Name: fully autonomous characterization and data collection from crystals of biological macromolecules
Uploaded: 2019-03-22T12:30:00
Duration: 7 min 11 s
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Os autores graças a ESRF para beamtime.

Nota: A produção, purificação e cristalização de GCSH são descritos no arquivo complementar 1.
1. breve descrição da preparação off-line e montagem de cristal
<ol><li>Posição um loop de nylon ou outro suporte de montagem de cristal já fixado um pino da coluna sob um ou mais cristais e levantá-los fora da solução de precipitação (20 µ l de 0,5 M de sódio formiato pH 4.0 + 25 µ l de solução de proteína).<ol>
<li>Remova o líquido em massa ao redor do crystal(s) tocando a montagem com uma mecha de papel para chupar qualquer excesso de líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mergulhe o crystal(s) na cryoprotective solução contendo a solução de precipitação mais 30% de glicerol; Então, remova o suporte de cristal e o crystal(s).<ol>
<li>Remova o líquido em massa ao redor do crystal(s) tocando a montagem com uma mecha de papel para chupar qualquer excesso de líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mergulhar a montagem de um frasco de coluna preenchido com nitrogênio líquido e armazená-lo, juntamente com quaisquer outros cristais preparados da mesma forma, em um laboratório Europeu de Biologia Molecular (EMBL) / ESRF amostra trocador disco9 a temperatura do nitrogênio líquido. Nota: Os crystal(s) é estáveis nessa condição até que o beamtime está disponível.</li>
</ol>2. solicitando beamtime no maciço-1
<ol><li>Solicite beamtime tão cedo quanto possível, na página inicial da ESRF (em http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying). Nota: Há um número de modos possíveis de acesso para o MX ESRF de luz síncroton. Laboratórios podem aplicar coletivamente como parte de um grupo de alocação de bloco (saco), ter beamtime alocado por 2 anos. Se grupos que pretendam candidatar-se individualmente, eles podem aplicar para rolar o acesso, o que lhes permite acesso rápido para o de Luz Síncroton, após revisão por pares. A proposta do grupo será analisada e liberada pelo grupo de segurança ESRF quem pode solicitar detalhes adicionais. Se a proposta for aceite, serão comunicadas uma experiência número e senha. Pesquisa proprietária pode ser realizada através da compra de beamtime.</li>
	<li>Complete o treinamento de segurança requeridos on-line (em http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).</li>
	<li>Livro beamtime do calendário maciço-1. Nota: É possível reservar a um máximo de 50 titulares de amostra para ser analisada por turno.</li>
	<li>Preencha uma forma de declarar um experimento pelo correio (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), juntamente com as informações de segurança necessárias, para as amostras que estão a ser medido.</li>
</ol>3. criação de um plano de difração em ISPyB
Nota: O plano de difração contém todas as informações necessárias para uma amostra em ISPyB e pode conter informações adicionais para adequar o experimento realizado para cada amostra.
<ol><li>Abrir ISPyB (em https://exi.esrf.fr/).</li>
	<li>Escolha as experiências de MX.</li>
	<li>Fazer login com o experimento número e senha.</li>
	<li>Clique na expedição | Adicionar nova e fornecer as informações necessárias. Clique em salvar.</li>
	<li>Clique em Adicionar parcela e preencha as informações solicitadas. Clique em salvar.</li>
	<li>Em seguida, clique em Adicionar recipiente, dar o código de barras do disco como o nome e escolher o disco vertebral. Clique em salvar.</li>
	<li>Clique sobre o símbolo do contentor e Editare preencha as informações necessárias, como nome de proteína, trabalho preferido, posição de cristal no disco, etc., sobre as amostras.</li>
	<li>Escolha a proteína (por exemplo, GCSH ou lisozima) que tenha sido aprovada pelo grupo de segurança ESRF.</li>
	<li>Digite um nome exclusivo de amostra para identificar cada amostra individual. É possível, opcionalmente, digitalizar o código de barras do pino. O resto da informação abaixo é opcional.</li>
	<li>Insira as informações opcionais.<ol>
<li>Para cada amostra individual, insira o tipo de experimento (i.e., MXPressE_SAD, pontuação ou MXPressO, etc., padrão MXPressE) sob Exp. tipo. Isso define qual fluxo de trabalho automático será usado para processar cada cristal. Dado que os cristais GCSH são agulhas, escolha MXPressP.</li>
		<li>Inserir um grupo de espaço (por exemplo, P1, P2 ou C212121), se conhecido. Se estiver presente, este será usado para cálculos de estratégia de coleta de dados e pelos pipelines de processamento automático de dados disponíveis.</li>
		<li>Digite a resolução desejada (padrão: dmin = 2,0 Å). Define a distância de cristal-para-detector de varreduras de malha inicial, caracterização e coleta de dados padrão.</li>
		<li>Defina a resolução limite desejado (por exemplo, 1.5 Å ou 2.3Å), para evitar que a coleção de conjuntos de dados cheios de cristais que não difração para esse limite. Isto pode salvar tempo de análise e espaço de armazenamento de dados.</li>
		<li>Definir a integralidade necessária (padrão: 0,99). Definir a multiplicidade exigida (padrão: 4). se mais de um cristal está contido o suporte de amostra, defina o número máximo de cristais para ser analisado. O valor padrão é 1 ou 5 para MXPressP.</li>
