Name: fully autonomous characterization and data collection from crystals of biological macromolecules
Uploaded: 2019-03-22T12:30:00
Duration: 7 min 11 s
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作者感谢 ESRF 的时间。

注: GCSH 的生产、纯化和结晶在补充文件 1中进行了描述。
1. 离线准备和晶体安装的简要说明
<ol><li>将尼龙环路或另一个已固定在谱引脚上的晶体放置在一个或多个晶体下, 并将其从沉淀溶液中取出 (20μl 0.5 M 甲酸钠 pH 值 4.0 + 25μl 的蛋白质溶液)。<ol>
<li>用纸灯芯触摸安装物, 吸走任何多余的液体, 将晶体周围的散装液体取出。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将晶体浸泡在含有沉淀溶液加30% 甘油的低温保护溶液中;然后, 取出晶体支架和晶体。<ol>
<li>用纸灯芯触摸安装物, 吸走任何多余的液体, 将晶体周围的散装液体取出。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将安装在一个充满液氮的 SPINE 小瓶中, 并将其与任何其他类似准备的晶体一起存放在欧洲分子生物学实验室 (EMBL)/esrf 样品转换器9在液氮温度下。 注: 在这种情况下, 晶体是稳定的, 直到波束时间可用。</li>
</ol>2. 请求在 MASIF-1 上的波束时间
<ol><li>尽早在 ESRF 主页上 (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying) 请求波束时间。 注: 有许多可能的模式访问 ESRF MX 波束线。实验室可以作为块分配组 (BAG) 的一部分集体申请, 以便将时间分配给2年。如果团体希望单独申请, 他们可以申请滚动访问, 这允许他们在同行评审后快速访问波束线。该小组的建议将由 ESRF 安全小组审查和批准, 该小组可能会要求提供更多细节。如果建议被接受, 将发送实验编号和密码。专有的研究可以通过购买波束时间来进行。</li>
	<li>在线完成所需的安全培训 (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining)。</li>
	<li>在 MASIF-1 日历上预订波束时间。 注: 每个班次最多可以预订50个样品持有人进行分析。</li>
	<li>填写a 表,声明要测量的样品的邮寄实验 (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) 以及所需的安全信息。</li>
</ol>3. 在 ISPyB 中创建衍射计划
注: 衍射计划保存 ISPyB 中样品所需的所有信息, 并可以包含其他信息, 以定制为每个样品所做的实验。
<ol><li>打开 ISPyB (https://exi.esrf.fr/)。</li>
	<li>选择Mx 实验。</li>
	<li>使用实验编号和密码登录。</li>
	<li>点击货件添加新信息并提供必要的信息。单击 "保存"。</li>
	<li>单击 "添加包裹" 并填写所需信息。单击 "保存"。</li>
	<li>然后, 单击 "添加容器", 将 puck 条形码作为名称, 然后选择"spine puck"。单击 "保存"。</li>
	<li>点击容器符号和编辑, 并填写必要的信息, 如蛋白质名称, 首选工作流程, 水晶位置在皮球等, 有关样品。</li>
	<li>选择经 ESRF 安全组批准的蛋白质 (例如 GCSH 或溶菌酶)。</li>
	<li>输入唯一的示例名称以标识每个单独的示例。可以选择扫描引脚条形码。下面的其余信息是可选的。</li>
	<li>输入可选信息。<ol>
<li>对于每个单独的样本, 请在Exp.type 下输入实验类型 (即 MXPRESSE _ SAD、Score、score 等、默认 mxpresse 等)。这定义了将使用哪种自动工作流来处理每个晶体。鉴于 GCSH 晶体是针头, 请选择mxpressp。</li>
		<li>输入空间组 (例如, P1、C2 或 P2 1 2 2 21)(如果已知).如果存在, 这将用于数据收集策略计算和可用的自动数据处理管道。</li>
		<li>输入所需的分辨率 (默认值: dmin = 2.0)。这定义了初始网格扫描、表征和默认数据收集的晶体到检测器距离。</li>
		<li>设置所需的阈值分辨率 ( 例如 , 1 . 5 或 2 . 3 ) , 以防止从不偏离此限制的晶体中收集完整的数据集。这可以节省数据存储空间和分析时间。</li>
		<li>设置所需的完整性 (默认值: 0.99)。设置所需的多样性 (默认值: 4). 如果样品支架上包含多个晶体, 请设置要分析的晶体的最大数量。对于 MXPressP, 默认值为1或5。</li>
		<li>选择适当的光束尺寸 (默认值: 50μm)。如果未选择特定值, x 射线居中和数据收集策略计算将以50微米的光束大小执行。 注: 在随后收集完整数据集的过程中, 光束大小将自动调整。</li>
		<li>将空间组 (如果已知) 放在强制空间组列中。设置晶体的辐射灵敏度 (低至高灵敏度为 0.5–2.0, 默认值为 1)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>如果需要, 请为完整的数据集集合设置要收集的总旋转角度 (默认情况: 由 eEDNA 确定的总旋转角度)。</li>
	<li>保存值。点击返回发货。按"将货件发送到 ESRF"。</li>
	<li>打印装运标签并发送样品。用户应使用 ESRF 帐户详细信息与快递员安排取件。 注: 选择"包括返回标签" 以允许无缝返回样品非常重要 (请参见 https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement)。</li>
</ol>4. 数据收集、查看和检索
