Name: fully autonomous characterization and data collection from crystals of biological macromolecules
Uploaded: 2019-03-22T12:30:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules at JoVE.com

De auteurs bedanken de ESRF voor beamtime.

Opmerking: De productie, zuivering en kristallisatie van GCSH worden beschreven in aanvullende bestand 1.
1. korte beschrijving van de off line voorbereiding en crystal montage
<ol><li>Standpunt een nylon lus of een andere crystal montage steun al bevestigd aan een pin van de WERVELKOLOM onder een of meer kristallen en hen te bevrijden van de neerslag oplossing (20 µL van 0,5 M natriumhydroxide formate pH 4.0 + 25 µL van eiwit oplossing).<ol>
<li>Verwijder de bulk vloeistof rond de crystal(s) door het aanraken van de zware montering met een papier-wick te zuigen uit alle overtollige vocht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geniet van de crystal(s) in de oplossing van de cryoprotective met de neerslag oplossing plus 30% glycerol; Verwijder vervolgens de crystal steun én de crystal(s).<ol>
<li>Verwijder de bulk vloeistof rond de crystal(s) door het aanraken van de zware montering met een papier-wick te zuigen uit alle overtollige vocht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Duik van de berg in een flesje van de WERVELKOLOM gevuld met vloeibare stikstof en op te slaan, samen met eventuele andere kristallen die op dezelfde manier bereid, in een Europees laboratorium voor moleculaire biologie (EMBL) / ESRF sample wisselaar puck9 bij temperatuur van vloeibare stikstof. Opmerking: De crystal(s) zijn stabiel in deze toestand tot het beamtime beschikbaar is.</li>
</ol>2. beamtime op massief-1 opvragen
<ol><li>Aanvragen beamtime zo spoedig mogelijk op de startpagina van de ESRF (op http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying). Opmerking: Er zijn een aantal mogelijke toestanden van de toegang tot de straallijnen ESRF MX. Laboratoria kunnen toepassen collectief als onderdeel van een blok toewijzing groep (zak), dat beamtime toegewezen voor 2 jaar. Als groepen individueel van toepassing wilt, kunnen zij toepassen voor het rollen van toegang, die hen in staat snel toegang tot de straallijnen na "peer review stelt". Voorstel van de Fractie van zal worden herzien en goedgekeurd door de ESRF veiligheidsgroep die aanvullende gegevens verzoeken. Indien het voorstel wordt aangenomen, zal een experiment nummer en paswoord worden meegedeeld. Eigen onderzoek kan worden uitgevoerd door de aankoop van beamtime.</li>
	<li>Vul de vereiste veiligheid online opleiding (op http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).</li>
	<li>Boek beamtime op de kalender van massief-1. Opmerking: Het is mogelijk om te boeken omhoog tot een maximum van 50 monster houders te analyseren per werkperiode.</li>
	<li>Vul in de A-poot te verklaren van een post-in experiment (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), samen met de vereiste veiligheidsinformatie, voor de monsters die dienen te worden gemeten.</li>
</ol>3. het creëren van een plan voor diffractie in ISPyB
Opmerking: Het diffractie-plan bevat alle informatie die nodig is voor een steekproef in ISPyB en aanvullende informatie die u op maat van het experiment uitgevoerd voor elk monster kan bevatten.
<ol><li>Open ISPyB (op https://exi.esrf.fr/).</li>
	<li>Kies MX experimenten.</li>
	<li>Meld u aan met het experiment nummer en wachtwoord.</li>
	<li>Klik op verzending | Nieuwe toevoegen en de nodige gegevens verstrekken. Klik op Opslaan.</li>
	<li>Klik op Add perceel en vul de gevraagde informatie. Klik op Opslaan.</li>
	<li>Klik vervolgens op toevoegen container, geven de puck streepjescode als de naam en kies WERVELKOLOM puck. Klik op Opslaan.</li>
	<li>Klik op de container symbool en bewerken, en vul de nodige informatie, zoals de naam van het eiwit, voorkeur werkstroom, crystal positie in de puck, enz., betreffende de monsters.</li>
	<li>Kies het eiwit (bijvoorbeeld GCSH of lysozym) dat is goedgekeurd door de groep van de veiligheid ESRF.</li>
	<li>Geef een unieke sample identificeren van elke individuele monster. Het is mogelijk om eventueel de pin barcode scannen. De rest van de onderstaande informatie is optioneel.</li>
	<li>Geef de optionele gegevens.<ol>
<li>Voor elke individuele monster, voert u het type experiment (dat wil zeggen, MXPressE_SAD, SCORE, of MXPressO, enz., standaard MXPressE) onder Exp. Type. Dit bepaalt welke automatische workflow zal worden gebruikt voor het verwerken van elke crystal. Gezien het feit dat de GCSH kristallen naalden zijn, kies MXPressP.</li>
		<li>Voer een ruimtegroep (bijvoorbeeld C2, P1 en P212121), indien bekend. Indien aanwezig, zal deze worden gebruikt voor gegevensberekeningen collectie strategie en door de automatische gegevensverwerkende pijpleidingen beschikbaar.</li>
		<li>Voert u de gewenste resolutie (standaard: dmin 2.0 Å =). Dit bepaalt de afstand van de crystal-naar-detector voor de initiële mesh scans, karakterisering en verzamelen van de gegevens van de standaard.</li>
		<li>Stel de gewenste drempel resolutie (bijvoorbeeld 1,5 Å of 2.3Å), om te voorkomen dat de collectie van volledige datasets van kristallen die niet aan deze limiet doen diffract. Dit kan sneller gegevens opslag ruimte en analyse.</li>
		<li>De vereiste volledigheid instellen (standaard: 0.99). De vereiste multipliciteit instellen (standaard: 4). als meer dan één crystal is opgenomen op de steun van het monster, stelt het maximum aantal kristallen te analyseren. De standaardwaarde is 1 of 5 voor MXPressP.</li>
		<li>Selecteer de juiste lichtbundel formaat (standaard: 50 µm). Als een specifieke waarde is niet is geselecteerd, zal de X-Vleug-centreren en gegevensberekeningen collectie strategie worden uitgevoerd met de grootte van een straal van 50 µm. Opmerking: Tijdens de daaropvolgende verzameling van volledige datasets, de grootte van de bundel zal worden automatisch aangepast.</li>
