Name: fully autonomous characterization and data collection from crystals of biological macromolecules
Uploaded: 2019-03-22T12:30:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules at JoVE.com

Forfatterne takke ESRF for beamtime.

Bemærk: Produktion, rensning og krystallisation af GCSH er beskrevet i supplerende fil 1.
1. kort beskrivelse af offline forberedelse og crystal montering
<ol><li>Holdning en nylon sløjfe eller en anden krystal montering støtte allerede fastgjort til en RYGSØJLEN pinkode under en eller flere krystaller og løfte dem ud af nedbør løsning (20 µL af 0,5 M natrium formate pH 4,0 + 25 µL af protein løsning).<ol>
<li>Fjern bulk væsken omkring crystal(s) ved at røre ved mount med en papir væge at sutte off overskydende væske.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nyd crystal(s) i den cryoprotective løsning indeholdende nedbør løsning plus 30% glycerol; Fjern derefter både krystal støtte og crystal(s).<ol>
<li>Fjern bulk væsken omkring crystal(s) ved at røre ved mount med en papir væge at sutte off overskydende væske.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Styrte mount i en SPINE hætteglas fyldt med flydende kvælstof og gemme det, sammen med eventuelle andre krystaller på lignende måde tilberedt i en europæiske molekylærbiologiske laboratorium (EMBL) / ESRF prøve changer puck9 på flydende kvælstof temperatur. Bemærk: Crystal(s) er stabil i denne tilstand, indtil beamtime er tilgængelige.</li>
</ol>2. anmoder om beamtime på MASSIF-1
<ol><li>Anmode om beamtime så tidligt som muligt på ESRF hjemmeside (på http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying). Bemærk: Der er en række mulige former for adgang til ESRF MX beamlines. Laboratorier kan anvende kollektivt som en del af en blok tildeling gruppe (pose), at have beamtime fordelt i 2 år. Hvis grupper ønsker at anvende individuelt, kan de ansøge om rullende adgang, der giver dem hurtig adgang til beamlines efter peer review. Gruppens forslag bliver gennemgået og ryddet af gruppen ESRF sikkerhed, der kan anmode om yderligere oplysninger. Hvis forslaget accepteres, vil blive meddelt et eksperiment nummer og adgangskode. Farmaceutiske forskning, der kan udføres ved at købe beamtime.</li>
	<li>Fuldføre den krævede sikkerhed uddannelse online (på http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).</li>
	<li>Bog beamtime i MASSIF-1 kalenderen. Bemærk: Det er muligt at bestille til et maksimum på 50 prøve indehavere skal analyseres pr. Skift.</li>
	<li>Udfyld en formular til at erklære en mail-in eksperiment (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), sammen med de nødvendige sikkerhedsoplysninger for de prøver, der skal måles.</li>
</ol>3. oprettelse af en diffraktion plan i ISPyB
Bemærk: Diffraktion planen indeholder alle de oplysninger, der er nødvendige for en prøve i ISPyB og kan indeholde yderligere oplysninger for at skræddersy eksperimentet udføres for hver prøve.
<ol><li>Åbne ISPyB (på https://exi.esrf.fr/).</li>
	<li>Vælg MX eksperimenter.</li>
	<li>Log ind med eksperiment nummer og adgangskode.</li>
	<li>Klik på leverance | Tilføj ny og give de nødvendige oplysninger. Klik på Gem.</li>
	<li>Klik på Tilføj parcel og udfyld de krævede oplysninger. Klik på Gem.</li>
	<li>Klik derefter på Tilføj container, give puck stregkode som navnet, og vælg RYGSØJLEN pucken. Klik på Gem.</li>
	<li>Klik på container symbol og Rediger, og udfyld de nødvendige oplysninger, ligesom protein navn, foretrukne workflow, crystal position i puck m.v. vedrørende prøverne.</li>
	<li>Vælg den protein (for eksempel GCSH eller lysozym), der er blevet godkendt af ESRF sikkerhed gruppe.</li>
	<li>Angiv et entydigt prøve navn til at identificere hver enkelt prøve. Det er muligt at eventuelt scanne pin stregkode. Resten af nedenstående oplysninger er valgfri.</li>
	<li>Angiv de valgfrie oplysninger.<ol>
<li>For hver enkelt prøve, Angiv typen eksperiment (dvs., MXPressE_SAD, SCORE, eller MXPressO, osv., standard MXPressE) under Exp. Type. Dette definerer, hvilke automatisk arbejdsproces vil blive brugt til at behandle hver enkelt krystal. Da de GCSH krystaller er nåle, vælge MXPressP.</li>
		<li>Angiv en plads (for eksempel, P1, C2 eller P212121), hvis kendt. Hvis til stede, vil dette blive brugt til data indsamling strategi beregninger og ved automatisk databehandling rørledninger tilgængelige.</li>
		<li>Angiv den ønskede opløsning (standard: dmin = 2.0 Å). Dette definerer den krystal til detektor afstand til den oprindelige mesh scanninger, karakterisering og standard dataindsamling.</li>
		<li>Indstille ønskede tærskel opløsningen (f.eks 1,5 Å eller 2.3Å), at forhindre indsamlingen af fulde datasæt fra krystaller, som ikke diffract til denne grænse. Dette kan spare data opbevaring plads og analyse tid.</li>
		<li>Angive de påkrævede fuldstændighed (standard: 0,99). Angive de nødvendige mangfoldighed (standard: 4). Hvis mere end én krystal er indeholdt på prøve støtte, angive det maksimale antal krystaller der skal analyseres. Standardværdien er 1 eller 5 for MXPressP.</li>
		<li>Vælg den passende beam størrelse (standard: 50 µm). Hvis en bestemt værdi ikke er markeret, udføres X-stråle-centrering og data indsamling strategi beregninger med en stråle størrelse af 50 µm. Bemærk: Under alle efterfølgende indsamling af komplette datasæt, beam størrelse tilpasses automatisk.</li>
