Name: fully autonomous characterization and data collection from crystals of biological macromolecules
Uploaded: 2019-03-22T12:30:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules at JoVE.com

המחברים תודה על ESRF עבור beamtime.

הערה: הייצור, טיהור, התגבשות GCSH מתוארים 1 קובץ משלים.
1. תיאור קצר של קריסטל הרכבה והכנה מנותק
<ol><li>מיקום לולאת ניילון או תמיכה נוספת של הרכבה קריסטל כבר קבוע כדי סיכה עמוד השדרה תחת אחת או יותר קריסטלים והרם אותם מחוץ הפתרון משקעים (20 µL של 0.5 M נתרן formate pH 4.0 + 25 µL של חלבון פתרון).<ol>
<li>להסיר את הנוזל בתפזורת סביב crystal(s) על-ידי נגיעה ההר עם הפתיל נייר למצוץ את הנוזל העודף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להשרות את crystal(s) הפתרון cryoprotective המכיל את המשקעים פתרון בתוספת 30% גליצרול; לאחר מכן, להסיר את התמיכה קריסטל והן את crystal(s).<ol>
<li>להסיר את הנוזל בתפזורת סביב crystal(s) על-ידי נגיעה ההר עם הפתיל נייר למצוץ את הנוזל העודף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חיסול ההר לתוך בקבוקון עמוד השדרה מלא עם חנקן נוזלי, לאחסן, יחד עם כל קריסטלים אחרים שהוכנו באופן דומה, ב האירופי לביולוגיה מולקולרית מעבדה (EMBL) / ESRF לטעום פאק מחליף9 בטמפרטורת חנקן נוזלי. הערה: crystal(s) יציבים במצב זה עד beamtime זמין.</li>
</ol>2. מבקש beamtime על היונגפראו-1
<ol><li>לבקש beamtime מוקדם ככל האפשר בדף הבית ESRF (-http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying). הערה: ישנם מספר המצבים האפשריים של גישה beamlines ESRF MX. מעבדות ניתן להחיל באופן קולקטיבי כחלק של בלוק הקצאת קבוצה (שקית), יש beamtime שהוקצה עבור 2 שנים. אם קבוצות רוצה להחיל בנפרד, הם יכולים להחיל עבור מתגלגל גישה, דבר המאפשר גישה מהירה beamlines לאחר ביקורת עמיתים. ההצעה של הקבוצה שנסקרו ופריט ע י קבוצת בטיחות ESRF מי רשאי לבקש פרטים נוספים. אם ההצעה תתקבל, הניסוי מספר והסיסמה שיועבר. מחקר קניינית יכול להתבצע על ידי רכישת beamtime.</li>
	<li>להשלים את הבטיחות הנדרשים כדי האימונים באינטרנט (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).</li>
	<li>הזמנת beamtime על לוח השנה מאסיף-1. הערה: זה אפשרי להזמין עד מקסימום של 50 מחזיקי הדגימה כדי להיות מנותח לפי משמרת.</li>
	<li>מלאו את טופס להכריז על ניסוי בדואר (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), יחד עם המידע הבטיחות הנדרשים, על הדגימות שעומדים ניתן למדוד.</li>
</ol>3. יצירת תוכנית עקיפה ISPyB
הערה: התוכנית עקיפה מחזיקה את כל המידע הדרוש עבור מדגם ב ISPyB והוא יכול להכיל פרטים נוספים כדי להתאים את הניסוי לבצע עבור כל דגימה.
<ol><li>פתח ISPyB (ב https://exi.esrf.fr/).</li>
	<li>בחרו ' MX ניסויים.</li>
	<li>התחברו עם הניסוי מספר ואת הסיסמה.</li>
	<li>לחץ על משלוח | הוסף חדש לספק את המידע הדרוש. לחץ על שמור.</li>
	<li>לחץ על הוסף חבילה ומלא המידע המבוקש. לחץ על שמור.</li>
	<li>לאחר מכן, לחץ על הוסף מיכל, לתת את הברקוד פאק כשם ובחרו ' פאק עמוד השדרה. לחץ על שמור.</li>
	<li>לחץ על סמל מיכל, לערוך, ומלא המידע הדרוש, כמו חלבון שם, זרימת עבודה מועדפת, קריסטל בעמדה הדיסקוס, וכו ', בנוגע הדגימות.</li>
	<li>בחר את החלבון (לדוגמה, GCSH או ליזוזים), אשר אושרה על ידי הקבוצה בטיחות ESRF.</li>
	<li>הזן שם ייחודי כדי לזהות כל דגימה בודדת. זה אפשרי באופן אופציונלי לסרוק את הברקוד pin. שאר המידע שלהלן הוא אופציונלי.</li>
	<li>הזן את המידע האופציונלי.<ol>
<li>עבור כל דגימה בודדת, הזן את סוג הניסוי (קרי, MXPressE_SAD, ניקוד או MXPressO, וכו ', ברירת המחדל MXPressE) תחת סוג הוצאה. זה מגדיר זרימת עבודה אוטומטית אשר ישמש כדי לעבד כל קריסטל. בהתחשב בכך הקריסטלים GCSH הן מחטים, לבחור MXPressP.</li>
		<li>הזן קבוצת מרחב (לדוגמה, P1, P2 או C212121), אם ידוע. במקרה כזה, זה ישמש לחישוב אסטרטגיה אוסף נתונים ועל -ידי צינורות עיבוד נתונים אוטומטי זמין.</li>
		<li>הזן את הרזולוציה הרצויה (ברירת מחדל: dדקות = 2.0 Å). אפשרות זו מגדירה את המרחק קריסטל-כדי-גלאי עבור רשת הראשונית סריקות, אפיון, איסוף הנתונים המוגדר כברירת מחדל.</li>
		<li>הגדרת רזולוציה הסף הרצויה (לדוגמה, 1.5 Å או 2.3Å), כדי למנוע האוסף של מלא datasets מקריסטלים אשר מכמותה לפי מגבלה זו. זה באפשרותך לחסוך זמן מרחב וניתוח של אחסון נתונים.</li>
		<li>הגדר את שלמות התרגום הנדרש (ברירת מחדל: 0.99). הגדר הריבוי הנדרש (ברירת מחדל: 4). אם אחד או יותר קריסטל מוכל על התמיכה לדוגמה, להגדיר את המספר המירבי של גבישים כדי להיות מנותח. ערך ברירת המחדל הוא 1 או 5 עבור MXPressP.</li>
