهرسة، والقياس، ودمج</td>
			<td>C222</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>أبعاد الخلية</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>أ، ب، ج ()</td>
			<td>42.20، 83.75، 95.85</td>
			<td>42.19، 83.72، 95,82</td>
		</tr>
<tr>
<td>موسيسيتي</td>
			<td>0.05</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rالاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف (%)</td>
			<td>10.0 (110.7)</td>
			<td>11.1 (198.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>< I/σ(I) ></td>
			<td>9.6 (1.3)</td>
			<td>7.6 (0.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ج ج1/2 (%)</td>
			<td>99.7 (53.9)</td>
			<td>99.7 (19.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>كمال (%)</td>
			<td>99.6 (99.6)</td>
			<td>99.5 (98.6)</td>
		</tr>
<tr>
<td>تعدد</td>
			<td>4.5 (4.4)</td>
			<td>4.4 (4.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">استبدال الجزيئية وصقل نموذج أولى</td>
		</tr>
<tr>
<td>مجموعة الفضاء للتخلص التدريجي</td>
			<td>C2</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>أبعاد الخلية</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>أ، ب، ج ()</td>
			<td>83.74، 42.18، 95، 82</td>
			<td>42.19، 83.72، 95,82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Α، Β، Γ (°)</td>
			<td>90, 90.03, 90</td>
			<td>90، 90، 90</td>
		</tr>
<tr>
<td>نموذج بحث للسيد (PDB)</td>
			<td>3KLR</td>
			<td>3KLR</td>
		</tr>
<tr>
<td>جزيئات البروتين/جامعة ولاية أريزونا</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>بقايا البروتين</td>
			<td>250</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rالعمل/Rالحرة (%) بعد التنقيح 1</td>
			<td>24.3/26.5</td>
			<td>20.4/23.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>رمسد بوند طول (Å) بعد التنقيح 1</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>رمسد بوند زاوية (°) بعد التنقيح 1</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>روتامير الخارجة (%) بعد التنقيح 1</td>
			<td>1.07</td>
			<td>4.29</td>
		</tr>
<tr>
<td>راماشاندران يحبذ/السماح/غير مسموح به (%) بعد التنقيح 1</td>
			<td>95.93/4.07/0</td>
			<td>95.12/4.88/0</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: إحصاءات جمع، والصقل، والتحقق من صحة البيانات حيود الأشعة السينية- يتم إعطاء قيم لشل القرار أعلى بين قوسين معقوفين.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig1.jpg"> رقم 1: نموذج تحليل قبل جمع البيانات- (أ) المنطقة المحددة للمسح الضوئي ويتضح من مربع أحمر. (ب) تحليل الصور حيود يظهر كخريطة حرارة. واختيرت أربعة مناصب داخل البلورة يقع لجمع البيانات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig2.jpg"> رقم 2: التحقق من الصحة البصرية من خرائط كثافة الإلكترونات التي تم الحصول عليها بعد الصقل. خرائط كثافة الإلكترونات أحيط 2 x مستوى التربيعي حول () Trp143، (ب) Val66 (إيل في جكش البشرية)، و (ج) Glu98 (آسيا والمحيط الهادئ في جكش البشرية) وخرائط أحيط في 1 x مستوى r.m.s حول (د) Phe149 (لوي في جكش البشرية) و (ه) Lys125 (آسيا والمحيط الهادئ في جكش البشرية). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules at JoVE.com

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

توصيف مستقلة تماما وجمع البيانات من بلورات جزيئات البيولوجية

وهنا، نحن تصف كيفية استخدام الفرز الآلي وخيارات جمع البيانات المتاحة في بعض بيملينيس السنكروتروني. العلماء إرسال عينات كريوكوليد إلى السنكروتروني، ويتم فحص خصائص الحيود ومجموعات البيانات التي تم جمعها ومعالجتها و، حيثما أمكن، حل هيكل ينفذ — كل ذلك دون تدخل بشري.