		<li>Sætte i gruppen plads hvis kendt, i kolonnen tvungen plads gruppen. Indstille stråling-følsomheden af krystaller (0,5-2,0 til lav eller høj følsomhed, med standardværdien 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hvis det ønskes, sætte den samlede rotationsvinkel skal indsamles for samlingen fulde datasæt (standard: den samlede rotationsvinkel bestemmes af eEDNA).</li>
	<li>Gem værdier. Klik på tilbage til forsendelser. Tryk på Send leverance til ESRF.</li>
	<li>Udskrive etiketten shipping og sende prøverne. Brugere bør arrangere en pickup med en kurer, ved hjælp af ESRF kontooplysninger. Bemærk: Det er meget vigtigt at vælge Medtag retur label til at tillade sømløs returnering af prøver (Se https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).</li>
</ol>4. dataindsamling, visning og hentning
Bemærk: På dag i eksperimentet, prøver er overført til MASSIF-1 høj kapacitet Dewar (HCD). Beamline forskerne derefter starte indsamling af data, som kan følges af brugere via fjernadgang. For hver forskellige prøvetypen modtager brugere en e-mail informere dem om, at dataindsamlingen er begyndt. Som tidligere bemærket, udførelse af alle trin i alle arbejdsprocesser kan følges online og i realtid af bruger via ISPyB, som resultaterne kan ses og downloades.
<ol><li>For hver prøve analyseres, undersøge resultaterne af den automatiske eksperiment i ISPyB (https://exi.esrf.fr/).<ol>
<li>Log ind, ved hjælp af eksperiment nummer og adgangskode, og klik på den ønskede eksperimentelle session på ID30A-1.</li>
		<li>Vælg den foretrukne (top-scoring) følgende rørledningen (f.eks granater eller XDS_APP) og downloade data skrevet i den korrekte plads gruppe med den højeste fuldstændighed og højeste opløsning ved at klikke på Sidste indsamle resultater , og derefter downloade. Bemærk: Alle mesh, line og karakterisering billeder er i en undermappe for hver prøve, kaldet /MXPressE_01. ESRF kører automatisk fem separate behandling pakker, nemlig EDNA_proc12, granater12, XDS_APP14, autoPROC15og XIA216. Dataintegration er baseret på XDS, med undtagelse af XIA2, som er baseret på ringer. Alle pakker er også køre i forfejlet og nonanomalous tilstande, så den automatiske registrering af en unormal signal, hvis det findes i dataene, der skal anvendes i SAD udfasning protokoller. Hver pakke bruger forskellige parametre og beslutningstræer, hvilket betyder, at nogle pakker køre bedre med visse prøver. Men dette kan gøre for et stort antal resultater, når antallet af pakker og mulige plads grupper tegner sig for. Resultaterne er, derfor, rangeret baseret nogenlunde på opløsning og andre kvalitet målinger, som RFlet i laveste opløsning shell, CC(1/2) og fuldstændighed. Dette har til formål at vejlede brugeren til de bedste datasæt, men alle mulige plads grupper og resultater skal kontrolleres omhyggeligt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Unzip den downloadede mappe, som vil omfatte alle logfiler og uflettede XDS_ASCII. HKL og flettede og skaleret .mtz filer. Bemærk: I tilfælde af struktur (i FBF format) af protein af interesse eller en tæt homolog blev uploadet til ISPyB i begyndelsen af eksperimentet, følgende rørledningen på ESRF vil automatisk udføre en molekylær udskiftning (MR) køres ved hjælp af denne struktur som den Søg efter model på den bedste scoring løsning. Resultaterne af hr. pipeline vises i ISPyB og kan findes i mappen behandlede data (for eksempel, /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ mrpipe_dir /). Her, vil den endelige model være navngivet coot1.pdb og refleksion data sidechains.mtz. Bemærk, at rørledningen kan reducere symmetrien i cellen (primitive celle reduktion) for at øge sandsynligheden for at finde en løsning. I tilfældet her skrev hr. pipeline løsning i en monoclinic celle (C2) og ikke i en ændres celle (C2221). Oplysninger om, hvordan du udføre en molekylær udskiftning køre manuelt (eksemplificeret for den anden bedst scoring følgende løsning) er inkluderet i de Supplerende filer.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hui, R., Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+protein+crystallization.">High-throughput protein crystallization.</a> Journal of Structural Biology. 142 (1), 154-161 (2003).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASSIF-1:+a+beamline+dedicated+to+the+fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).</li><li>Svensson, O., Malbet-Monaco, S., Popov, A., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">Fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (8), 1757-1767 (2015).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrystalDirect:+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films.">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68, 1393-1399 (2012).</li><li>Nurizzo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RoboDiff:+combining+a+sample+changer+and+goniometer+for+highly+automated+macromolecular+crystallography+experiments.">RoboDiff: combining a sample changer and goniometer for highly automated macromolecular crystallography experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (8), 966-975 (2016).</li><li>Bowler, M. W., Svensson, O., Nurizzo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automatic+macromolecular+crystallography:+the+impact+of+MASSIF-1+on+the+optimum+acquisition+and+quality+of+data.">Fully automatic macromolecular crystallography: the impact of MASSIF-1 on the optimum acquisition and quality of data.