注: 在实验当天, 样品被转移到 MASIF-1 高容量杜瓦 (HCD)。Beamline 科学家随后启动了数据收集, 用户可以远程跟踪数据收集。对于每个不同的示例类型, 用户都会收到一封电子邮件, 通知他们数据收集已开始。如前所述, 用户可以通过ispyb 在线和实时地执行所有工作流中的所有步骤, 并从中查看和下载结果。
<ol><li>对于分析的每个样本, 请检查 ISPyB (https://exi.esrf.fr/) 中的自动实验结果。<ol>
<li>登录, 使用实验编号和密码, 然后单击所需的实验会话Id30a-1。</li>
		<li>选择首选 (得分最高) 自动处理管道 (例如, Grenades 或 XDS _ APP), 并通过单击 "最后收集结果" 来下载在具有最高完整性和最高分辨率的正确空间组中写入的数据, 然后,然后,下载。 注: 所有网格、线条和特征图像都位于每个示例的子目录中, 称为/MXPressE_01。ESRF 自动运行五个独立的处理包, 即 EDNA _proc 12、grades 12、XDS _ app14、自动 PROC15和 xiaa216.数据集成基于 XDS, 但 XIA2 除外, 它基于 DIALS。所有包也都在异常和非异常模式下运行, 允许自动检测数据中存在的异常信号 (如果存在于数据中), 以便在 sad 相位协议中使用。每个包使用不同的参数和决策树, 这意味着某些包在某些示例中运行得更好。但是, 在考虑包和可能的空间组的数量时, 这可能会产生大量的结果。因此, 结果大致基于分辨率和其他质量指标 (如分辨率最低的外壳中的 R合并、CC(1/2) 和完整性进行排名。这样做的目的是引导用户获得最好的数据集, 但所有可能的空间组和结果都应仔细检查。</li>
	</ol>
</li>
	<li>解压缩下载的文件夹, 其中将包括所有日志文件和未合并的 XDS _ ASCII。HKL 和合并和缩放. mtz 文件。 注: 如果感兴趣的蛋白质的结构 (PDB 格式) 或紧密同源物在实验开始时被上传到 ISPyB, ESRF 的自动处理管道将自动执行使用此结构作为搜索模型上的最佳评分解决方案。MR 管道的结果显示在 ISPyB 中, 并可在处理的数据文件夹中找到 (例如,/data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_mrpipe _ dir/1.)。在这里, 最终的模型将被命名为 coot1. pdb 和反射数据 sidechains. mtz。请注意, 管道可能会降低单元的对称性 (原始细胞还原), 以增加找到解的可能性。在这里的案例中, MR 管道将溶液写在单斜细胞 (C2) 中, 而不是在正交细胞 (C2221) 中。有关如何手动执行分子替换运行的详细信息 (以第二最佳得分自动处理解决方案为例) 包含在补充文件中。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hui, R., Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+protein+crystallization.">High-throughput protein crystallization.</a> Journal of Structural Biology. 142 (1), 154-161 (2003).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASSIF-1:+a+beamline+dedicated+to+the+fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).</li><li>Svensson, O., Malbet-Monaco, S., Popov, A., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">Fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (8), 1757-1767 (2015).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrystalDirect:+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films.">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68, 1393-1399 (2012).</li><li>Nurizzo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RoboDiff:+combining+a+sample+changer+and+goniometer+for+highly+automated+macromolecular+crystallography+experiments.">RoboDiff: combining a sample changer and goniometer for highly automated macromolecular crystallography experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (8), 966-975 (2016).</li><li>Bowler, M. W., Svensson, O., Nurizzo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automatic+macromolecular+crystallography:+the+impact+of+MASSIF-1+on+the+optimum+acquisition+and+quality+of+data.">Fully automatic macromolecular crystallography: the impact of MASSIF-1 on the optimum acquisition and quality of data.</a> Crystallography Reviews. 22 (4), 233-249 (2016).