		<li>Zet in de ruimtegroep, indien bekend, in de kolom ' groep ' gedwongen ruimte. Stel de straling-gevoeligheid van de kristallen (0,5 – 2,0 voor lage tot hoge gevoeligheid, met een standaardwaarde van 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Indien gewenst, de totale rotatiehoek te worden verzameld voor de volledige dataset-collectie instellen (standaard: de totale rotatiehoek bepaald door eEDNA).</li>
	<li>De waarden opslaan. Klik op terug naar zendingen. Druk op de verzending naar ESRF verzenden.</li>
	<li>Het verzendlabel afdrukken en verzenden van de monsters. Gebruikers moeten een pick-up regelen met een koerier, gebruik van het ESRF accountgegevens. Opmerking: Het is zeer belangrijk om te selecteren opnemen retour label om de naadloze terugkeer van monsters (zie https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).</li>
</ol>4. gegevens verzamelen, weergeven en ophalen
Opmerking: Op de dag van het experiment, monsters worden overgebracht naar de massief-1 hoge capaciteit Dewar (HCD). Beamline wetenschappers dan lancering het verzamelen van gegevens, die door gebruikers op afstand kan worden gevolgd. Voor elk type verschillende Monster ontvangen gebruikers een e-mail hen te informeren dat de gegevensverzameling is begonnen. Zoals eerder opgemerkt, de uitvoering van alle maatregelen in alle workflows online en in realtime kan worden gevolgd door de gebruiker via ISPyB, waaruit de resultaten kunnen worden bekeken en gedownload.
<ol><li>Voor elk monster geanalyseerd, bekijkt u de resultaten van de automatische experiment in ISPyB (https://exi.esrf.fr/).<ol>
<li>Log in, met behulp van het experiment aantal en wachtwoord, en klik op de gewenste experimentele sessie op ID30A-1.</li>
		<li>Selecteer de voorkeur (top-scoren) autoprocessing pijpleiding (bijvoorbeeld granaten of XDS_APP) en het downloaden van de gegevens in de juiste ruimtegroep met de hoogste volledigheid en hoogste resolutie heeft uitgeschreven door te klikken op de Laatste resultaten van het verzamelen en, vervolgens, downloaden. Opmerking: Alle mesh-, lijn- en karakterisering afbeeldingen zijn in een submap voor elk monster, genaamd /MXPressE_01. De ESRF loopt automatisch vijf afzonderlijk te verwerken pakketten, namelijk EDNA_proc12, granaten12, XDS_APP14, autoPROC15en16van de XIA2. Data-integratie is gebaseerd op XDS, met uitzondering van XIA2, die is gebaseerd op de WIJZERPLATEN. Alle pakketten worden ook uitgevoerd in abnormaal en nonanomalous modi, waardoor de automatische detectie van een anomalie signaal, indien aanwezig in de gegevens, in SAD geleidelijke protocollen moeten worden gebruikt. Elk pakket maakt gebruik van verschillende parameters en beslissingsstructuren, wat betekent dat sommige pakketten beter met bepaalde steekproeven uitgevoerd. Echter kan dit zorgen voor een groot aantal resultaten wanneer het aantal pakketten en mogelijke ruimte groepen wordt administratief verwerkt. De resultaten zijn, daarom gerangschikt ruwweg gebaseerd op resolutie en andere kwaliteit statistieken, zoals Rsamenvoegen in de laagste resolutie shell, CC(1/2) en volledigheid. Dit is gericht op het begeleiden van de gebruiker naar de beste datasets, maar alle mogelijke ruimte groepen en resultaten moeten zorgvuldig worden geïnspecteerd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Unzip de gedownloade map, waarin ook alle log-bestanden en niet-samengevoegde XDS_ASCII. HKL en samengevoegde en geschaald .mtz bestanden. Opmerking: In het geval dat de structuur (in PDB-formaat) van de proteïne van belang of een nauwe homolog is geüpload naar de ISPyB aan het begin van het experiment, de pijpleiding van de autoprocessing op ESRF zal automatisch uitvoeren een moleculaire vervanging (MR) uitgevoerd met behulp van deze structuur als de model op de best scorende oplossing zoeken. De resultaten van de heer pijpleiding worden weergegeven in ISPyB en kunnen worden gevonden in de verwerkte gegevens-map (bijvoorbeeld, /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ mrpipe_dir /). Hier, het uiteindelijke model zal de naam coot1.pdb en de reflectie gegevens sidechains.mtz. Merk op dat de pijpleiding de symmetrie van de cel (de vermindering van de primitieve cel) teneinde de waarschijnlijkheid van het vinden van een oplossing zou kunnen verminderen. In het geval hier schreef de heer pijpleiding uit de oplossing in een monoklien cel (C2) in plaats van in een orthorhombisch cel (C2221). Details over het uitvoeren van een moleculaire vervanging handmatig uitvoeren (geïllustreerd voor de tweede oplossing voor het best scorende autoprocessing) zijn opgenomen in de Aanvullende bestanden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hui, R., Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+protein+crystallization.">High-throughput protein crystallization.</a> Journal of Structural Biology. 142 (1), 154-161 (2003).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASSIF-1:+a+beamline+dedicated+to+the+fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).</li><li>Svensson, O., Malbet-Monaco, S., Popov, A., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">Fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (8), 1757-1767 (2015).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrystalDirect:+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films.">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68, 1393-1399 (2012).</li><li>Nurizzo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RoboDiff:+combining+a+sample+changer+and+goniometer+for+highly+automated+macromolecular+crystallography+experiments.">RoboDiff: combining a sample changer and goniometer for highly automated macromolecular crystallography experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (8), 966-975 (2016).