		<li>בחר את גודל הקרן המתאימה (ברירת מחדל: 50 מיקרומטר). אם ערך מסוים לא נבחרה, X-ray-מרכוז, לחישובי אסטרטגיה אוסף נתונים יבוצעו עם קרן בגודל של 50 מיקרומטר. הערה: במהלך כל איסוף עוקבות של ערכות נתונים מלאה, גודל קרן תותאם באופן אוטומטי.</li>
		<li>לשים בקבוצה החלל, אם ידוע, בעמודה קבוצה שטח בכפייה. הגדר את הקרינה-הרגישות של הקריסטלים (0.5 – 2.0 רגישות נמוך עד גבוה, עם ערך ברירת מחדל של 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>אם רצונך בכך, לקבוע את זווית הסיבוב הכולל להיות שנאספו עבור אוסף הנתונים (dataset) מלא (ברירת מחדל: זווית הסיבוב הכולל שנקבע על-ידי eEDNA).</li>
	<li>שמור את הערכים. לחץ על חזור אל משלוחים. לחץ על שלח המשלוח ל- ESRF.</li>
	<li>להדפיס את התווית משלוח ולשלוח את הדגימות. המשתמשים צריכים לארגן טנדר עם שליח, באמצעות פרטי חשבון ESRF. הערה: חשוב מאוד לבחור תווית החזרה כלול לאפשר את החזרת חלקה של דגימות (ראו https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).</li>
</ol>4. איסוף נתונים, צפייה ואחזור
הערה: ביום של הניסוי, דגימות מועברים אל היונגפראו-1 גבוהה קיבולת דיואר (HCD). הפרעות לקרן החלקיקים מדענים ההשקה אז איסוף הנתונים, אשר יכול לבוא המשתמשים מרחוק. עבור כל סוג דגימה שונים משתמשים לקבל הודעת דואר אלקטרוני המיידעת אותם כי החלה איסוף הנתונים. כאמור, ניתן בעקבות הביצוע של כל השלבים כל זרימות העבודה באינטרנט, בזמן אמת על ידי המשתמש באמצעות ISPyB, שממנו התוצאות יכול להיות לצפייה ולהורדה.
<ol><li>עבור כל דגימה לבדיקה, לבחון את התוצאות של הניסוי אוטומטית ב ISPyB (https://exi.esrf.fr/).<ol>
<li>היכנס, עם ניסוי מספר וסיסמה, ולחץ על ההפעלה הניסיונית הרצוי ב- ID30A-1.</li>
		<li>בחר המועדפת (בעל ניקוד העליון) עיבוד אוטומטי צינור (לדוגמה, ' רימונים ' או ' XDS_APP '), להוריד את הנתונים לפלט בקבוצה השטח הנכון עם השלמות הגבוהה ביותר ואת הרזולוציה הגבוהה ביותר על ידי לחיצה על תוצאות איסוף האחרון , לאחר מכן, הורד. הערה: כל התמונות רשת שינוי ', ' קו, אפיון הן בספריית משנה עבור כל דגימה, שנקרא /MXPressE_01. ESRF יפעיל באופן אוטומטי חמש חבילות עיבוד נפרדות, כלומר EDNA_proc12, רימונים12, XDS_APP14, autoPROC15, ו XIA216. שילוב נתונים מבוסס על XDS, למעט XIA2, אשר מבוססת על החוגה. כל החבילות הן להפעיל מצבי חריגות ו- nonanomalous, המאפשר את הגילוי האוטומטי של אות חריג, אם נוכח הנתונים, כדי לשמש סאד בהדרגה פרוטוקולים. כל חבילה משתמש פרמטרים שונים, עצי החלטה, כלומר כי כמה חבילות לרוץ טוב יותר עם דוגמאות מסוימות. עם זאת, הדבר עשוי להפוך עבור מספר גדול של תוצאות כאשר מספר חבילות וקבוצות שטח אפשרי מהצהוב. התוצאות, לכן, מדורגים בהתאם בערך הרזולוציה ואת מדדי איכות נוספים, כגון Rמיזוג מעטפת ברזולוציה הנמוכה ביותר, CC(1/2) ולאחר השלמות. וזה מכוון מנחה את המשתמש אל ערכות הנתונים הטוב ביותר, אבל כל מקום אפשרי קבוצות ותוצאות צריך להיבדק בקפידה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לפתוח את תיקיית שהורדו, אשר יכלול את כל קבצי יומן רישום של XDS_ASCII שלא מוזג. HKL וקבצים .mtz הממוזג, שקנה המידה שלה השתנה. הערה: במקרה המבנה (בפורמט PDB) של החלבון מעניינים או של homolog קרוב הועלה אל ISPyB בתחילת הניסוי, צינור עיבוד אוטומטי-ESRF באופן אוטומטי יבצע תחליף מולקולרית (MR) להפעיל אותו באמצעות את המבנה הידוע חיפוש מודל על הטוב ביותר הניקוד פתרון. התוצאות של הצינור מר מוצגים ב- ISPyB, ניתן למצוא את תיקיית הנתונים מעובדים (לדוגמה, /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ mrpipe_dir /). . הנה, הדגם הסופי תיקרא coot1.pdb ו- sidechains.mtz נתונים של השתקפות. שימו לב כי הצינור עשוי להפחית את הסימטריה של התא (תא פרימיטיבי הפחתת) כדי להגביר את הסבירות של מציאת פתרון. במקרה כאן, הצינור מר כתב את הפתרון באופן המונוקלינית תא (C2) ולא תא האורתורומבית (C2221). פרטים על איך לבצע תחליף מולקולרית להפעיל באופן ידני (דוגמה עבור הפתרון השני הבקיע ביותר עיבוד אוטומטי) כולל הקבצים המשלימים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hui, R., Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+protein+crystallization.">High-throughput protein crystallization.</a> Journal of Structural Biology. 142 (1), 154-161 (2003).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASSIF-1:+a+beamline+dedicated+to+the+fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).</li><li>Svensson, O., Malbet-Monaco, S., Popov, A., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">Fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (8), 1757-1767 (2015).