</li><li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography.">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li><li>Svensson, O., Gilski, M., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-position+data+collection+and+dynamic+beam+sizing:+recent+improvements+to+the+automatic+data-collection+algorithms+on+MASSIF-1.">Multi-position data collection and dynamic beam sizing: recent improvements to the automatic data-collection algorithms on MASSIF-1.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74, 433-440 (2018).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB:+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Monaco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+processing+of+macromolecular+crystallography+X-ray+diffraction+data+at+the+ESRF.">Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).</li><li>Kikuchi, G., Motokawa, Y., Yoshida, T., Hiraga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+cleavage+system:+reaction+mechanism,+physiological+significance,+and+hyperglycinemia.">Glycine cleavage system: reaction mechanism, physiological significance, and hyperglycinemia.</a> Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and Biological Sciences. 84 (7), 246-263 (2008).</li><li>Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDSAPP2.0.">XDSAPP2.0.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).</li><li>Vonrhein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+and+analysis+with+the+autoPROC+toolbox.">Data processing and analysis with the autoPROC toolbox.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xia2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Higashiura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+X-ray+crystal+structure+of+bovine+H-protein+at+0.88+&#197;+resolution.">High-resolution X-ray crystal structure of bovine H-protein at 0.88 &#197; resolution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (6), 698-708 (2010).</li><li>Sanishvili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+7+&#181;m+mini-beam+improves+diffraction+data+from+small+or+imperfect+crystals+of+macromolecules.">A 7 &#181;m mini-beam improves diffraction data from small or imperfect crystals of macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (4), 425-435 (2008).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffraction+cartography:+applying+microbeams+to+macromolecular+crystallography+sample+evaluation+and+data+collection.">Diffraction cartography: applying microbeams to macromolecular crystallography sample evaluation and data collection.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (8), 855-864 (2010).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+Experience+of+Controlled+Crystal+Dehydration:+Results+from+the+European+Synchrotron+HC1+Collaboration.">Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration.</a> Crystal Growth &amp; Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+harvesting+and+processing+of+protein+crystals+through+laser+photoablation.">Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