		<li>Selecione o tamanho apropriado do feixe (padrão: 50 µm). Se um valor específico não estiver seleccionado, o X-ray-centralização e cálculos de estratégia de coleta de dados serão executados com um tamanho de feixe de 50 µm. Nota: Durante qualquer subsequente coleção completas de conjuntos de dados, o tamanho do feixe será adaptado automaticamente.</li>
		<li>Colocar no grupo de espaço, se conhecido, na coluna espaço forçada do grupo. Defina a radiação-sensibilidade dos cristais (0.5 – 2.0 para baixa a alta sensibilidade, com um valor padrão de 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se desejar, defina o ângulo de rotação total a recolher para a coleção de conjunto de dados completo (padrão: o ângulo de rotação total determinado pelo eEDNA).</li>
	<li>Salve os valores. Clique em retornar às transferências. Pressione Enviar remessa de ESRF.</li>
	<li>Imprimir a etiqueta de envio e enviar as amostras. Os usuários devem organizar uma pick-up com um mensageiro, usando os detalhes de conta ESRF. Nota: É muito importante selecionar incluir rótulo retorno para permitir o regresso sem emenda de amostras (ver https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).</li>
</ol>4. recuperação, visualização e coleta de dados
Nota: No dia do experimento, as amostras são transferidas para o maciço-1 alta capacidade Dewar (HCD). Trajetória de cientistas e iniciar a coleta de dados, que pode ser seguida pelos usuários remotamente. Para cada tipo de amostra diferente, os usuários recebem um e-mail informando que a coleta de dados foi iniciada. Como já observado, a execução de todas as etapas em todos os fluxos de trabalho pode ser acompanhada on-line e em tempo real pelo usuário através do ISPyB, do qual os resultados podem ser vistos e baixados.
<ol><li>Para cada amostra analisada, examine os resultados do experimento automático em ISPyB (https://exi.esrf.fr/).<ol>
<li>Logar-se, usando o experimento número e senha e clique na sessão desejada experimental em ID30A-1.</li>
		<li>Selecione o preferencial (top-marcando) autoprocessamento pipeline (por exemplo, granadas ou XDS_APP) e baixar os dados escritos para fora no grupo espaço correto com a integridade mais alta e mais alta resolução clicando na Última coletar resultados e, em seguida, fazer o Download. Nota: Todas as imagens de malha, linha e caracterização são em um subdiretório para cada amostra, chamado /MXPressE_01. A ESRF automaticamente executa cinco pacotes de transformação separada, ou seja EDNA_proc12, granadas12, XDS_APP14, autoprocedimento15e XIA216. Integração de dados baseia-se na XDS, com excepção dos XIA2, que é baseado em mostradores. Todos os pacotes também são executados em modos anómalos e nonanomalous, permitindo a detecção automática de um sinal anômalo, se estiver presente nos dados, para ser usado em SAD eliminação de protocolos. Cada pacote usa parâmetros diferentes e árvores de decisão, significando que alguns pacotes executar melhores com determinadas. No entanto, isso pode fazer para um grande número de resultados quando o número de pacotes e grupos de espaço possível é contabilizado. Os resultados são, portanto, classificados mais ou menos baseado na resolução e outras métricas de qualidade, tais como Rmesclagem no escudo de resolução mais baixo, CC(1/2) e completude. Isto é destinado a orientar o usuário para os melhores conjuntos de dados, mas todos os grupos de espaço possível e os resultados devem ser cuidadosamente inspecionados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Descompacte a pasta de download, que incluirá todos os arquivos de log e XDS_ASCII não mesclado. HKL e arquivos .mtz mesclado e dimensionado. Nota: no caso da estrutura (no formato PDB) da proteína de interesse ou um homólogo perto foi enviada para o ISPyB no início do experimento, o pipeline de autoprocessamento no ESRF executará automaticamente uma substituição molecular (MR) executada usando essa estrutura como o modelo de pesquisa sobre a melhor solução de pontuação. Os resultados do senhor pipeline são exibidos em ISPyB e podem ser encontrados na pasta de dados processados (por exemplo, /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ mrpipe_dir /). Aqui, o modelo final será denominado coot1.pdb e o sidechains.mtz de dados de reflexão. Observe que o gasoduto pode reduzir a simetria da célula (redução de célula primitiva) a fim de aumentar a probabilidade de encontrar uma solução. No caso aqui, o senhor pipeline escreveu a solução em uma célula monoclínica (C2) em vez de uma célula ortorrômbica (C2221). Detalhes sobre como realizar uma substituição molecular executarem manualmente (exemplificado para a solução de autoprocessamento segunda melhor pontuação) estão incluídos nos Arquivos complementares.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hui, R., Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+protein+crystallization.">High-throughput protein crystallization.</a> Journal of Structural Biology. 142 (1), 154-161 (2003).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MASSIF-1:+a+beamline+dedicated+to+the+fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).</li><li>Svensson, O., Malbet-Monaco, S., Popov, A., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules.">Fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (8), 1757-1767 (2015).