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrystalDirect:+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films.">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68, 1393-1399 (2012).</li><li>Nurizzo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RoboDiff:+combining+a+sample+changer+and+goniometer+for+highly+automated+macromolecular+crystallography+experiments.">RoboDiff: combining a sample changer and goniometer for highly automated macromolecular crystallography experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (8), 966-975 (2016).</li><li>Bowler, M. W., Svensson, O., Nurizzo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automatic+macromolecular+crystallography:+the+impact+of+MASSIF-1+on+the+optimum+acquisition+and+quality+of+data.">Fully automatic macromolecular crystallography: the impact of MASSIF-1 on the optimum acquisition and quality of data.</a> Crystallography Reviews. 22 (4), 233-249 (2016).</li><li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography.">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li><li>Svensson, O., Gilski, M., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-position+data+collection+and+dynamic+beam+sizing:+recent+improvements+to+the+automatic+data-collection+algorithms+on+MASSIF-1.">Multi-position data collection and dynamic beam sizing: recent improvements to the automatic data-collection algorithms on MASSIF-1.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74, 433-440 (2018).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB:+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Monaco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+processing+of+macromolecular+crystallography+X-ray+diffraction+data+at+the+ESRF.">Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).</li><li>Kikuchi, G., Motokawa, Y., Yoshida, T., Hiraga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+cleavage+system:+reaction+mechanism,+physiological+significance,+and+hyperglycinemia.">Glycine cleavage system: reaction mechanism, physiological significance, and hyperglycinemia.</a> Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and Biological Sciences. 84 (7), 246-263 (2008).</li><li>Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDSAPP2.0.">XDSAPP2.0.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).</li><li>Vonrhein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+and+analysis+with+the+autoPROC+toolbox.">Data processing and analysis with the autoPROC toolbox.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xia2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Higashiura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+X-ray+crystal+structure+of+bovine+H-protein+at+0.88+&#197;+resolution.">High-resolution X-ray crystal structure of bovine H-protein at 0.88 &#197; resolution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (6), 698-708 (2010).</li><li>Sanishvili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+7+&#181;m+mini-beam+improves+diffraction+data+from+small+or+imperfect+crystals+of+macromolecules.">A 7 &#181;m mini-beam improves diffraction data from small or imperfect crystals of macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (4), 425-435 (2008).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffraction+cartography:+applying+microbeams+to+macromolecular+crystallography+sample+evaluation+and+data+collection.">Diffraction cartography: applying microbeams to macromolecular crystallography sample evaluation and data collection.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (8), 855-864 (2010).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+Experience+of+Controlled+Crystal+Dehydration:+Results+from+the+European+Synchrotron+HC1+Collaboration.">Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration.</a> Crystal Growth &amp; Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+harvesting+and+processing+of+protein+crystals+through+laser+photoablation.">Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