全自动波束线可提供从大量大分子晶体中自动表征和收集数据, 而无需科学家, 无论是在波束线还是远程。与手动操作相比, 使用全自动波束线具有许多优点。例如, 基于 x 射线网格和线扫描的自动采样中心比人眼的自动采样中心更精确, 因为它不受热或光学影响。事实上, 这些网格和线扫描提供了额外的数据 (即晶体的详细尺寸和晶体的最佳衍射区域), 这些数据对于确定用于数据收集的正确光束大小非常重要, 尤其是对于小晶体而言18--通常会提高所获得的衍射数据的质量。此外, 在自动实验的设置中, 利用用户定义的参数, 可以根据所研究的系统量身定制特定工作流程中的步骤, 从而进一步优化实验成功率。
综合来看, 可用工作流的可靠性、对波束线的直接访问 (用户自计划, 使用日历 [见上文]), 以及 MASSIF-1 的全自动方法提供了严格、高吞吐量和节省时间的方法替代经典的实际操作 MX 实验, 并有可能将更高级的过程和应用程序实现到自动工作流中。在不久的将来, 将在 3D19中进行晶体制图, 以提高 x 射线中心的精度, 而更复杂的协议, 如晶体脱水实验20, 将实现自动化。希望完全自主的数据采集将成为 MX 的标准方法, 为小分子片段屏幕提供高质量的数据, 优化大量衍射不良晶体的筛选, 并自动提供相位信息来解决新的晶体结构问题。结合在自动收获的 21晶体的发展, 蛋白质晶体结构解决方案作为一种自动化服务的可能性很可能成为现实。

确定特定蛋白质的三维结构在生物学中是至关重要的。由此获得的信息揭示了所研究的分子中的生物功能以及活性和结合位点的形状和特异性。在许多情况下, 这使得可以确定作用机制, 或酌情开发潜在的治疗分子。MX 是获取结构信息最常用的技术, 但瓶颈是确定最佳条件以获得良好的衍射晶体。因此, 结晶试验是在许多不同的条件下进行的, 然后进行筛选, 以找到用于衍射数据收集的最佳晶体。结晶试验设置的自动化 1在这方面显然有帮助。但是, 后续步骤 (即晶体安装、衍射筛选和衍射数据收集) 通常是手动执行的, 需要大量的时间、精力和资源。因此, 衍射筛选和数据收集的自动化将意味着在时间和效率上的巨大增长。
MX 中的衍射筛选和数据收集通常是在同步加速器 MX 波束线上进行的, 在同步加速器 mx 波束线上, 自动化在很大程度上促进了这一过程。然而, 在大多数情况下, 科学家在实验期间有必要出现在波束线上, 或者远程操作。最近, 新一代的全自动 MX 波束线已经开发2。在这里, 用户不需要在实验会话期间进行物理或远程演示。这使得科学家可以花更多的时间在较少的日常工作上, 而不是花一整天, 而且往往是晚上, 筛选晶体和收集衍射数据。世界上第一条全自动波束线是欧洲同步辐射设施 (esrf) 的大规模自动样品选择综合设施 (massif-1, id30a-1)2,3 。它有一个独特的样品环境, 其中一个大容量的含样品 dewar 与一个机器人样品转换器一起运作, 该转换器也充当波束线的测角仪 4,5。MASIF-1 是一种配备单光子计数混合像素探测器6 的波动器波束线, 其固定波长为 0.69 (12.84 kev), 具有强烈的 x 射线光束 (2 x10 12个光子)。在样品位置的光束尺寸可以在最小 10μm (圆形光束) 之间调整为最大 100μm x 65μm (水平由垂直光束尺寸)。平均而言, 波束线可以在24小时内以完全自动的方式处理120颗晶体 (见下文)。波束线的操作基于一系列工作流 7, 每个工作流都根据工作流中前面步骤的结果做出明智的决策, 以确保测量所研究样本中尽可能好的数据。特别是, 对单个样品的衍射特性的评估考虑到了晶体体积和通量, 并确保在晶体大于 x 射线光束的情况下, 仅将晶体的最佳区域用于后续数据收集。因此, 衍射数据集经过优化, 可实现最大分辨率, 最大限度地减少辐射损伤2,3。还提供了苛刻的数据收集协议, 例如用于原生和单波长异常衍射 (SAD) 数据收集的伪螺旋 (多位置) 数据收集策略.
MASIF-1 的全自动实验包括在磁性样品安装上进行冷冻冷却和安装晶体, 该磁样安装适用于所需的波束线设备标准引脚别别别别别别别。计划 "蛋白质晶体成像波束线集成系统 (ISPyB)10" 中的表格, 这是一个用于 mx 实验的基于 web 的信息管理系统, 并将样本发送到波束线。在 ESRF, 从波束线传输样品的所有费用都由 ESRF 用户办公室支持 (详情见 ESRF11的网站)。在 MASIF-1, 对环路尺寸或晶体质量没有任何限制。为给定晶体选择衍射计划时, 用户可以使用默认设置, 也可以从特定工作流中进行选择, 这些工作流可以为每个样本进行自定义。有几个预编程的工作流可用。在Mxpresse3工作流中, 包含采样的环路首先使用光学居中与采样位置对齐。然后, 基于 x 射线的中心确保晶体的最佳区域以 x 射线光束为中心。然后使用 eEDNA 计算数据收集策略, eEDNA 是开发基于插件的应用程序的框架, 特别是用于 x 射线实验领域的在线数据分析, 同时考虑到晶体体积和波束线上的实时通量。在收集了完整的衍射数据集之后, 然后使用一系列自动数据处理管道12 对其进行处理, 并将结果提供给 ISPyB 中的检查和下载。Mxpressesad 3工作流程旨在针对目标蛋白中含有硒硫氨酸的晶体, 并利用 masif-1 的工作能量正好高于 se k 边缘的事实。在这里, MXPressE eEDNA 数据收集策略针对 SAD 数据收集进行了优化 (即高冗余, 并将分辨率设置为 Bijvoet 对之间的 R合并低于5% 的位置)。为了在不收集后续数据的情况下筛选一系列晶体的衍射特性,可以使用 Mxscore3工作流程对所分析的晶体进行全面的质量评估。在Mxpressi3工作流中, 使用0.2°振荡和启动 phi 角收集180°旋转数据, 并使用 eedna 策略确定的分辨率。Mxpresso3包括工作流中的预观察分辨率 (默认值: dMin = 2)。为了对结晶试验产生的晶体进行初步评估,提供了 MXPressM工作流程。这将在最广泛的样品支持方向上执行高剂量网格扫描, 而无需收集数据或居中。最近, 两个新的实验工作流, Mxpressp 和 mxpressp _ sad,执行伪螺旋数据收集, 已经实现8。用户可以通过 ISPyB 在线和实时地执行所有工作流中的所有步骤。