</li><li>Bowler, M. W., Svensson, O., Nurizzo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automatic+macromolecular+crystallography:+the+impact+of+MASSIF-1+on+the+optimum+acquisition+and+quality+of+data.">Fully automatic macromolecular crystallography: the impact of MASSIF-1 on the optimum acquisition and quality of data.</a> Crystallography Reviews. 22 (4), 233-249 (2016).</li><li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography.">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li><li>Svensson, O., Gilski, M., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-position+data+collection+and+dynamic+beam+sizing:+recent+improvements+to+the+automatic+data-collection+algorithms+on+MASSIF-1.">Multi-position data collection and dynamic beam sizing: recent improvements to the automatic data-collection algorithms on MASSIF-1.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74, 433-440 (2018).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB:+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Monaco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+processing+of+macromolecular+crystallography+X-ray+diffraction+data+at+the+ESRF.">Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).</li><li>Kikuchi, G., Motokawa, Y., Yoshida, T., Hiraga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+cleavage+system:+reaction+mechanism,+physiological+significance,+and+hyperglycinemia.">Glycine cleavage system: reaction mechanism, physiological significance, and hyperglycinemia.</a> Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and Biological Sciences. 84 (7), 246-263 (2008).</li><li>Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDSAPP2.0.">XDSAPP2.0.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).</li><li>Vonrhein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+and+analysis+with+the+autoPROC+toolbox.">Data processing and analysis with the autoPROC toolbox.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xia2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Higashiura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+X-ray+crystal+structure+of+bovine+H-protein+at+0.88+&#197;+resolution.">High-resolution X-ray crystal structure of bovine H-protein at 0.88 &#197; resolution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (6), 698-708 (2010).</li><li>Sanishvili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+7+&#181;m+mini-beam+improves+diffraction+data+from+small+or+imperfect+crystals+of+macromolecules.">A 7 &#181;m mini-beam improves diffraction data from small or imperfect crystals of macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (4), 425-435 (2008).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffraction+cartography:+applying+microbeams+to+macromolecular+crystallography+sample+evaluation+and+data+collection.">Diffraction cartography: applying microbeams to macromolecular crystallography sample evaluation and data collection.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (8), 855-864 (2010).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+Experience+of+Controlled+Crystal+Dehydration:+Results+from+the+European+Synchrotron+HC1+Collaboration.">Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration.</a> Crystal Growth &amp; Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+harvesting+and+processing+of+protein+crystals+through+laser+photoablation.">Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Volautomatische straallijnen bieden geautomatiseerde karakterisering en gegevensverzameling van grote aantallen macromoleculaire kristallen zonder de aanwezigheid van een wetenschapper, hetzij op de beamline op afstand, vereist. Met behulp van volledig geautomatiseerde straallijnen heeft vele voordelen ten opzichte van handmatige bediening. Voor bijvoorbeeld het geautomatiseerde monster centreren, gebaseerd op de X-ray mesh en line scant, is nauwkeuriger dan die uitgevoerd met het menselijk oog als wordt het niet beïnvloed door thermische of optische effecten. Inderdaad, deze mazen en lijn scans bieden aanvullende gegevens (dat wil zeggen, gedetailleerde afmetingen van het kristal en de beste buigingsinrichting van de regio van het kristal) die belangrijk zijn in het bepalen van de grootte van de juiste lichtbundel om te gebruiken voor gegevensverzameling — met name voor kleine kristallen 18— en vaak resulteren in een verbetering van de kwaliteit van de gegevens verkregen diffractie. Bovendien, door te profiteren van de door de gebruiker gedefinieerde parameters in de setup van automatische experimenten, de stappen in specifieke werkstromen kunnen worden aangepast meest geschikt zijn voor het systeem onder studie, dus verder optimaliseren van het slagingspercentage van het experiment.
Tezamen, de betrouwbaarheid van de werkstromen beschikbaar zijn, de eenvoudige toegang tot de beamline (gebruikers zelf plannen, met behulp van een kalender [zie hierboven]), en de volledig geautomatiseerde aanpak van massief-1 biedt een rigoureuze, high-throughput en tijdbesparende alternatief voor de klassieke hands-on MX experimenten en het potentieel om meer geavanceerde procedures en toepassingen in automatische werkstromen te implementeren. In de nabije toekomst, worden crystal cartografie in 3D19 toegepast ter verbetering van de nauwkeurigheid van X-ray centreren, terwijl complexere protocollen, zoals crystal uitdroging experimenten20, zal worden geautomatiseerd. Gehoopt wordt dat volledig autonoom gegevensverzameling een standaardmethode in MX, kwalitatief hoogwaardige gegevens verstrekken voor kleine-molecuul fragment schermen, optimaliseren van het screenen van grote aantallen slecht buigingsinrichting kristallen en automatisch fase zal worden informatie om te lossen crystal structuren DOVO. In combinatie met ontwikkelingen in de automatische opruiming van kristallen21, zou de mogelijkheid van eiwit kristal structuur oplossing als een geautomatiseerde service goed een realiteit geworden.