</a> Crystallography Reviews. 22 (4), 233-249 (2016).</li><li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography.">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li><li>Svensson, O., Gilski, M., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-position+data+collection+and+dynamic+beam+sizing:+recent+improvements+to+the+automatic+data-collection+algorithms+on+MASSIF-1.">Multi-position data collection and dynamic beam sizing: recent improvements to the automatic data-collection algorithms on MASSIF-1.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74, 433-440 (2018).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB:+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Monaco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+processing+of+macromolecular+crystallography+X-ray+diffraction+data+at+the+ESRF.">Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).</li><li>Kikuchi, G., Motokawa, Y., Yoshida, T., Hiraga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+cleavage+system:+reaction+mechanism,+physiological+significance,+and+hyperglycinemia.">Glycine cleavage system: reaction mechanism, physiological significance, and hyperglycinemia.</a> Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and Biological Sciences. 84 (7), 246-263 (2008).</li><li>Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDSAPP2.0.">XDSAPP2.0.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).</li><li>Vonrhein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+and+analysis+with+the+autoPROC+toolbox.">Data processing and analysis with the autoPROC toolbox.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xia2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Higashiura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+X-ray+crystal+structure+of+bovine+H-protein+at+0.88+&#197;+resolution.">High-resolution X-ray crystal structure of bovine H-protein at 0.88 &#197; resolution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (6), 698-708 (2010).</li><li>Sanishvili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+7+&#181;m+mini-beam+improves+diffraction+data+from+small+or+imperfect+crystals+of+macromolecules.">A 7 &#181;m mini-beam improves diffraction data from small or imperfect crystals of macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (4), 425-435 (2008).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffraction+cartography:+applying+microbeams+to+macromolecular+crystallography+sample+evaluation+and+data+collection.">Diffraction cartography: applying microbeams to macromolecular crystallography sample evaluation and data collection.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (8), 855-864 (2010).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+Experience+of+Controlled+Crystal+Dehydration:+Results+from+the+European+Synchrotron+HC1+Collaboration.">Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration.</a> Crystal Growth &amp; Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+harvesting+and+processing+of+protein+crystals+through+laser+photoablation.">Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Fuldautomatisk beamlines give automatiseret karakterisering og dataindsamling fra et stort antal makromolekylære krystaller uden tilstedeværelse af en videnskabsmand, enten på beamline eller fjernt, at der kræves. Ved hjælp af helt automatiseret beamlines har mange fordele i forhold til manuel betjening. For eksempel, automatiseret prøven centrering, baseret på X-ray mesh og line scanner, er mere præcise end der udføres med det menneskelige øje som påvirkes den ikke af termisk eller optiske effekter. Ja, disse mesh og linje scanninger give supplerende data (dvs. detaljerede dimensioner af krystal og de bedste diffracting region af krystal), hvilket er vigtigt ved fastsættelsen korrekte beam størrelse skal bruges til indsamling af data — især for små krystaller 18— og ofte resulterer i en forbedret kvalitet af dataene, opnået diffraktion. Desuden ved at drage fordel af de bruger-definerede parametre i opsætningen af automatiske eksperimenter, kan trin i specifikke arbejdsprocesser skræddersyes passer bedst til system under undersøgelsen, således yderligere optimering eksperiment succesrate.
At tage sammen, pålideligheden af de arbejdsprocesser, der er tilgængelige, enkel adgang til beamline (brugere selv planlægge, ved hjælp af en kalender [se ovenfor]), og den fuldt automatiserede tilgang af MASSIF-1 indeholder en streng, høj overførselshastighed og tidsbesparende alternativ til klassiske hands-on MX eksperimenter og potentiale til at gennemføre mere avancerede procedurer og ansøgninger i automatiske arbejdsprocesser. I den nærmeste fremtid, vil crystal kartografi i 3D19 gennemføres for at forbedre nøjagtigheden af X-ray centrering, mens mere komplekse protokoller, såsom crystal dehydrering eksperimenter20, vil blive automatiseret. Det er håbet, at fuldt autonome dataindsamling vil blive en standard metode i MX, leverer data af høj kvalitet til små-molekyle fragment skærme, optimere screeningen af stort antal dårligt diffracting krystaller og automatisk give fase oplysninger til at løse krystal strukturer de novo. I kombination med udviklingen i den automatiserede høst af krystaller21, muligheden for protein krystal struktur løsning som en automatiseret service kan blive en realitet.