在这里, 我们展示了如何准备一个完全自动化的 MX 实验在 MASIF-1, 以及如何检索和分析从实验产生的数据。例如, 我们使用人类线粒体甘氨酸裂解系统蛋白 H (GLYCINE)。这种含脂酸蛋白是甘氨酸裂解系统的一部分, 负责甘氨酸的降解。该系统还包括 P 蛋白、吡咯烷酮依赖的甘氨酸脱羧酶、T 蛋白、四氢叶酸所需酶和 L 蛋白 (脂胺脱氢酶)。GLYCINE 将丙氨酸的甲胺基团从 P 蛋白转移到 T 蛋白。H 蛋白的缺陷是人类非酮症高血糖 (NKH) 的原因,13。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline MASSIF-1</td>
			<td>ESRF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21DE3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzing membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>132655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loop</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MonoQ 5/50 GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5166-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINE pucks</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CSM003-0001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1064430500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCSH purification buffer</td>
			<td>20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCSH cryo-protection buffer</td>
			<td>0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MxCube</td>
			<td></td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCube2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES workflow server</td>
			<td></td>
			<td>Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLISS beamline control</td>
			<td></td>
			<td>Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AUTO processing of images</td>
			<td></td>
			<td>Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEST and EDNA</td>
			<td></td>
			<td>Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phaser MR</td>
			<td></td>
			<td>McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td></td>
			<td>Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refmac5</td>
			<td></td>
			<td>Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240--255 (1997).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matthews</td>
			<td></td>
			<td>Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully autonomous characterization and data collection from crystals of biological macromolecules

高亮度 x 射线光束加上自动化, 导致使用基于同步的大分子 x 射线晶体学 (MX) 波束线, 即使是结构生物学中最具挑战性的项目。然而, 大多数设施仍然需要有科学家在场进行实验。最近开发了新一代的自动波束线, 专门用于生物大分子晶体的全自动表征和数据收集。这些波束线代表了一种新的工具, 用于结构生物学家筛选初始结晶试验的结果和收集大量的衍射数据集, 而无需用户控制波束线本身。在这里, 我们展示了如何建立一个实验, 自动筛选和数据收集, 实验是如何在波束线上进行的, 如何处理由此产生的数据集, 以及在可能的情况下如何解决生物大分子的晶体结构。