Beamlines אוטומטי לחלוטין לספק אוטומטיות האפיון ואיסוף נתונים ממספרים גדולים של גבישים macromolecular ללא הנוכחות של מדען, את הפרעות לקרן החלקיקים או מרחוק, ונדרשת. שימוש beamlines אוטומטי לגמרי יש יתרונות רבים בהשוואה באופן ידני. לדוגמה, המדגם אוטומטיות מרכוז, המבוססת על רשת הרנטגן, קו סורק, יותר מדויק מאשר לבצע עם העין האנושית כמו זה אינו מושפע אפקטים תרמיים או אופטי. ואכן, אלה סריקות רשת וקו לספק נתונים נוספים (קרי, מידות מפורטת של הקריסטל ואת הטוב ביותר diffracting אזור של הגביש) אשר חשובים בקביעת גודל קרן הנכון כדי להשתמש עבור אוסף נתוני — במיוחד עבור גבישים קטנים 18— לעיתים קרובות לגרום גם שיפור איכות הנתונים עקיפה שהושג. יתר על כן, על ידי ניצול של הפרמטרים המוגדרים על-ידי המשתמש בכיוונון של ניסויים אוטומטיים, התפורות השלבים בזרימות עבודה ספציפיים ולביצועי המערכת שנבחנה, ובכך נוספים מיטוב שיעור ההצלחה בניסוי.
לוקחים ביחד, האמינות של זרימות העבודה זמין, גישה ישירה של הפרעות לקרן החלקיקים (משתמשים עצמית תזמון, באמצעות לוח שנה [ראה לעיל]), ואת הגישה אוטומטית לחלוטין של מאסיף-1 מספק קפדני, תפוקה גבוהה, ואת לחיסכון בזמן אלטרנטיבה קלאסית ניסויים MX על הידיים ואת הפוטנציאל ליישם נהלים ויישומים מתקדמים יותר לתוך זרימות עבודה אוטומטיות. בעתיד הקרוב, קרטוגרפיה קריסטל תלת-ממד19 תיושם כדי לשפר את הדיוק של רנטגן מרכוז, בעוד בפרוטוקולים מורכבים יותר, כגון קריסטל התייבשות ניסויים20, יתבצע באופן אוטומטי. יש לקוות כי איסוף נתונים עצמאי לחלוטין תהפוך שיטה סטנדרטית ב- MX, אספקת נתונים באיכות גבוהה עבור מסכי מולקולה קטנה פרגמנט, אופטימיזציה של ההקרנה של מספרים גדולים של לקוי diffracting קריסטלים ולספק אוטומטית שלב מידע לפתור קריסטל מבנים de novo. בשילוב עם ההתפתחויות קציר אוטומטיות של גבישים21, האפשרות של חלבון קריסטל מבנה הפתרון כשירות אוטומטית יכול גם להפוך למציאות.