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

التصوير البلوري بالأشعة السينية هو الأسلوب السائد لتحديد المعلومات الهيكلية ثلاثية الأبعاد من البروتينات. وهناك حاجة إلى خطوط شعاع السنكروترون للحصول على البيانات من بلورات صغيرة ضعيفة التألق تنتج البروتينات. ضخمة واحدة هو خط شعاع فريدة من نوعها لأنه بأتمتة عملية جمع البيانات من الجزيئات البيولوجية.من تركيب العينات والموقع وجمع البيانات النهائية. الأتمتة الكاملة من هذا النوع مهم جدا لأنه يسمح للباحثين لقضاء وقتهم في المختبر، بدلا من جمع البيانات على خط شعاع. خط الحزم هو أيضا ذكي وفي المتوسط، يمكن جمع بيانات أفضل مما كانت عليه عندما يتم تشغيل خط شعاع من قبل البشر.لبدء هذا البروتوكول، تنفيذ الكريستال تركيب وطلب وقت شعاع على واحد ضخمة كما هو موضح في بروتوكول النص. انتقل إلى نظام المعلومات لخطوط شعاع البلورات البروتين، أو موقع ISPyB. اختر تجارب MX، سجل الدخول باستخدام رقم التجربة وكلمة المرور.انقر على الشحن، إضافة جديدة، وتقديم المعلومات اللازمة. ثم انقر فوق حفظ. انقر فوق إضافة قطعة أرض، وملء المعلومات المطلوبة.انقر فوق حفظ، ثم انقر فوق إضافة حاوية. إعطاء الباركود عفريت كما اسم، واختيار عفريت العمود الفقري، انقر مرة أخرى حفظ. انقر على رمز الحاوية وتحريرها، وملء المعلومات اللازمة بشأن عينات مثل اسم البروتين، تدفق العمل المفضل، وموقف الكريستال، في عفريت.اختر البروتين الذي تمت الموافقة عليه من قبل مجموعة السلامة ESRF. أدخل اسم نموذج فريد لتعريف كل عينة على حدة. اختياريًا، قم بمسح الباركود الخاص بالدبابيس.بقية المعلومات التي تريد تضمينها اختيارية أيضاً. لكل عينة على حدة، أدخل نوع التجربة. وهذا يحدد أي سير العمل التلقائي سوف تستخدم لمعالجة كل بلورة.وبالنظر إلى أن بلورات GCSH هي إبر، اختر MX الصحافة P.Next، أدخل مجموعة الفضاء. إذا كان موجوداً، سيتم استخدام هذا الحساب استراتيجية تجميع البيانات، وبالبيانات معالجة خطوط الأنابيب التلقائية المتاحة. أدخل الدقة المطلوبة.وهذا يحدد المسافة البلورية إلى جهاز الكشف عن الشبكات الأولية، والتوصيف، وجمع البيانات الافتراضية. الآن، تعيين دقة عتبة المطلوب لمنع جمع مجموعات البيانات الكاملة من بلورات التي لا diffract إلى هذا الحد. وهذا يمكن أن يوفر مساحة تخزين البيانات ويحلل الوقت.تعيين الاكتمال المطلوبة. ثم تعيين التعدد المطلوب. إذا تم احتواء أكثر من بلورة واحدة على دعم العينة، تعيين الحد الأقصى لعدد البلورات ليتم تحليلها.القيمة الافتراضية هي واحد أو خمسة لـ MX اضغط P.ويمكن أيضاً تحديد حجم الحزمة المناسبة. ضع في مجموعة الفضاء، إذا كان معروفا، في قوة الفضاء العمود المجموعة. ثم تعيين حساسية الإشعاع من البلورات.إذا رغبت في ذلك، تعيين زاوية الدوران الإجمالية التي سيتم جمعها لجمع مجموعة البيانات الكاملة. بمجرد إدخال كافة المعلومات في النظام، قم بحفظ القيم. انقر على، والعودة إلى الشحنات والصحافة إرسال شحنة إلى ESRF.طباعة تسمية الشحن وإرسال العينات. يجب على المستخدمين ترتيب التقاط مع ساعي باستخدام تفاصيل حساب ESRF. في يوم التجربة، يتم نقل العينات إلى ضخمة واحدة قدرة عالية الندى- er.ثم يقوم علماء خط الحزم بإطلاق مجموعة البيانات، التي يمكن أن يتبعها المستخدمون عن بعد. بالنسبة لكل نوع عينة مختلف، يتلقى المستخدمون بريدًا إلكترونيًا لإعلامهم بأن جمع البيانات قد بدأ. تنفيذ كافة الخطوات في كافة مهام سير العمل يمكن اتباعها عبر الإنترنت وفي الوقت الحقيقي.هذا هو الوصول إلى المستخدم عن طريق تسجيل الدخول إلى ISPyB. ويمكن أيضا أن النتائج يمكن الاطلاع عليها وتنزيلها. لكل عينة تم تحليلها، قم بفحص نتائج التجربة التلقائية على ISPyB.