在 ESRF 波束线 MASIF-1 中使用了 MXPressP 工作流, 可在 x 射线光束中完全自动安装、居中, 对人类 GCSH 晶体的一系列晶体进行表征和收集完整的衍射数据集。安装了样本并分析了要扫描的区域的循环 (图 1, 左)。在衍射分析之后, 在晶体中选择了四个点进行数据收集 (图 1, 右)。通过自动数据分析管道 (包括 MR 管道) 进行后续处理, 生成了高质量的数据集 (表 1), 并找到了其中的 mr 解决方案。后者允许用户快速评估所获得的数据集和使用的搜索模型是否适合通过分子替换进行阶段替换。此外, 还可以判断配体的存在, 从而使用户能够只关注最有希望的数据集, 以便进一步分析。通过 mr 进行的手动结构测定在一个单一的自动细化周期后产生了高质量的电子密度图 (图 2a)。对于此数据集 , 自动管道以 1 . 32 分辨率剪切数据 ;但是, 用户仍然可以决定以较低的分辨率剪切数据, 以获得不同的质量统计 (cc-一半, meas) 在最高分辨率外壳中。人类 GCSH 结构的晶体结构与牛蛋白 (3KlR)16相似。
除了 n 端组氨酸标记外, 整个氨基酸链都可以看到连续电子密度。在区分人和牛 GCSH 的四个替代品中, 有三个在电子密度中很容易识别 (Ile/Val66、Aspce/glu98 和 Leu/phh149;图 2b-d)。对于由于灵活性而只部分解决了侧链的电子密度的 Aspc-lys125 替代, 这一点不太明显 (图 1e)。目前得到的模型具有 R工作和r 自由值分别为20.4% 和 23.8%, 并可通过进一步的自动化和手动模型构建和细化周期进行进一步优化。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>GRENADES 管道</td>
			<td>XDS _ APP 管道</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">数据收集和处理</td>
		</tr>
<tr>
<td>x 射线源/光束线</td>
			<td colspan="2">ESRA/MAASIF-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>波长 (A)</td>
			<td colspan="2">0.966</td>
		</tr>
<tr>
<td>分辨率 ()</td>
			<td>4.1.88–1.48 (1.53–1.48)</td>
			<td>41.86-1.32 (1.39-1.32)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">独特的反射</td>
			<td>127670/28644</td>
			<td>177332/40134</td>
		</tr>
<tr>
<td>(12178/2775)</td>
			<td>(23772/5714)</td>
		</tr>
<tr>
<td>用于索引、缩放和合并的空间组</td>
			<td>C222</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>单元格尺寸</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>a、b、c (A)</td>
			<td>42.20、83.75、95.85</td>
			<td>42.19、83.72、95、82</td>
		</tr>
<tr>
<td>马赛克</td>
			<td>0.05</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (%)</td>
			<td>10.0 (10.0)</td>
			<td>11.1 (198.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>< (i) ></td>
			<td>9.6 (1.3)</td>
			<td>7.6 (0.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC半(%)</td>
			<td>99.7 (53.9)</td>
			<td>99.7 (19.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>完整性 (%)</td>
			<td>99.6 (99.6)</td>
			<td>99.5 (99.6)</td>
		</tr>
<tr>
<td>多样性</td>
			<td>4.5 (4.4)</td>
			<td>4.4 (4.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">分子替代和初步模型细化</td>
		</tr>
<tr>
<td>用于相位的空间组</td>
			<td>C2</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>单元格尺寸</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>a、b、c (A)</td>
			<td>83.74、42.18、95.82</td>
			<td>42.19、83.72、95、82</td>
		</tr>
<tr>
<td>α、β、γ (°)</td>
			<td>90、90.03、90</td>
			<td>90、90、90</td>
		</tr>
<tr>
<td>MR (PDB) 的搜索模型</td>
			<td>3KLR</td>
			<td>3KLR</td>
		</tr>
<tr>
<td>蛋白质分子/ASU</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>蛋白质残留物</td>
			<td>250人</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td>R工作/无 ( %)在第一次细化之后</td>
			<td>24.3/26。5</td>
			<td>20.4/23。8</td>
		</tr>
<tr>
<td>第一次细化后的 RMSD 粘结长度 (A)</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>第一次细化后的 RMSD 粘结角度 (°)</td>
			<td>1。2</td>