Bepaling van de driedimensionale structuur van specifieke proteïnen is van cruciaal belang in de biologie. De informatie die is afgeleid van doen zo werpt licht op de biologische functie en over de vorm en de specificiteit van actieve en/of bindende sites opgenomen in het molecuul onder studie. In veel gevallen, hierdoor mechanismen voor actie worden vastgesteld of, in voorkomend geval, potentiële therapeutische moleculen worden ontwikkeld. MX is de techniek die het meest gebruikt om structurele informatie te verkrijgen, maar een knelpunt is de bepaling van de optimale voorwaarden voor het verkrijgen van goed diffracting kristallen. Daarom, kristallisatie proeven zijn uitgevoerd in vele verschillende omstandigheden en worden vervolgens gescreend, om te zoeken naar de beste kristallen moet worden gebruikt voor het verzamelen van de gegevens van diffractie. De automatisering van de installatie van kristallisatie proeven1 heeft in dit opzicht duidelijk geholpen. Echter worden de volgende stappen (dat wil zeggen, crystal montage diffractie screening en verzamelen van de gegevens van de diffractie) meestal uitgevoerd handmatig toegang tot een hoop tijd, inspanning en middelen. De automatisering van diffractie screening en gegevensverzameling zou dus betekenen een enorme tijdwinst en efficiëntie.
Diffractie screening en gegevensverzameling in MX wordt meestal uitgevoerd op synchrotron MX straallijnen waartegen automatisering grotendeels dit proces vergemakkelijkt heeft. In de meeste gevallen is het echter nodig zijn voor de wetenschapper aanwezig te zijn bij de beamline tijdens een experiment of om hem te bedienen op afstand. Een nieuwe generatie van volledig geautomatiseerde MX straallijnen heeft onlangs ontwikkelde2. Gebruikers hoeven hier niet aanwezig te zijn, hetzij fysiek of op afstand, tijdens een experimentele sessie. Hierdoor kunnen wetenschappers meer tijd te besteden aan minder routinetaken, in plaats van de uitgaven hele dagen, en vaak nachten, screening kristallen en verzamelen gegevens van diffractie. werelds eerste volledig geautomatiseerde beamline is de massaal geautomatiseerde Sample selectie geïntegreerde faciliteit (massief-1, ID30A-1)2,3 op de Europese Synchrotron Radiation Facility (ESRF). Het heeft een unieke sample-omgeving waarin een hoge capaciteit monster-bevattende dewar opereert in tandem met een robot monster-wisselaar die ook als de beamline de goniometer4,5 fungeert. MASSIEF-1 is een undulator beamline uitgerust met een single-photon-tellen hybride pixel detector6, die bij een vaste golflengte van 0.969 werkt Å (12,84 keV) met een intense X-ray-balk (2 x 1012 fotonen/s). De grootte van de straal op de positie van het monster kan aangepast worden tussen een minimum van 10 µm (ronde lichtbundel) tot een maximum van 100 µm x 65 µm (horizontaal door de grootte van de verticale balk). Gemiddeld, kan het beamline proces, in een volledig automatische mode (zie hieronder), 120 kristallen in 24 h. De werking van de beamline is gebaseerd op een reeks van werkstromen7, die elk intelligente besluiten op basis van de uitkomsten van voorgaande stappen in de workflow neemt, om ervoor te zorgen de meting van de best mogelijke gegevens uit de steekproef in onderzoek. Met name de evaluatie van de diffractie kenmerken van een afzonderlijke monster houdt rekening crystal volume en flux en zorgt ervoor dat, waar het kristal is groter dan de X-ray-balk, dat alleen de beste regio van het kristal wordt gebruikt voor latere data collectie. Diffractie datasets zijn, dus, geoptimaliseerd voor maximale resolutie met geminimaliseerde straling schade2,3. Veeleisende gegevens verzameling protocollen, zoals pseudo-spiraalantennes (multi-positie) data collectie strategieën voor de gegevensverzameling van zowel inheemse en één golflengte abnormale diffractie (SAD), zijn ook beschikbaar8.
Volledig automatische experimenten op massief-1 betrekken cryocooling en montage van de kristallen op een magnetische monster mount geschikt voor de gewenste beamline apparatuur standaard stiften WERVELKOLOM9, invoeren van de gewenste experimentele parameters in de ' diffractie plan' tabel in het geïntegreerd systeem voor eiwit kristallografie straallijnen (ISPyB)10, een web-gebaseerd informatie managementsysteem voor MX experimenten, en verzenden van de monsters naar de beamline. Op de ESRF, alle kosten van het transport van de monsters naar/van de beamline worden ondersteund door het Bureau van de gebruiker ESRF (Zie de website van het ESRF11 voor meer informatie). MASSIEF-1, zijn geen beperkingen op de grootte van de lus of crystal kwaliteit. Bij het kiezen van een diffractie-plan voor een bepaald kristal, de gebruiker kan standaardinstellingen gebruiken of kiezen uit specifieke werkstromen, die kunnen worden aangepast voor elk monster. Diverse voorgeprogrammeerde werkstromen zijn beschikbaar. In de MXPressE3 workflow, wordt