Bestemmelse af den tre-dimensionelle struktur af specifikke proteiner er afgørende i biologi. De oplysninger, der er afledt fra gør så kaster lys over den biologiske funktion og form og specificitet af aktive og/eller bindende websteder indeholdt i molekylet under studiet. I mange tilfælde, dette giver virkningsmekanismer bestemmes eller eventuelt potentielle terapeutiske molekyler skal udvikles. MX er den mest almindeligt anvendte at opnå strukturelle oplysninger teknik, men en flaskehals er bestemmelse af de optimale betingelser til at opnå godt diffracting krystaller. Derfor, krystallisering forsøg udføres i mange forskellige forhold og er derefter screenes for at finde de bedste krystaller skal bruges til indsamling af diffraktion. Automatisering af opsætningen af krystallisering forsøg1 har helt klart hjulpet i denne henseende. Men de efterfølgende trin (dvs., krystal montering, diffraktion screening og diffraktion dataindsamling) udføres normalt manuelt, tager en masse tid, kræfter og ressourcer. Automatisering af diffraktion screening og dataindsamling ville derfor betyde en enorm gevinst i tid og effektivitet.
Diffraktion screening og dataindsamling i MX udføres oftest ved synkrotron MX beamlines hvormed automation har i høj grad lettet denne proces. I de fleste tilfælde er det dog nødvendigt for videnskabsmand til at være til stede på beamline under et eksperiment eller at betjene det fjernt. For nylig har en ny generation af fuldstændig automatiseret MX beamlines blevet udviklet2. Her, behøver brugere ikke at være til stede, enten fysisk eller fjernt, i løbet af en eksperimentel session. Det giver forskerne til at bruge mere tid på mindre rutineopgaver, snarere end at tilbringe hele dage, og ofte nætter, screening krystaller og indsamle diffraktion data. Verdens første fuldautomatiske beamline er massivt automatiseret prøve udvalg integreret Facility (MASSIF-1, ID30A-1)2,3 på europæiske synkrotron stråling facilitet (ESRF). Det har en unik prøve miljøet, en høj kapacitet prøve-holdige dewar opererer i tandem med en robot prøve skifter, der også fungerer som beamline's goniometer4,5. MASSIF-1 er en undulator beamline udstyret med en enkelt-foton-tælle hybrid pixel detektor6, der opererer på en fast bølgelængde af 0.969 Å (12.84 keV) med en intens X-ray stråle (2 x 1012 fotoner/s). Beam størrelse på positionen prøven kan justeres mellem et minimum af 10 µm (runde stråle) til et maksimum på 100 µm x 65 µm (vandret af lodrette beam størrelse). I gennemsnit kan beamline proces, i en helt automatisk mode (se nedenfor), 120 krystaller i 24 timer. Driften af beamline er baseret på en række arbejdsprocesser7, hvoraf hver tager intelligente beslutninger baseret på resultaterne af tidligere trin i arbejdsgangen, at sikre måling af de bedste mulige data fra eksemplet under undersøgelsen. Navnlig evalueringen af diffraktion Karakteristik af en individuel prøve tager konto krystal volumen og flux og sikrer, hvor Krystallen er større end den X-ray stråle, at kun den bedste område af crystal bruges til efterfølgende data samling. Diffraktion datasæt er, således er optimeret til maksimal opløsning med minimeret stråling skader2,3. Krævende data indsamling protokoller, såsom pseudo spiralformet (multi-position) data indsamling strategier for dataindsamling både indfødte og single-bølgelængde anomale diffraktion (SAD) er også tilgængelige8.
Helt automatisk forsøg på MASSIF-1 omfatter cryocooling og montering af krystaller på en magnetisk prøve mount egnet til den ønskede beamline udstyr standard stifter RYGSØJLEN9, at indtaste de ønskede eksperimentelle parametre i den ' diffraktion planen ' tabel i det integrerede System for Proteinkrystallografi beamlines (ISPyB)10, en web-baseret information management system for MX eksperimenter, og at sende prøverne til beamline. På ESRF, alle omkostninger ved transport af prøver til/fra beamline understøttes af ESRF bruger Office (Se hjemmesiden for ESRF11 for detaljer). MASSIF-1, ingen restriktioner placeres på løkke størrelse eller crystal kvalitet. Når du vælger en diffraktion plan for en given krystal, kan brugeren enten bruge standardindstillingerne eller vælge fra bestemte arbejdsgange, der kan tilpasses for hver prøve. Der er flere forudprogrammeret arbejdsprocesser. I arbejdsprocessen MXPressE3 justeres prøve-holdige løkken først til prøven position ved hjælp af optisk centrering. Derefter, X-stråle-baserede centrering