קביעת מבנה תלת ממדי של חלבונים ספציפיים חיוני בביולוגיה. המידע נגזרת עושה אז שופך אור על הפונקציה ביולוגי ועל את הצורה וספציפיות של אתרים פעיל ו/או מחייב הכלול המולקולה שנבחנה. במקרים רבים, זה מאפשר מנגנון פעולה כדי לקבוע או, במידת הצורך, פוטנציאל מולקולות טיפולית שפותחה. MX הטכניקה הנפוץ ביותר להשיג מידע מבניים, אבל צוואר בקבוק הוא קביעת התנאים אופטימליים כדי להשיג גבישים diffracting היטב. לכן, התגבשות ניסויים מבוצעים בתנאים שונים רבים, ואז מוקרנים למציאת הקריסטלים הטוב ביותר לשימוש עבור איסוף נתונים עקיפה. האוטומציה של ההתקנה של התגבשות ניסויים1 בבירור עזר בהקשר זה. עם זאת, והשלבים הבאים (קרי, קריסטל הרכבה, הקרנה עקיפה, וגם איסוף נתוני דיפרקציה) בדרך כלל מתבצעות באופן ידני, לוקח הרבה זמן, מאמצים ומשאבים. האוטומציה של ההקרנה עקיפה ואיסוף נתונים, לפיכך, פירושו רווח עצום של זמן ויעילות.
ההקרנה עקיפה ואיסוף נתונים ב- MX מתבצע לרוב ב beamlines סינכרוטרון MX שבו אוטומציה הנחתה במידה רבה את התהליך הזה. עם זאת, ברוב המקרים, זה הכרחי עבור המדען להיות נוכח הפרעות לקרן החלקיקים במהלך ניסוי או להפעיל את זה מרחוק. לאחרונה, דור חדש של beamlines MX אוטומטי לגמרי כבר מפותחת2. כאן, המשתמשים לא צריך להיות נוכח, פיזית או מרחוק, במהלך מפגש ניסיוני. זה מאפשר למדענים מבזבז יותר זמן על פחות משימות שגרתיות, במקום לבלות ימים כולו, ולעתים קרובות לילות והקרנה קריסטלים איסוף נתונים עקיפה. הראשון אוטומטית לחלוטין הפרעות לקרן החלקיקים בעולם היא מאסיבית אוטומטי מדגם הבחירה משולב מתקן (MASSIF-1, ID30A-1)2,3 -מתקן קרינה סינכרוטרון האירופית (ESRF). יש סביבה ייחודית מדגם בהם דיואר לדוגמה, המכיל קיבולת גבוהה פועלת במשולב עם מחליף רובוטי מדגם שפועל גם של הפרעות לקרן החלקיקים מד זווית4,5. מאסיף-1 הוא הפרעות לקרן החלקיקים undulator, מצויד יחיד-פוטון-סופר היברידית פיקסל גלאי6, הפועלת על אורך גל קבוע של 0.969 Å (12.84 קוו) עם קרן רנטגן (2 x 1012 פוטונים/s) אינטנסיבי. ניתן להתאים את גודל קרן במיקום מדגם בין מינימום של 10 מיקרומטר (קרן עגול) למקסימום של מיקרומטר x 65 100 מיקרומטר (אופקי לפי גודל קרן אנכי). בממוצע, הפרעות לקרן החלקיקים ניתן לעבד, באופן אוטומטי לחלוטין אופנה קריסטלים 120 (ראה להלן), ב- 24 שעות. המבצע של הפרעות לקרן החלקיקים מבוססת על סדרה של זרימות עבודה7, שכל אחד מהם לוקח החלטות נבונות בהתבסס על התוצאה של השלבים הקודמים בזרימת העבודה, על מנת להבטיח את המדידה של הנתונים אפשרי בצורה הטובה ביותר מכל המדגם במחקר. בפרט, הערכת המאפיינים עקיפה של דוגמה אישית לוקח בחשבון קריסטל נפח, שטף, ומבטיח, איפה הקריסטל הוא גדול יותר מאשר קרן רנטגן, כי רק האזור הטוב ביותר של הגביש משמש עבור הנתונים הבאים אוסף. ערכות נתונים עקיפה, לפיכך, אופטימיזציה עבור הרזולוציה המרבית עם קרינה ממוזער נזק2,3. תובעניים פרוטוקולים אוסף נתונים, כגון אסטרטגיות אוסף מדומים לוליינית (multi-position) נתונים עבור אוסף נתונים הן מקומיים והן יחיד באורך הגל חריגה עקיפה (SAD) הינם גם זמינים8.
ניסויים אוטומטי לחלוטין על היונגפראו-1 כרוכים cryocooling, הרכבה הקריסטלים על הר מגנטי מדגם מתאים תקן הציוד הרצוי הפרעות לקרן החלקיקים פינס עמוד השדרה9, הזנת הפרמטרים הרצויים ניסיוני ' עקיפה תוכנית ' שולחן במערכת משולב beamlines (ISPyB) חלבון קריסטלוגרפיה10, מערכת ניהול מידע מבוססות web לניסויים MX, ושליחת הדגימות הפרעות לקרן החלקיקים. -ESRF, כל העלויות של התחבורה של הדגימות של הפרעות לקרן החלקיקים ואליה נתמכים על ידי המשרד משתמש ESRF (ראה באתר האינטרנט של ה ESRF11 לפרטים). ב מאסיף-1, אין הגבלות על גודל לולאה או קריסטל איכות. בעת בחירת תוכנית עקיפה גביש נתון, המשתמש באפשרותך להשתמש בהגדרות ברירת המחדל או לבחור זרימות עבודה מסוימות, אשר יכול להיות מותאם אישית עבור כל דגימה. מספר זרימות עבודה מתוכנת מראש הינם זמינים. בזרימת העבודה של3 MXPressE, הלולאה לדוגמה, המכיל מיושר קודם מיקום הדגימה באמצעות מרכוז אופטי. לאחר מכן, מבוססת על קרני X מרכוז מבטיחה כי האזור הטוב ביותר של הגביש ממורכזת על הקורה צילום רנטגן. אסטרטגיות אוסף נתונים מחושבים ואז באמצעות eEDNA, מסגרת לפיתוח יישומים מבוססי-תוסף במיוחד עבור ניתוח נתונים מקוון בתחום הניסויים רנטגן, לתוך