de lus monster-bevattende eerst uitgelijnd met de positie van de monster met behulp van optische centreren. Vervolgens, X-Vleug gebaseerde centreren zorgt ervoor dat de beste regio van het kristal is gecentreerd op de X-ray-balk. Data collectie strategieën worden vervolgens berekend met behulp van eEDNA, een kader voor de ontwikkeling van plugin gebaseerde toepassingen vooral voor online data-analyse in het veld X-ray experimenten rekening account crystal volume en de real-time flux op de beamline. Dit wordt vervolgens verwerkt met behulp van een reeks van automatische gegevensverwerking pijpleidingen12 na de inzameling van de gegevensset van een volledige diffractie, en de resultaten zijn beschikbaar gesteld voor inspectie en download in ISPyB. De workflow van de3 MXPressE SADis gericht op selenomethionine-bevattende kristallen van het target-eiwit en exploiteert het feit dat de operationele energie van massief-1 net boven de rand van de Se K is. Hier, de MXPressE eEDNA gegevens collectie strategie is geoptimaliseerd voor triest gegevensverzameling (dat wil zeggen, hoge redundantie, en met de resolutie ingesteld op waar de Rsamenvoegen tussen Bijvoet paren minder dan 5 is %). Om het scherm van de eigenschappen van de diffractie van een reeks van kristallen zonder verdere gegevensverzameling, kan de MXScore3 -werkstroom worden gebruikt voor de productie van een volledige kwaliteitsbeoordeling van de kristallen geanalyseerd. In de MXPressI3 workflow, 180 ° rotatie gegevens verzameld behulp van 0,2 ° oscillaties en de beginhoek van phi en de resolutie die bepaald door een strategie van de eEDNA. MXPressO 3 bevat een preobserved resolutie in de workflow (standaard: dmin = 2 Å). Om een eerste evaluatie van de kristallen die voortvloeien uit een kristallisatie proces, wordt de MXPressM3 -werkstroom aangeboden. Dit voert een hoge dosis net scannen via de breedste stand van monster ondersteuning met geen gegevensverzameling of centreren. Onlangs zijn twee nieuwe experiment workflows, MXPressP en MXPressP_SAD, die pseudohelical gegevensverzamelingen vervullen, geïmplementeerde8geweest. De uitvoering van alle maatregelen in alle workflows online en in realtime kan worden gevolgd door de gebruiker, via ISPyB.
Hier laten we zien hoe voor te bereiden van een volledig geautomatiseerde MX-experiment op massief-1 en hoe u kunt ophalen en analyseren van gegevens als gevolg van het experiment. Als voorbeeld gebruiken we menselijke mitochondriale glycine decollete systeem eiwit H (GCSH). Deze lipoic acid-bevattende eiwitten is onderdeel van het glycine decollete systeem verantwoordelijk voor de afbraak van glycine. Dit systeem verder omvat het P-eiwit, een pyridoxal fosfaat-afhankelijke glycine decarboxylase, de T-eiwit, een enzym tetrahydrofolate-eisen en de L-proteïne, een lipoamide-dehydrogenase. GCSH brengt de groep methylamine glycine uit de P-eiwitten naar de T-eiwit. Defecten in het H-eiwit zijn de oorzaak van nonketotic hyperglycinemia (NKH) in mens13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline MASSIF-1</td>
			<td>ESRF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21DE3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzing membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>132655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loop</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MonoQ 5/50 GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5166-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINE pucks</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CSM003-0001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1064430500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCSH purification buffer</td>
			<td>20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCSH cryo-protection buffer</td>
			<td>0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MxCube</td>
			<td></td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCube2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES workflow server</td>
			<td></td>
			<td>Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLISS beamline control</td>
			<td></td>
			<td>Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AUTO processing of images</td>
			<td></td>
			<td>Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEST and EDNA</td>
			<td></td>
			<td>Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phaser MR</td>
			<td></td>
			<td>McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td></td>
			<td>Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refmac5</td>
			<td></td>
			<td>Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240--255 (1997).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matthews</td>
			<td></td>
			<td>Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully autonomous characterization and data collection from crystals of biological macromolecules