			<td>1.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>旋转异常值 (%)在第一次细化之后</td>
			<td>1.07</td>
			<td>4.29</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ramachandran pulode/lovededed"不允许 (%)在第一次细化之后</td>
			<td>9.5.93/4.07/0</td>
			<td>95.12/4.88/0</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: x 射线衍射数据收集、细化和验证统计.最高分辨率外壳的值放在括号中。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig1.jpg"> 图 1: 数据收集前的示例分析.(a) 选择扫描的区域由一个红色框显示。(b) 衍射图像的分析显示为热图。在定位的晶体内选择了四个位置进行数据收集。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig2.jpg"> 图 2: 细化后获得的电子密度图的可视化验证.电子密度图的轮廓为 2x r. m. s. (a) trp143、(b) VAL66 (人类 Gcsh 中的伊莱) 和 (c) GLU98 (人类 gcsh 中的 asp) 和地图在 1x rm. s 水平左右, 在 (d) ph149(人类 gcsh 中的 leu) 和 (e)Lys125 (人类 GCSH 中的 Asp)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>

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Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

生物大分子晶体的完全自主表征及数据采集

在这里, 我们将介绍如何使用某些同步加速器波束线提供的自动筛选和数据收集选项。科学家将冷冻样品发送到同步加速器, 并对衍射特性进行筛选, 收集和处理数据集, 并在可能的情况下执行结构解决方案--所有这些都无需人工干预。

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

X射线晶体学是确定蛋白质三D结构信息的主要技术。需要同步加速器光束线才能从蛋白质产生的弱衍切晶体中获取数据。海量线是一条独特的光束线，因为它完全自动化了从生物大分子收集数据的过程。从样品安装、位置和最终数据收集。这种完全自动化是非常重要的，因为它允许研究人员在实验室里度过他们的时间，而不是在光束线上收集数据。光束线也是智能的，平均而言，可以收集比光束线由人类操作时更好的数据。要开始此协议，请执行晶体安装，并请求像文本协议中描述的大规模协议上的光束时间。导航到蛋白质晶体学光束线的信息系统，或 ISPyB 网站。选择 MX 实验，使用实验编号和密码登录。单击货件、添加新信息并提供必要信息。然后单击"保存"。单击添加宗地，并填写请求的信息。单击"保存"，然后单击"添加容器"。给冰球条形码作为名称，并选择脊柱冰球，再次点击保存。单击容器符号并编辑，并在冰球中填写有关样品的必要信息，如蛋白质名称、首选工作流程和晶体位置。选择经ESRF安全小组批准的蛋白质。输入唯一的示例名称以标识每个示例。可选地扫描引脚条形码。要包含的其他信息也是可选的。对于每个单独的示例，输入实验类型。这定义了用于处理每个晶体的自动工作流程。鉴于 GCSH 晶体是针，请选择 MX 按 P.Next，输入空间组。如果存在，则用于数据收集策略计算，并由可用的自动数据处理管道。输入所需的分辨率。这定义了晶体到探测器与初始网格扫描、表征和默认数据收集的距离。现在，设置所需的阈值分辨率，以防止从晶体中收集完整的数据集，这些晶体不会扩散到此限制。这可以节省数据存储空间和分析时间。设置所需的完整性。然后设置所需的多重性。如果样品支持上包含多个晶体，请设置要分析的最大晶体数量。MX 压压 P 的默认值为 1 或 5。也可以选择适当的光束尺寸。将空间组（如果已知）放入力空间组列中。然后设置晶体的辐射灵敏度。如果需要，请设置要为完整数据集集合收集的总旋转角度。将所有信息输入系统后，保存值。单击，返回货件，然后按发送件到 ESRF。打印发货标签并发送样品。用户应使用 ESRF 帐户详细信息安排与快递员一起取件。在实验当天，样品被转移到大规模一大容量露水。然后，光束线科学家启动数据收集，用户可以远程跟踪。对于每种不同的示例类型，用户会收到一封电子邮件，通知他们数据收集已经开始。可以在线和实时执行所有工作流中的所有步骤。用户可以通过登录到 ISPyB 来访问此功能。还可以查看和下载结果。对于分析的每个样本，检查 ISPyB 上的自动实验结果。单击 ID30A1 上所需的实验会话。选择首选的自动处理管道。下载以最高完整性和最高分辨率在正确的空间组中写入的数据。通过点击最后收集结果，然后下载。ESRF 光束线大规模使用 MX 压波 P 工作流程，以完全自动安装、在 X 射线光束中居中、表征和从一系列人类 GCSH 晶体中收集完整的衍射数据集。对样品进行了安装，并分析了循环以进行扫描。衍射分析后，在晶体内选择了四个点进行数据收集。通过分子替换进行手动结构测定，经过一个自动化优化循环后，得出了高质量的电子密度图。对于此数据集，自动管道以一点三二焦虑分辨率削减数据。但是，用户可以决定以较低的分辨率剪切数据。连续电子密度是可见的整个氨基酸链，除了电子组织标签。在区分人类和牛GCSH的四种替代物中，有三种在电子密度中很容易识别。对于阿斯巴酸以125替代，这不太清楚。由于灵活性，侧链的电子密度仅部分解决。当前获得的模型具有 20 点 4% 的 R 工作值和 23 点 8% 的 R 自由值，可以通过自动和手动模型构建和优化的附加周期进一步优化。根据您的系统定制需求非常重要。例如，将已观察到的分辨率设置为已知值可以节省时间并确保更好的数据收集。全自动数据收集已经民主化的晶体学，现在即使是小实验室也可以开始著名的项目，当这是可行的之前，只有巨大的人的力量。

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