sikrer at den bedste region af krystal er centreret til X-ray stråle. Data indsamling strategier beregnes derefter ved hjælp af eEDNA, en ramme for udvikling af plugin-baserede programmer især for online dataanalyse i feltet X-ray eksperimenter under hensyntagen til konto krystal volumen og real-time flux på beamline. Efter samlingen af en fuld diffraktion datasæt dette behandles derefter ved hjælp af en række automatisk databehandling rørledninger12 og resultaterne stilles til rådighed for inspektion og download i ISPyB. MXPressE SAD3 arbejdsgang er rettet mod selenomethionin-holdige krystaller af target proteinet og udnytter, at den operationelle energi af MASSIF-1 er lige over Se K kant. Her, MXPressE eEDNA data indsamling strategi er optimeret til TRIST dataindsamling (dvs. høj redundans, og med opløsningsindstilling for hvor Rfletning mellem Bijvoet par er under 5%). Gennemgå egenskaberne diffraktion af en serie af krystaller uden efterfølgende dataindsamling, kan MXScore3 arbejdsprocessen bruges til at producere en fuld vurdering af krystallerne analyseret. I arbejdsprocessen MXPressI3 er 180 ° rotation data indsamlet ved hjælp af 0,2 ° svingninger og ved hjælp af den begyndende phi vinkel og den beslutning, bestemmes af en eEDNA strategi. MXPressO 3 omfatter en preobserved opløsning i arbejdsprocessen (standard: dmin = 2 Å). For at foretage en indledende vurdering af krystaller som følge af en retssag krystallisering, tilbydes MXPressM3 arbejdsprocessen. Det udfører en høj-dosis mesh Skan over den bredeste orientering af prøven support med ingen dataindsamling eller centrering. To nye eksperiment arbejdsprocesser, MXPressP og MXPressP_SAD, som udfører pseudohelical dataindsamlinger, har for nylig været gennemført8. Udførelse af alle trin i alle arbejdsprocesser kan følges online og i realtid af brugeren, via ISPyB.
Her viser vi hvordan du forbereder en fuldt automatiseret MX eksperiment MASSIF-1 og hvordan at hente og analysere de data fra forsøget. Som et eksempel bruge vi menneskelige mitokondrie glycin kavalergang system protein H (GCSH). Denne lipoic acid-holdige proteiner er en del af glycin kavalergang system ansvarlig for nedbrydningen af glycin. Dette system yderligere omfatter P protein, en pyridoxal fosfat-afhængige glycin decarboxylase, T protein, en der kræver tetrahydrofolat enzym og L protein, en lipoamide dehydrogenase. GCSH overfører methylamin gruppe af glycin fra P protein til T protein. Defekter i H protein er årsag til nonketotic hyperglycinemia (NKH) i mennesker13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline MASSIF-1</td>
			<td>ESRF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21DE3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzing membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>132655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loop</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MonoQ 5/50 GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5166-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINE pucks</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CSM003-0001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1064430500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCSH purification buffer</td>
			<td>20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCSH cryo-protection buffer</td>
			<td>0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MxCube</td>
			<td></td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCube2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES workflow server</td>
			<td></td>
			<td>Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLISS beamline control</td>
			<td></td>
			<td>Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AUTO processing of images</td>
			<td></td>
			<td>Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEST and EDNA</td>
			<td></td>
			<td>Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phaser MR</td>
			<td></td>
			<td>McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td></td>
			<td>Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refmac5</td>
			<td></td>
			<td>Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240--255 (1997).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matthews</td>
			<td></td>
			<td>Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully autonomous characterization and data collection from crystals of biological macromolecules