Hoog-glans X-ray balken gekoppeld aan automatisering hebben geleid tot het gebruik van de straallijnen synchrotron gebaseerde macromoleculaire röntgendiffractie (MX) voor zelfs de meest uitdagende projecten in de structurele biologie. Meeste faciliteiten vereisen echter nog steeds de aanwezigheid van een wetenschapper ter plaatse uit te voeren van de experimenten. Een nieuwe generatie van geautomatiseerde straallijnen gewijd aan de volautomatische karakterisering van, en het verzamelen van gegevens uit kristallen van biologische macromoleculen is onlangs ontwikkeld. Deze straallijnen vertegenwoordigen een nieuw instrument voor structurele biologen op het scherm van de resultaten van de eerste kristallisatie proeven en/of de collectie van grote aantallen diffractie datasets, zonder gebruikers hebben om te controleren de beamline zelf. Hier laten we zien hoe u een experiment voor automatische screening en het verzamelen van gegevens, hoe een experiment wordt uitgevoerd bij de beamline, hoe is de resulterende gegevenssets worden verwerkt, en hoe, indien mogelijk, de kristalstructuur van de biologische macromolecule is opgelost.

De werkstroom MXPressP gewend was op de ESRF beamline massief-1, volautomatisch, mount, midden in de X-ray-balk, karakteriseren en volledige diffractie datasets verzamelen uit een groot aantal kristallen van menselijke GCSH. De monsters werden gemonteerd en de lus geanalyseerd voor een gebied om te scannen (Figuur 1, links). Na de analyse van de diffractie, werden vier punten geselecteerd binnen het kristal voor gegevensverzameling (Figuur 1, rechts). Een latere verwerking door geautomatiseerde data analyse pijpleidingen, met inbegrip van de heer pijpleiding, leverde kwalitatief hoogwaardige datasets (tabel 1) waarvoor een heer oplossing is gevonden. De laatste kan gebruikers snel beoordelen of de verkregen dataset en de gebruikte Zoek model geschikt zijn voor geleidelijke door moleculaire vervanging. Daarnaast kan de aanwezigheid van liganden worden beoordeeld, dus het toelaat van de gebruiker zich alleen richten op de meest veelbelovende datasets voor verdere analyse. Handmatige structuurbepaling van de heer leverde een kwalitatief hoogwaardige elektronen dichtheid kaart na een honkslag geautomatiseerd verfijning cyclus (Figuur 2a). Voor deze dataset Knip de geautomatiseerde pijpleiding de gegevens op een 1,32 Å resolutie; gebruikers kunnen echter nog steeds beslissen om te snijden van de gegevens op een lagere resolutie te komen tot de statistieken van verschillende kwaliteit (CC1/2, < I/σ(I) >, RMEA's) in de hoogste resolutie shell. De kristalstructuur van menselijke GCSH structuur is vergelijkbaar met die van de boviene eiwit (3KlR)16.
Continu elektronen dichtheid is zichtbaar voor de gehele aminozuur-keten, afgezien van de N-terminale histidine-tag. De vier vervangingen die het onderscheiden van menselijke en boviene GCSH, zijn drie duidelijk herkenbaar in de dichtheid van de elektron (Ile/Val66, Asp/Glu98 en Leu/Phe149; Figuur 2b -d). Dit is minder duidelijk voor de vervanging van de ASP-/ Lys125 waarvoor de elektronen dichtheid van de zijketen slechts ten dele als gevolg van de flexibiliteit (1e cijfer opgelost is). De momenteel verkregen model heeft Rwerken engratis R-waarden van 20,4% en 23,8%, respectievelijk, en verder kan worden geoptimaliseerd door verdere cycli van automatische en handmatige model gebouw en verfijning.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>GRANATEN pijpleiding</td>
			<td>XDS_APP pijpleiding</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Gegevensverzameling en -verwerking</td>
		</tr>
<tr>
<td>X-Ray bron / Beam lijn</td>
			<td colspan="2">ESRF / MASSIEF-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Golflengte (Å)</td>
			<td colspan="2">0.966</td>
		</tr>
<tr>
<td>Resolutie (Å)</td>
			<td>41.88-1,48 (1.53-1.48)</td>
			<td>41.86-1.32 (1.39-1.32)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Totaal/uniek reflecties</td>
			<td>127670 / 28644</td>
			<td>177332 / 40134</td>
		</tr>
<tr>
<td>(12178 / 2775)</td>
			<td>(23772 / 5714)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ruimtegroep voor het indexeren, schalen en samenvoegen</td>
			<td>C222</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Afmetingen van de cel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>a, b, c (Å)</td>
			<td>42,20, 83.75, 95.85</td>
			<td>42.19, 83.72, 95,82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mosaicity</td>
			<td>0,05</td>
			<td>0,05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (%)</td>
			<td>10,0 (110.7)</td>
			<td>11.1 (198,2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>< I/σ(I) ></td>
			<td>9.6 (1.3)</td>
			<td>7,6 (0.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2 (%)</td>
			<td>99,7 (53,9)</td>
			<td>99,7 (19.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volledigheid (%)</td>
			<td>99,6 (99,6)</td>
			<td>99,5 (98,6)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Veelheid</td>
			<td>4.5 (4.4)</td>
			<td>4.4 (4.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Moleculaire vervanging en verfijning van de voorlopige model</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ruimtegroep voor geleidelijke afschaffing</td>
			<td>C2</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Afmetingen van de cel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>a, b, c (Å)</td>
			<td>83.74, 42.18, 95,82</td>
			<td>42.19, 83.72, 95,82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Α, Β, Γ (°)</td>
			<td>90.03, 90, 90</td>
			<td>90, 90, 90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zoek model voor MIJNHEER (VOB)</td>
			<td>3KLR</td>
			<td>3KLR</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eiwitmolecules / ASU</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eiwit residuen</td>
			<td>250</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rwerken/rgratis (%) na 1e verfijning</td>
			<td>24,3 / 26,5</td>
			<td>20.4 / 23.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>RMSD bindingslengte (Å) na 1e verfijning</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0,01</td>
		</tr>
<tr>
<td>RMSD bond hoek (°) na 1e verfijning</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1,83</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rotamer uitbijter (%) na 1e verfijning</td>
			<td>1.07</td>
			<td>4.29</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ramachandran begunstigde/toegestaan/niet toegestaan (%) na 1e verfijning</td>
			<td>95.93 / 4.07 / 0</td>
			<td>95.12 / 4.88 / 0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: röntgendiffractie gegevens verzamelen, verfijning en validatie statistieken. Waarden voor de hoogste resolutie shell tussen haakjes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig1.jpg"> Figuur 1: analyse voor gegevensverzameling Sample. (A) de regio die is geselecteerd voor scannen wordt weergegeven met een rood vakje. (B) de analyse van diffractie beelden wordt weergegeven als een warmte-kaart. Vier posities binnen het gelegen kristal werden geselecteerd voor gegevensverzameling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig2.jpg"> Figuur 2: visuele validatie van elektronen dichtheid kaarten verkregen na verfijning. Elektronen dichtheid kaarten contouren op 2 x r.m.s. niveau rond (een) Trp143, (b) Val66 (Ile in menselijke GCSH), en (c) Glu98 (Asp in menselijke GCSH) en kaarten met werklastbeschrijving op 1 x r.m.s niveau rond (d) Phe149 (Leu in menselijke GCSH) en (e) Lys125 (Asp in menselijke GCSH). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules at JoVE.com