חשבון קריסטל ונפח שטף בזמן אמת-הפרעות לקרן החלקיקים. בעקבות האוסף של ערכת נתונים מלא עקיפה, אז זה מעובד באמצעות סדרה של עיבוד נתונים אוטומטי צינורות12 , התוצאות הופכים לזמינים עבור הורדה, בדיקה ב- ISPyB. MXPressE סאד3 זרימת העבודה מכוונת לגבישים selenomethionine של החלבון היעד, מנצלת את העובדה האנרגיה ההפעלה של מאסיף-1 הוא מעט מעל קצה Se K. . כאן, האסטרטגיה אוסף נתונים eEDNA MXPressE ממוטב עבור איסוף נתונים עצוב (קרי, גבוהה יתירות, ועם הרזולוציה מוגדר איפה Rמיזוג בין זוגות Bijvoet להלן 5%). למסך את המאפיינים עקיפה של סדרה של גבישים ללא איסוף נתונים עוקבות, שזרימת העבודה3 MXScoreיכול לשמש כדי לייצר הערכה באיכות מלאה של הקריסטלים מנותח. בזרימת העבודה של3 MXPressI, 180 מעלות של סיבוב נתונים נאספים באמצעות תנודות 0.2 ° ושימוש הזווית פי המוצא ואת הרזולוציה נקבע על ידי אסטרטגיית eEDNA. MXPressO 3 כוללת רזולוציה preobserved לתוך זרימת העבודה (ברירת מחדל: dדקות = 2 Å). כדי לבצע הערכה ראשונית של הקריסטלים הנובע התגבשות הניסיון, מוצע שזרימת העבודה3 MXPressM. זה מבצע רשת שינוי במינון גבוה לסרוק הכיוון הרחב ביותר של מדגם תמיכה באיסוף נתונים אין או מרכוז. לאחרונה, זרימות שני ניסוי חדש, MXPressP , MXPressP_SAD, ואשר לבצע אוספי נתונים pseudohelical, היו מיושמים8. ניתן בעקבות הביצוע של כל השלבים כל זרימות העבודה באינטרנט, בזמן אמת על-ידי המשתמש, באמצעות ISPyB.
הנה אנחנו מראים כיצד להכין את ניסוי ה-MX אוטומטית לחלוטין על היונגפראו-1 וכיצד לאחזר ולנתח את הנתונים הנובעים הניסוי. לדוגמה, אנו משתמשים אנושיים גליצין מיטוכונדריאלי המחשוף מערכת חלבונים H (GCSH). חלבון זה המכיל חומצה ליפואית היא חלק ממערכת המחשוף גליצין אחראי על ההשפלה של גליצין. מערכת זו נוספת כוללת החלבון P decarboxylase תלויי-פוספט גליצין pyridoxal, החלבון T, אנזים הדורשים tetrahydrofolate, החלבון L, lipoamide דהידרוגנאז. GCSH מעבירה את הקבוצה מתילאמין של גליצין של החלבון P החלבון T. פגמים החלבון H הם הגורם nonketotic hyperglycinemia (NKH) בני13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline MASSIF-1</td>
			<td>ESRF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21DE3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzing membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>132655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loop</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MonoQ 5/50 GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5166-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINE pucks</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CSM003-0001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1064430500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCSH purification buffer</td>
			<td>20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCSH cryo-protection buffer</td>
			<td>0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MxCube</td>
			<td></td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCube2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES workflow server</td>
			<td></td>
			<td>Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLISS beamline control</td>
			<td></td>
			<td>Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AUTO processing of images</td>
			<td></td>
			<td>Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEST and EDNA</td>
			<td></td>
			<td>Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phaser MR</td>
			<td></td>
			<td>McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td></td>
			<td>Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refmac5</td>
			<td></td>
			<td>Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240--255 (1997).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matthews</td>
			<td></td>
			<td>Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully autonomous characterization and data collection from crystals of biological macromolecules