Høj-glans X-ray bjælker kombineret med automation har ført til brugen af synkrotron-baserede makromolekylære røntgenkrystallografi (MX) beamlines for selv de mest udfordrende projekter i strukturbiologi. Men de fleste faciliteter stadig kræver tilstedeværelsen af en videnskabsmand på webstedet til at udføre eksperimenter. En ny generation af automatiserede beamlines dedikeret til fuldautomatisk karakterisering af og indsamling af data fra, krystaller af biologiske makromolekyler er for nylig blevet udviklet. Disse beamlines udgør et nyt værktøj til strukturelle biologer at screene resultaterne af indledende krystallisering forsøg og/eller indsamling af et stort antal diffraktion datasæt, uden at brugerne skulle styre beamline sig selv. Her viser vi hvordan du opretter et eksperiment for automatiske screening og dataindsamling, hvordan et eksperiment udføres på beamline, hvor de resulterende datasæt behandles, og hvordan, når det er muligt, krystalstruktur af den biologiske makromolekyle er løst.

MXPressP arbejdsprocessen blev brugt ved ESRF beamline MASSIF-1 til, fuldt automatisk montere, center i X-ray stråle, karakterisere og indsamle fuld diffraktion datasæt fra en serie af krystaller af menneskelige GCSH. Prøverne blev monteret og Løkken analyseret for et område til at scanne (figur 1, venstre). Efter analysen diffraktion udvalgtes fire punkter inden for crystal for indsamling af data (figur 1, højre). Efterfølgende behandling af automatiseret data analyse rørledninger, herunder hr. rørledning, givet høj kvalitet datasæt (tabel 1) som en hr. løsning var fundet. Sidstnævnte tillader brugernes hen til hurtigt vurdere, om den opnåede datasæt og de anvendte søgemodel er egnet til udfasning af molekylære udskiftning. Derudover kan blive bedømt tilstedeværelsen af ligander, således tillader brugeren at fokusere kun på de mest lovende datasæt for yderligere analyse. Manuel struktur bestemmelse af hr. gav en høj kvalitet electron density kort efter en enkelt automatiseret raffinement cyklus (figur 2a). For dette datasæt skære automatiseret rørledningen dataene på en 1,32 Å opløsning; brugere kan dog stadig beslutte at klippe data på et lavere opløsning at nå frem til forskellige kvalitet statistikker (CC1/2, < I/σ(I) >, Rmeas) i den højeste opløsning shell. Krystalstruktur af humane GCSH struktur er svarer til kvæg protein (3KlR)16.
Kontinuerlig electron density er synlige for hele aminosyre kæde, bortset fra den N-terminale histidin tag. Af de fire erstatninger, der adskiller mennesker og kvæg GCSH, er tre let identificerbare i electron density (Ile/Val66, Asp/Glu98 og Leu/Phe149; Figur 2b -d). Dette er mindre klar for Asp/Lys125 substitution som elektron tæthed af side-kæden er kun delvist løst på grund af fleksibilitet (figur 1e). Den aktuelt opnåede model har Rarbejde og Rgratis værdier på 20,4% og 23,8%, henholdsvis, og yderligere kan optimeres ved yderligere cyklusser af automatiserede og manuelle model bygning og raffinement.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>GRANATER pipeline</td>
			<td>XDS_APP pipeline</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Dataindsamling og -behandling</td>
		</tr>
<tr>
<td>X-ray kilde / fjernlys linje</td>
			<td colspan="2">ESRF / MASSIF-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bølgelængde (Å)</td>
			<td colspan="2">0.966</td>
		</tr>
<tr>
<td>Opløsning (Å)</td>
			<td>41.88-1,48 (1,53-1,48)</td>
			<td>41.86-1,32 (1,39-1,32)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Alt/unikke refleksioner</td>
			<td>127670 / 28644</td>
			<td>177332 / 40134</td>
		</tr>
<tr>
<td>(12178 / 2775)</td>
			<td>(23772 / 5714)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plads gruppe for indeksering, skalering og fletning</td>
			<td>C222</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Celle dimensioner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>a, b, c (Å)</td>
			<td>42.20, 83.75, 95.85</td>
			<td>42.19, 83.72, 95,82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mosaicity</td>
			<td>0,05</td>
			<td>0,05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmultilaterale miljøaftaler (%)</td>
			<td>10.0 (110.7)</td>
			<td>11.1 (198.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>< I/σ(I) ></td>
			<td>9.6 (1,3)</td>
			<td>7.6 (0,7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2 (%)</td>
			<td>99,7 (53,9)</td>
			<td>99,7 (19.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fuldstændighed (%)</td>
			<td>99,6 (99,6)</td>
			<td>99,5 (98,6)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mangfoldighed</td>
			<td>4.5 (4.4)</td>
			<td>4.4 (4.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Foreløbige model og molekylær erstatning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plads gruppe for udfasning</td>
			<td>C2</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Celle dimensioner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>a, b, c (Å)</td>
			<td>83.74, 42.18, 95,82</td>
			<td>42.19, 83.72, 95,82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Α, Β, Γ (°)</td>
			<td>90, 90.03, 90</td>
			<td>90, 90, 90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Søg efter model for hr. (FBF)</td>
			<td>3KLR</td>
			<td>3KLR</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteinmolekyler / ASU</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protein restkoncentrationer</td>
			<td>250</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rarbejde/rgratis (%) efter 1st raffinement</td>
			<td>24.3 / 26,5</td>
			<td>20.4 / 23,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>RMSD bond længde (Å) efter 1st raffinement</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0,01</td>
		</tr>
<tr>
<td>RMSD bond vinkel (°) efter 1st raffinement</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rotamer outlier (%) efter 1st raffinement</td>
			<td>1.07</td>
			<td>4.29</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ramachandran stillede/tilladte/ikke tilladte (%) efter 1st raffinement</td>
			<td>95,93 / 4,07 / 0</td>
			<td>95.12 / 4,88 / 0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: røntgen diffraktion data indsamling, raffinement og validering statistik. Værdier for den højeste opløsning shell er anført i parentes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig1.jpg"> Figur 1: prøve analyse før dataindsamling. (A) regionen valgt for scanning vises ved en rød boks. (B) analysen af diffraktion billeder er vist som en zonekort. Fire positioner inden for beliggende krystal blev valgt til dataindsamling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig2.jpg"> Figur 2: visuel validering af electron density kort fremstillet efter raffinement. Electron density kort omrids på 2 x r.m.s. niveau omkring (en) Trp143, (b) Val66 (Ile i human GCSH), og (c) Glu98 (Asp i human GCSH) og kort omrids på 1 x r.m.s niveau omkring (d) Phe149 (Leu i human GCSH) og (e) Lys125 (Asp i human GCSH). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules at JoVE.com