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Volledig autonoom karakterisering en het verzamelen van gegevens van kristallen van biologische macromoleculen

Hier beschrijven we hoe het gebruik van de geautomatiseerde screening en mailopties voor gegevens verzamelen beschikbaar op sommige synchrotron straallijnen. Wetenschappers verzenden de synchrotron, cryocooled monsters en de diffractie eigenschappen worden gescreend, de verzamelingen gegevens worden verzameld en verwerkt en, waar mogelijk, de oplossing van een structuur wordt uitgevoerd — allemaal zonder menselijke tussenkomst.

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

X-Ray kristallografie is de dominante techniek voor het bepalen van 3D structurele informatie van eiwitten. Synchrotron bundel lijnen zijn nodig om gegevens te verkrijgen van de kleine, zwak diffracting kristallen van de eiwitten produceren. Massive one is een unieke bundellijn omdat het het proces van het verzamelen van gegevens uit biologische macromoleculen volledig automatiseert.Van voorbeeldmontage, locatie en definitieve gegevensverzameling. Volledige automatisering van dit soort is erg belangrijk omdat het onderzoekers in staat stelt om hun tijd door te brengen in het lab, in plaats van het verzamelen van gegevens op de bundellijn. De bundel lijn is ook intelligent en gemiddeld, kan het verzamelen van betere gegevens dan wanneer de bundel lijn wordt bediend door de mens.Om dit protocol te beginnen, voert u kristalmontage uit en vraagt u beam time op Massive, zoals beschreven in het tekstprotocol. Navigeer naar het informatiesysteem voor eiwitkristallografiebundellijnen of ISPyB-website. Kies MX-experimenten, log in met het experimentnummer en wachtwoord.Klik op verzending, voeg nieuw toe en geef de nodige informatie. Klik vervolgens op opslaan. Klik op Pakket toevoegen en vul de gevraagde informatie in.Klik op Opslaan en klik vervolgens op Container toevoegen. Geef de puck barcode als de naam, en kies wervelkolom puck, nogmaals klik op opslaan. Klik op het containersymbool en bewerk en vul de nodige informatie in over de monsters, zoals de eiwitnaam, de gewenste werkstroom en de kristalpositie, in de puck.Kies het eiwit dat is goedgekeurd door de ESRF-veiligheidsgroep. Voer een unieke voorbeeldnaam in om elk afzonderlijk voorbeeld te identificeren. Scan eventueel de pincode.De rest van de informatie op te nemen is ook optioneel. Voer voor elk afzonderlijk voorbeeld het experimenttype in. Hiermee wordt gedefinieerd welke automatische workflow wordt gebruikt om elk kristal te verwerken.Aangezien de GCSH-kristallen naalden zijn, kiest u MX-druk op P.Next, voer u een ruimtegroep in. Indien aanwezig, zal dit worden gebruikt voor het verzamelen van gegevens strategie berekeningen, en door de automatische gegevensverwerking pijp lijnen beschikbaar. Voer de gewenste resolutie in.Hiermee definieert u de afstand van kristal tot detector van de eerste mesh-scans, karakterisering en standaardgegevensverzameling. Stel nu de gewenste drempelresolutie in om te voorkomen dat volledige gegevenssets worden verzameld van kristallen die niet tot deze limiet worden beperkt. Dit kan gegevensopslagruimte besparen en tijd analyseren.De vereiste volledigheid instellen. Stel vervolgens de vereiste veelheid in. Als er meer dan één kristal op de monsterondersteuning staat, stelt u het maximumaantal te analyseren kristallen in.De standaardwaarde is een of vijf voor MX-druk op P.De juiste bundelgrootte kan ook worden geselecteerd. Plaats de ruimtegroep, indien bekend, in de kolom met krachtruimtegroep. Stel vervolgens de stralingsgevoeligheid van de kristallen in.Stel desgewenst de totale rotatiehoek in die moet worden verzameld voor het verzamelen van de volledige gegevensset. Zodra alle informatie in het systeem is ingevoerd, slaat u de waarden op. Klik hierop, ga terug naar zendingen en druk op verzending naar ESRF.Druk het verzendlabel af en stuur de monsters. Gebruikers moeten een pick-up regelen met een koerier met behulp van de ESRF-accountgegevens. Op de dag van het experiment worden monsters overgedragen aan de Massive one high capacity dauw-er.Beam line