קרני רנטגן גבוהה-זוהר יחד עם אוטומציה הובילו השימוש beamlines מבוססי סינכרוטרון macromolecular קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן (MX) אפילו הפרוייקטים המאתגרים ביותר בביולוגיה מבנית. עם זאת, רוב מתקני עדיין דורשים את הנוכחות של מדען באתר כדי לבצע את הניסויים. דור חדש של beamlines אוטומטיות המוקדש באופן אוטומטי לחלוטין אפיון, איסוף נתונים, גבישים של מקרומולקולות ביולוגיות פותחה לאחרונה. Beamlines אלה מייצגים כלי חדש לביולוגים מבניים למסך את התוצאות של ניסויים התגבשות ראשונית ו/או האוסף של מספר גדול של ערכות נתונים עקיפה, ללא צורך לשלוט על הפרעות לקרן החלקיקים עצמם משתמשים. הנה אנחנו מראים כיצד להגדיר ניסוי סינון אוטומטי, איסוף נתונים, כיצד ניסוי זה ביצע את הפרעות לקרן החלקיקים, כמה ערכות הנתונים וכתוצאה מכך מעובדים, איך, במידת האפשר, מבנה גבישי של מקרומולקולה הביולוגי נפתרה.

זרימת העבודה MXPressP שימשה ב הפרעות לקרן החלקיקים ESRF מאסיף-1, באופן מלא באופן אוטומטי, הר, במרכז קרן רנטגן, לאפיין, ולאסוף עקיפה מלא ערכות נתונים מסידרה של גבישים של האדם GCSH. הדגימות רכוב וניתח הלולאה עבור אזור לסרוק (איור 1, משמאל). לאחר הניתוח של עקיפה, נבחרו ארבע נקודות בתוך הקריסטל עבור איסוף נתונים (איור 1, ימינה). עיבוד על ידי צינורות ניתוח נתונים אוטומטיים, כולל צינור מר, הניב datasets באיכות גבוהה (טבלה 1) שנמצא פתרון מר עוקבות. האחרון מאפשר למשתמשים במהירות להעריך אם את ערכת הנתונים שהושג ודגם משומשים חיפוש מתאימים בהדרגה על ידי החלפת מולקולרית. בנוסף, הנוכחות של ליגנדים יכולה להישפט, וכך מאפשר למשתמש להתמקד רק datasets המבטיחים ביותר לצורך ניתוח נוסף. מכשור לקביעת קשיות ומבנה ידנית על ידי מר הניב מפת צפיפות אלקטרונים באיכות גבוהה לאחר יחיד אוטומטית עידון מחזור (איור 2 א). בשביל זה dataset, הצינור אוטומטית חותכים את הנתונים 1.32 רזולוציה; עם זאת, משתמשים יכולים עדיין מחליט לוותר על הנתונים ברזולוציה נמוכה יותר להגיע בסטטיסטיקות איכות שונים (CC1/2, < I/σ(I) >, Rאותי) במעטפת ברזולוציה הגבוהה ביותר. למבנה הגבישי של מבנה GCSH האנושי דומה לזה של ה-שור חלבון (3KlR)16.
צפיפות אלקטרונים רציפה היא גלויה, שרשרת חומצות אמיניות שלם, מלבד התג היסטידין N-מסוף. ארבעה התחליפים להבדיל GCSH שור ואנושי, של שלוש הן ולהמציא צפיפות אלקטרונים (Ile/Val66, Asp/Glu98 ו- Leu/Phe149; איור 2b -d). . זה פחות ברור עבור ההחלפה Asp/Lys125 אשר צפיפות אלקטרונים של שרשרת הצד נפתרה באופן חלקי בלבד בשל גמישות (איור 1e). המודל שהושג כיום יש Rלעבוד , ערכי Rחינם 20.4% ו- 23.8%, בהתאמה, ניתן למטב עוד יותר על ידי מחזורים נוספים של בניית מודל אוטומטיות וידניות, עידון.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>צינור רימונים</td>
			<td>צינור XDS_APP</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">איסוף נתונים ועיבוד</td>
		</tr>
<tr>
<td>רנטגן מקור / קרן קו</td>
			<td colspan="2">ESRF / מאסיף-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>אורך הגל (Å)</td>
			<td colspan="2">0.966</td>
		</tr>
<tr>
<td>רזולוציה (Å)</td>
			<td>41.88 – 1.48 (1.53-1.48)</td>
			<td>41.86-1.32 (1.39 – 1.32)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">סה כ/Unique השתקפויות</td>
			<td>127670 / 28644</td>
			<td>177332 / 40134</td>
		</tr>
<tr>
<td>(12178 / 2775)</td>
			<td>(23772 / 5714)</td>
		</tr>
<tr>
<td>חבורת סימטריות מרחבית עבור יצירת אינדקס, שינוי קנה מידה של ומיזוג</td>
			<td>C222</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>מידות תא</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>א, ב, ג ()</td>
			<td>42.20, 83.75, 95.85</td>
			<td>42.19, 83.72, 95,82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mosaicity</td>
			<td>0.05</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rאותי (%)</td>
			<td>10.0 (110.7)</td>
			<td>11.1 (198.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>< I/σ(I) ></td>
			<td>9.6 (1.3)</td>
			<td>7.6 (0.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>סמ ק1/2 (%)</td>
			<td>99.7 (53.9)</td>
			<td>99.7 (19.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>השלמות (%)</td>
			<td>99.6 (99.6)</td>
			<td>99.5 (98.6)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריבוי</td>
			<td>4.5 (4.4)</td>
			<td>4.4 (4.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">החלפת מולקולרית ועידון דגם ראשוני</td>
		</tr>
<tr>
<td>חבורת סימטריות מרחבית עבור בהדרגה</td>
			<td>C2</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>מידות תא</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>א, ב, ג ()</td>
			<td>83.74, 42.18, 95.82</td>
			<td>42.19, 83.72, 95,82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Α, Β, Γ (°)</td>
			<td>90, 90.03, 90</td>
			<td>90, 90, 90</td>
		</tr>
<tr>
<td>חיפוש מודל עבור מר (PDB)</td>
			<td>3KLR</td>
			<td>3KLR</td>
		</tr>
<tr>
<td>מולקולות חלבון / ASU</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>חלבון שאריות</td>
			<td>250</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rלעבוד/Rחינם (%) לאחר עידון 1</td>
			<td>24.3 / 26.5</td>
			<td>20.4 / 23.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>אורך הקשר RMSD (Å) לאחר עידון 1</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>RMSD בונד זווית (°) לאחר עידון 1</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>חריג חשוד טעות Rotamer (%) לאחר עידון 1</td>
			<td>1.07</td>
			<td>4.29</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ramachandran מועדפים/מותר/אסור (%) לאחר עידון 1</td>
			<td>95.93 / 4.07 / 0</td>
			<td>95.12 / 4.88 / 0</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: קרני רנטגן נתונים אוסף עידון, אימות נתונים סטטיסטיים- הערכים עבור המעטפת ברזולוציה הגבוהה ביותר ניתנת בסוגריים מרובעים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig1.jpg"> איור 1: לטעום ניתוח לפני איסוף נתונים- (א) האזור שנבחר עבור סריקה מוצג בתיבה אדומה. (B) הניתוח של תמונות דיפרקציה מוצגת כמפה חום. ארבע עמדות בתוך הקריסטל ממוקם נבחרו עבור איסוף נתונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig2.jpg"> איור 2: אימות חזותי של מפות צפיפות אלקטרונים שהושג לאחר עידון. מפות צפיפות אלקטרונים מתאר ב 2-רמת r.m.s. סביב () Trp143, (b) Val66 (Ile ב GCSH אנושי), ו- (ג) Glu98 (Asp ב GCSH האנושי) ומפות מתאר ב 1-רמת לר מסביב (d) Phe149 (Leu ב GCSH האנושי) ו- (e) Lys125 (Asp ב GCSH האנושי). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules at JoVE.com