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Fuldt autonome karakterisering og indsamling af Data fra krystaller af biologiske makromolekyler

Her, beskriver vi, hvordan du bruger automatiseret screening og indstillinger for dataindsamling tilgængelige på nogle synkrotron beamlines. Forskere sende cryocooled prøver at synchrotron, og egenskaberne diffraktion er screenet, sæt data er indsamlet og behandlet og, hvor det er muligt, en struktur løsning udføres — alle uden menneskelig indgriben.

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

X-Ray krystallografi er den dominerende teknik til bestemmelse af 3D strukturelle oplysninger fra proteiner. Synchrotron strålelinjer er nødvendige for at få data fra de små, svagt diffracting krystaller proteiner producerer. Massiv man er en unik stråle linje, fordi det fuldt ud automatiserer processen med dataindsamling fra biologiske makromolekyler.Fra prøvemontering, placering og endelig dataindsamling. Fuld automatisering af denne art er meget vigtigt, da det giver forskerne mulighed for at tilbringe deres tid i laboratoriet, i stedet for at indsamle data på bjælken linje. Bjælken linje er også intelligent og i gennemsnit kan indsamle bedre data, end når strålen linje drives af mennesker.For at starte denne protokol skal du udføre krystalmonterings- og anmodningsbjælketid på Massiv en som beskrevet i tekstprotokollen. Gå til informationssystemet for proteinkrystaller strålelinjer eller ISPyB-websted. Vælg MX-eksperimenter, log ind med eksperimentnummeret og adgangskoden.Klik på forsendelse, tilføj ny, og giv de nødvendige oplysninger. Klik derefter på Gem. Klik på tilføj pakke, og udfyld de ønskede oplysninger.Klik på Gem, og klik derefter på Tilføj objektbeholder. Giv pucken stregkode som navnet, og vælg rygsøjlen puck, igen klik gemme. Klik på beholdersymbolet og rediger, og udfyld de nødvendige oplysninger om prøverne, såsom proteinnavn, foretrukket arbejdsflow og krystalposition, i pucken.Vælg det protein, der er godkendt af ESRF's sikkerhedsgruppe. Angiv et entydigt eksempelnavn for at identificere hvert enkelt eksempel. Du kan også scanne pin-stregkoden.Resten af de oplysninger, der skal medtages, er også valgfri. Angiv eksperimenttypen for hvert enkelt eksempel. Dette definerer, hvilken automatisk arbejdsproces der skal bruges til at behandle hver krystal.Da GCSH krystallerne er nåle, skal du vælge MX tryk P.Next, indtast en rumgruppe. Hvis den findes, vil dette blive brugt til dataindsamlingsstrategiberegninger og af de automatiske databehandlingsrørslinjer, der er tilgængelige. Angiv den ønskede opløsning.Dette definerer krystal til detektorafstand fra de første meshscanninger, karakterisering og standarddataindsamling. Nu skal du indstille den ønskede tærskelopløsning for at forhindre indsamling af komplette datasæt fra krystaller, der ikke diffract til denne grænse. Dette kan spare lagerplads og analysere tid.Indstil den nødvendige fuldstændighed. Indstil derefter den nødvendige mangfoldighed. Hvis der er indeholdt mere end én krystal på prøvestøtten, skal du indstille det maksimale antal krystaller, der skal analyseres.Standardværdien er en eller fem for MX-tryk P.Den passende strålestørrelse kan også vælges. Sæt mellemrumsgruppen i, hvis den kendes, i kolonnen force space group. Sæt derefter krystallernes strålingsfølsomhed.Hvis det ønskes, skal du indstille den samlede rotationsvinkel, der skal indsamles for hele dataindsamlingen. Når alle oplysninger er indtastet i systemet, skal du gemme værdierne. Klik på, vend tilbage til forsendelser, og tryk på send forsendelse til ESRF.Udskriv forsendelsesetiketten, og send eksemplerne. Brugere bør arrangere en afhentning med en kurer ved hjælp af ESRF kontooplysninger. På eksperimentets dag overføres prøverne til Massive en