wetenschappers lanceren dan de gegevensverzameling, die op afstand kan worden gevolgd door gebruikers. Voor elk ander voorbeeldtype ontvangen gebruikers een e-mail waarin ze worden geïnformeerd dat de gegevensverzameling is gestart. De uitvoering van alle stappen in alle workflows kan online en in realtime worden gevolgd.Dit is toegankelijk voor de gebruiker door in te loggen op ISPyB. De resultaten kunnen ook worden bekeken en gedownload. Voor elk geanalyseerd monster, de resultaten van het automatische experiment op ISPyB onderzoeken.Klik op de gewenste experimentele sessie op ID30A1. Selecteer de voorkeurspijplijn voor automatische verwerking. Download de gegevens die zijn uitgeschreven in de juiste ruimtegroep met de hoogste volledigheid en hoogste resolutie.Door te klikken op de laatste resultaten te verzamelen en vervolgens te downloaden. De MX press P workflow werd gebruikt door de ESRF bundel lijn Massive een volledig automatisch monteren, centreren in de x-ray beam, karakteriseren, en het verzamelen van volledige diffractie gegevenssets van een reeks kristallen van de menselijke GCSH. De monsters werden gemonteerd en de lus geanalyseerd voor een gebied te scannen.Na de diffractieanalyses werden vier punten geselecteerd in het kristal voor het verzamelen van gegevens. Handmatige structuur bepaling door moleculaire vervanging leverde een hoge kwaliteit elektronendichtheid kaart na een enkele geautomatiseerde verfijning cyclus. Voor deze gegevensset, de geautomatiseerde pijplijn snijd de gegevens op een punt drie twee angstrom resolutie.Gebruikers kunnen echter besluiten om de gegevens met een lagere resolutie te knippen. Continue elektronendichtheid is zichtbaar voor de gehele aminozuurketen, afgezien van eterminal histidine tag. Van de vier substituties die menselijke en rundvee-GCSH onderscheiden, zijn er drie gemakkelijk herkenbaar in de elektronendichtheid.Dit is minder duidelijk voor de aspartic zuur tot lysine 125 substitutie. Waarvoor de elektronendichtheid van de zijketen slechts gedeeltelijk wordt opgelost door flexibiliteit. Het momenteel verkregen model heeft een R-werkwaarde van 20 punt vier procent en een R-vrije waarde van 23 punt acht procent en kan verder worden geoptimaliseerd door extra cycli van geautomatiseerde en handmatige modelbouw en verfijning.Het is belangrijk om de eisen aan uw systeem af te stemmen. Als u bijvoorbeeld de reeds waargenomen resolutie op een bekende waarde stelt, kan dit tijd besparen en zorgen voor een betere gegevensverzameling. Volledig automatische gegevensverzameling heeft gedemocratiseerd kristallografie en nu zelfs kleine laboratoria kunnen beginnen aan beroemde project toen dit haalbaar was voor slechts met enorme mankracht.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS Gedetailleerde karakterisering en kwantificering van glutamine en asparagine Deamidatie in Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microkristallografie van eiwitkristallen en<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffractie

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Structurele Studies van macromoleculen in oplossing met behulp van kleine Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering van membraan transporters door Heterologeuze expressie in E. coli en productie van membraan blaasjes

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Volledig verwerkte recombinant KRAS4b: isoleren en karakteriseren van het Farnesylated en gemethyleerd eiwit

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

De afleiding van eiwitkristallen met I3C met behulp van Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimaliseren van de groei van endothiapepsine kristallen voor seriële kristallografie experimenten

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Vaste doel seriële gegevensverzameling bij Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

RIBO-seq in Bacteria: een Sample Collection and Library Preparation Protocol voor NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Reconstitutie van Msp1-extractieactiviteit met volledig gezuiverde componenten

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...