انقر على الدورة التجريبية المطلوبة في ID30A1. حدد خط أنابيب المعالجة التلقائية المفضل. قم بتنزيل البيانات المكتوبة في مجموعة المساحة الصحيحة بأعلى درجة من الاكتمال وأعلى دقة.بالنقر على آخر نتائج جمع ثم تحميل. تم استخدام تدفق العمل الصحافة MX P من قبل خط شعاع ESRF ضخمة واحدة لتركيب تلقائيا بشكل كامل، مركز في شعاع الأشعة السينية، وتوصيف، وجمع مجموعات البيانات الحيود الكامل من سلسلة من بلورات GCSH الإنسان. تم تركيب العينات وتحليل الحلقة لمنطقة لمسحها ضوئيًا.وبعد تحليل الحيود، تم اختيار أربع نقاط داخل البلورة لجمع البيانات. وقد أسفر تحديد الهيكل اليدوي عن طريق الاستبدال الجزيئي عن خريطة كثافة الإلكترون عالية الجودة بعد دورة صقل آلية واحدة. بالنسبة لمجموعة البيانات هذه، قطع خط الأنابيب الآلي البيانات عند نقطة واحدة ثلاثة اثنين من قرار angstrom.ومع ذلك، يمكن للمستخدمين أن يقرروا خفض البيانات بدقة أقل. كثافة الإلكترون المستمر مرئية لسلسلة الأحماض الأمينية بأكملها وبصرف النظر عن eterminal الهستيدين العلامة. من التبديلات الأربعة التي تميز الإنسان و GCSH البقري، ثلاثة يمكن التعرف عليها بسهولة في كثافة الإلكترون.هذا أقل وضوحا بالنسبة للحمض الأسبارتيك لاستبدال ليسين 125. ل أيّ الإلكترون كثافة من ال جانب سلسلة يكون فقط جزئيّا يحلّ واجبة إلى مرونة. النموذج الذي تم الحصول عليه حاليا لديه قيمة العمل R من 20 نقطة أربعة في المئة وقيمة R الحرة من 23 نقطة ثمانية في المئة ويمكن تحسينها بشكل أكبر من خلال دورات إضافية من بناء نموذج الآلي واليدوي والصقل.من المهم أن تُصمم المتطلبات وفقًا للنظام. على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي تعيين الدقة التي تمت ملاحظتها بالفعل إلى قيمة معروفة إلى توفير الوقت وضمان جمع بيانات أفضل. وقد تم جمع البيانات التلقائي بالكامل إضفاء الطابع الديمقراطي على علم البلورات والآن حتى مختبرات صغيرة يمكن الشروع في المشروع الشهير عندما كان هذا ممكنا من قبل فقط مع قوة الرجل هائلة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS للمتعمقة توصيف والكمي لالجلوتامين والهليونين نزع الأميد في البندقية البروتيوميات

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

الجريزوفولفوغرافيا من بلورات البروتين و<em&gt; في سيليولو</em&gt; الانعراج

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

الدراسات الهيكلية "للجزيئات الكبيرة" في الحل باستخدام "تبعثر الأشعة السينية زاوية صغيرة"

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

توصيف الناقلات غشاء بواسطة تعبير مغاير في كولاي وإنتاج الحويصلات الغشائية

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

KRAS4b المؤتلف المجهزة بالبالكامل: عزل وتوصيف البروتين فارنيسلاتيد وميثيل

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

اشتقاق بلورات البروتين مع I3C باستخدام عشوائي Microseed مصفوفة الفرز

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

تحسين نمو بلورات الإندوثيابسين لتجارب علم البلورات التسلسلي

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

مجموعة بيانات تسلسلية هدف ثابت في مصدر ضوء الماس

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

RIBO-seq في البكتيريا: مجموعة عينة وبروتوكول إعداد المكتبة لتسلسل NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

إعادة تشكيل نشاط استخراج Msp1 مع مكونات منقى بالكامل

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...