højkapacitetsdug.Beam line forskere derefter lancere dataindsamlingen, som kan følges af brugere på afstand. For hver anden eksempeltype modtager brugerne en e-mail, der informerer dem om, at dataindsamlingen er startet. Udførelsen af alle trin i alle arbejdsprocesser kan følges online og i realtid.Dette er tilgængeligt for brugeren ved at logge ind på ISPyB. Resultaterne kan også ses og downloades. For hver analyseret prøve skal du undersøge resultaterne af det automatiske eksperiment på ISPyB.Klik på den ønskede eksperimentelle session på ID30A1. Vælg den foretrukne automatiske behandlingspipeline. Download de data, der er skrevet ud i den korrekte rumgruppe med den højeste fuldstændighed og højeste opløsning.Ved at klikke på de sidste indsamle resultater og derefter downloade. MX tryk P workflow blev brugt af ESRF stråle linje Massive en til fuldt automatisk montere, center i x-ray stråle, karakterisere, og indsamle fuld diffraktion datasæt fra en række krystaller af menneskelige GCSH. Prøverne blev monteret og løkken analyseret for et område at scanne.Efter diffraktionsanalyserne blev der valgt fire punkter i krystallen til dataindsamling. Manuel strukturbestemmelse ved molekylær udskiftning gav et elektrontæthedskort af høj kvalitet efter en enkelt automatiseret raffineringscyklus. For dette datasæt reducerede den automatiserede pipeline dataene med et punkt tre to angstrom-opløsning.Brugerne kan dog vælge at klippe dataene med en lavere opløsning. Kontinuerlig elektrontæthed er synlig for hele aminosyrekæden bortset fra eterminal histidine tag. Af de fire substitutioner, der adskiller GCSH hos mennesker og kvæg, kan tre let identificeres i elektrontætheden.Dette er mindre klart for aspartinsyre til lysin 125 substitution. For hvilke sidekædens elektrontæthed kun delvist er løst på grund af fleksibilitet. Den aktuelt opnåede model har en R-arbejdsværdi på 20 point fire procent og en R-fri værdi på 23 point otte procent og kan optimeres yderligere ved hjælp af automatiserede og manuelle modelbygning og raffinement.Det er vigtigt at skræddersy kravene til dit system. Hvis du for eksempel angiver den allerede observerede opløsning til en kendt værdi, kan det spare tid og sikre en bedre dataindsamling. Fuldautomatisk dataindsamling har demokratiseret krystallografi og nu selv små laboratorier kan gå i gang med berømte projekt, når dette var muligt før for kun med enorme mand magt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS for Indgående Karakterisering og Kvantificering af glutamin og asparagin deamidering i Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Mikrokrystallografi af proteinkrystaller og<em&gt; I Cellulo</em&gt; Diffraktion

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle undersøgelser af makromolekyler i løsning ved hjælp af små vinkel X-Ray spredning

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering af membran transportører ved heterologe udtryk i E. coli og fremstilling af membran vesikler

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Fuldt forarbejdet rekombinant KRAS4b: isolering og karakterisering af det Farnesylerede og methylerede protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Derivatization af Protein Krystaller med I3C ved hjælp af Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimering af væksten af endothiapepsinkrystaller til serielle krystallografieksperimenter

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Fast target seriel dataindsamling på Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

RIBO-seq i bakterier: en prøvesamling og biblioteksforberedelsesprotokol til NGS-sekventering

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Rekonstitution af Msp1 udvindingsaktivitet med fuldt rensede komponenter

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...