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין

כאן, אנו נתאר כיצד להשתמש את הסינון האוטומטי ואת אפשרויות של איסוף נתונים זמינים ב beamlines סינכרוטרון מסוימים. מדענים לשלוח דוגמאות cryocooled סינכרוטרון, ואת המאפיינים עקיפה מוקרנים, ערכות הנתונים נאספים וכוח עיבוד ומתבצע, במידת האפשר, פתרון מבנה — כל זאת ללא התערבות אנושית.

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן היא הטכניקה הדומיננטית לקביעת מידע מבני תלת-מימדי מחלבונים. יש צורך בקווי קרן Synchrotron כדי לקבל נתונים מהקריסטלים הקטנים והמחוסנים החלשים החלבונים מייצרים. מסיבי אחד הוא קו קרן ייחודי כי זה הופך באופן מלא את התהליך של איסוף נתונים מקרומולקולים ביולוגיים.מהתהוות לדוגמה, מיקום ואיסוף נתונים סופי. אוטומציה מלאה מסוג זה חשובה מאוד מכיוון שהיא מאפשרת לחוקרים לבלות את זמנם במעבדה, במקום לאסוף נתונים על קו הקרן. קו הקרן הוא גם אינטליגנטי בממוצע, יכול לאסוף נתונים טובים יותר מאשר כאשר קו הקרן מופעל על ידי בני אדם.כדי להתחיל בפרוטוקול זה, בצע הרכבה קריסטל לבקש זמן קרן על מסיבי אחד כמתואר בפרוטוקול הטקסט. נווט אל מערכת המידע עבור קווי קרן קריסטלוגרפיה של חלבון, או אתר האינטרנט של ISPyB. בחר ניסויי MX, התחבר עם מספר הניסוי והסיסמה.לחץ על משלוח, הוסף חדש וספק את המידע הדרוש. לאחר מכן לחץ על שמור. לחץ על הוסף חבילה ומלא את המידע המבוקש.לחץ על שמור ולאחר מכן לחץ על הוסף גורם מכיל. תן את הדיסקית ברקוד כמו השם, ובחר דיסקית עמוד השדרה, שוב לחץ על שמור. לחץ על סמל המיכל וערוך, ומלא את המידע הדרוש לגבי הדגימות כגון שם החלבון, זרימת העבודה המועדפת, ומיקום הגביש, בדסקית.בחר את החלבון שאושר על-ידי קבוצת הבטיחות ESRF. הזן שם לדוגמה ייחודי כדי לזהות כל דוגמה בודדת. לחלופין, סרוק את ברקוד הסיכה.שאר המידע שיש לכלול הוא גם אופציונלי. עבור כל דגימה בודדת, הזן את סוג הניסוי. פעולה זו מגדירה איזו זרימת עבודה אוטומטית תשמש לעיבוד כל גביש.בהתחשב בכך גבישי GCSH הם מחטים, לבחור MX לחץ P.Next, להזין קבוצת חלל. אם הדבר קיים, הדבר ישמש לחישובי אסטרטגיה של איסוף נתונים ולקווי צינור עיבוד הנתונים האוטומטיים הזמינים. הזן את הרזולוציה הרצויה.פעולה זו מגדירה את מרחק הקריסטל לגלאי מסריקות רשת שינוי ראשוניות, אפיון ואיסוף נתונים המוגדר כברירת מחדל. כעת, הגדר את רזולוציית הסף הרצויה כדי למנוע איסוף של ערכות נתונים מלאות מגבישים שלא מתפזרים למגבלה זו. פעולה זו יכולה לחסוך שטח אחסון נתונים ולנתח את הזמן.הגדר את השלמה הנדרשת. לאחר מכן הגדר את הרבי הנדרש. אם יותר מקריסטל אחד כלול בתמיכה לדוגמה, הגדר את המספר המרבי של גבישים לניתוח.ערך ברירת המחדל הוא אחד או חמישה עבור MX press P.ניתן גם לבחור את גודל הקרן המתאים. שים את קבוצת הרווח, אם ידוע, בעמודת קבוצת הרווחים הכוח. ואז להגדיר את רגישות הקרינה של הגבישים.אם תרצה, הגדר את זווית הסיבוב הכוללת שיש לאסוף עבור איסוף ערכת הנתונים המלאה. לאחר הזנת כל המידע למערכת, שמור את הערכים. לחץ על, לחזור משלוחים ולחץ לשלוח משלוח ESRF.הדפס את תווית המשלוח ושלח את הדגימות. משתמשים צריכים לארגן איסוף עם שליח באמצעות פרטי חשבון ESRF. ביום הניסוי, דגימות מועברות לתרנגול בעל קיבולת גבוהה אחת.מדעני קו קרן ואז להשיק את איסוף הנתונים, אשר יכול להיות ואחריו משתמשים מרחוק. עבור כל סוג מדגם אחר, משתמשים מקבלים הודעת דואר אלקטרוני המודיעה להם שאיסוף הנתונים החל. ניתן לעקוב אחר ביצוע כל השלבים בכל זרימות העבודה באופן מקוון ובזמן אמת.אפשרות זו נגישה למשתמש על-ידי כניסה ל- ISPyB. ניתן גם להציג ולהוריד את התוצאות. עבור כל מדגם שנותח, בדוק את תוצאות הניסוי האוטומטי ב- ISPyB.לחץ על ההפעלה הניסיונית הרצויה ב ID30A1. בחר את צינור העיבוד האוטומטי המועדף. הורד את הנתונים שנכתבו בקבוצת החלל הנכונה עם השלמה הגבוהה ביותר והרזולוציה הגבוהה ביותר.על ידי לחיצה על תוצאות האיסוף האחרונות ולאחר מכן להוריד. זרימת העבודה MX press P שימשה את קו קרן ESRF מסיבי אחד כדי לטעון באופן אוטומטי לחלוטין, מרכז בקרן הרנטגן, לאפיין, ולאסוף ערכות נתונים דיפרציה מלאה מסדרה של גבישים של GCSH אנושי. הדגימות הורכבו והלולאה נותחה עבור אזור לסריקה.לאחר ניתוחי ההיתוך, ארבע נקודות נבחרו בתוך הגביש לאיסוף נתונים. קביעת מבנה ידני על ידי החלפה מולקולרית הניבה מפת צפיפות אלקטרונים באיכות גבוהה לאחר מחזור עידון אוטומטי יחיד. עבור ערכת נתונים זו, הצינור האוטומטי חתך את הנתונים בנקודה אחת שלוש שתיים ברזולוציית אנגסטרום.עם זאת, משתמשים יכולים להחליט לחתוך את הנתונים ברזולוציה נמוכה יותר. צפיפות אלקטרונים רציפה נראית לכל שרשרת חומצות האמינו מלבד תג היסטידין אטרמינלי. מתוך ארבעת ההחלפות המבדילות בין GCSH אנושי וקשוני, שלוש ניתנות לזיהוי בקלות בצפיפות האלקטרונים.זה פחות ברור עבור חומצה אספרטית ליסטין 125 החלפה. שצפיפות האלקטרונים של השרשרת הצדדית נפתרת באופן חלקי בלבד בשל גמישות. המודל המתקבל כעת יש ערך עבודה R של 20 נקודה ארבעה אחוזים וערך R חינם של 23 נקודה שמונה אחוזים והוא יכול להיות ממוטב עוד יותר על ידי מחזורים נוספים של בניית מודל אוטומטי וידני ועידון.חשוב להתאים את הדרישות למערכת שלך. לדוגמה, הגדרת הרזולוציה שכבר נצפתה לערך ידוע יכולה לחסוך זמן ולהבטיח איסוף נתונים טוב יותר. איסוף נתונים אוטומטי לחלוטין יש דמוקרטיזציה גבישית ועכשיו אפילו מעבדות קטנות יכול לצאת לפרויקט מפורסם כאשר זה היה ריאלי לפני רק עם כוח אדם עצום.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS עבור אפיון מעמיק וכימות של גלוטמין ו asparagine Deamidation ב פרוטאומיקה Shotgun

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography של קריסטלים חלבון ו<em&gt; בסולו</em&gt; השתברות

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

לימודי המבנית של מקרומולקולות בפתרון באמצעות פיזור קרני רנטגן זווית קטנה

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

עיבוד מלא של רקומביננטי KRAS4b: בידוד ואפיון של חלבון הפרג והמתילנטי

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

גניבות של גבישי חלבון עם I3C באמצעות הקרנת מטריצת מיקרו-זרעים אקראית

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

אופטימיזציה של הצמיחה של גבישי אנדותיאפפסין לניסויי קריסטלוגרפיה סדרתיים

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

איסוף נתונים טוריים של יעד קבוע במקור אור יהלום

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

שחזור פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...