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrystalDirect:+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films.">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68, 1393-1399 (2012).</li><li>Nurizzo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RoboDiff:+combining+a+sample+changer+and+goniometer+for+highly+automated+macromolecular+crystallography+experiments.">RoboDiff: combining a sample changer and goniometer for highly automated macromolecular crystallography experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (8), 966-975 (2016).</li><li>Bowler, M. W., Svensson, O., Nurizzo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automatic+macromolecular+crystallography:+the+impact+of+MASSIF-1+on+the+optimum+acquisition+and+quality+of+data.">Fully automatic macromolecular crystallography: the impact of MASSIF-1 on the optimum acquisition and quality of data.</a> Crystallography Reviews. 22 (4), 233-249 (2016).</li><li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography.">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li><li>Svensson, O., Gilski, M., Nurizzo, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-position+data+collection+and+dynamic+beam+sizing:+recent+improvements+to+the+automatic+data-collection+algorithms+on+MASSIF-1.">Multi-position data collection and dynamic beam sizing: recent improvements to the automatic data-collection algorithms on MASSIF-1.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74, 433-440 (2018).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB:+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Monaco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+processing+of+macromolecular+crystallography+X-ray+diffraction+data+at+the+ESRF.">Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).</li><li>Kikuchi, G., Motokawa, Y., Yoshida, T., Hiraga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+cleavage+system:+reaction+mechanism,+physiological+significance,+and+hyperglycinemia.">Glycine cleavage system: reaction mechanism, physiological significance, and hyperglycinemia.</a> Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and Biological Sciences. 84 (7), 246-263 (2008).</li><li>Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDSAPP2.0.">XDSAPP2.0.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).</li><li>Vonrhein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+and+analysis+with+the+autoPROC+toolbox.">Data processing and analysis with the autoPROC toolbox.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xia2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Higashiura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+X-ray+crystal+structure+of+bovine+H-protein+at+0.88+&#197;+resolution.">High-resolution X-ray crystal structure of bovine H-protein at 0.88 &#197; resolution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (6), 698-708 (2010).</li><li>Sanishvili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+7+&#181;m+mini-beam+improves+diffraction+data+from+small+or+imperfect+crystals+of+macromolecules.">A 7 &#181;m mini-beam improves diffraction data from small or imperfect crystals of macromolecules.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (4), 425-435 (2008).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffraction+cartography:+applying+microbeams+to+macromolecular+crystallography+sample+evaluation+and+data+collection.">Diffraction cartography: applying microbeams to macromolecular crystallography sample evaluation and data collection.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (8), 855-864 (2010).</li><li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+Experience+of+Controlled+Crystal+Dehydration:+Results+from+the+European+Synchrotron+HC1+Collaboration.">Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration.</a> Crystal Growth &amp; Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+harvesting+and+processing+of+protein+crystals+through+laser+photoablation.">Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Totalmente automáticos beamlines fornecer automatizada caracterização e recolha de dados de um grande número de cristais macromoleculares sem a presença de um cientista, na trajetória ou remotamente, sendo necessário. Uso de luz síncroton completamente automatizado tem muitas vantagens em comparação com operação manual. Por exemplo, a amostra automatizado, centrando-se, com base em malha de raio-x e a linha varreduras, é mais precisa do que o realizado com o olho humano como não é afetado pelos efeitos térmicos ou ópticos. Com efeito, esses exames de malha e linha fornecem dados adicionais (ou seja, detalhadas dimensões de cristal e o melhor diffracting região do cristal) que são importantes em determinar o tamanho do feixe correto a ser usado para coleta de dados — especialmente para pequenos cristais 18— e muitas vezes resultam em uma melhoria da qualidade dos dados obtidos de difração. Além disso, tirando proveito dos parâmetros definidos pelo usuário na instalação de experimentos automáticas, as etapas em fluxos de trabalho específicos podem ser adaptadas para melhor se adequar ao sistema sob estudo, otimizando ainda mais a taxa de sucesso do experimento.
Juntos, levando a confiabilidade dos fluxos de trabalho disponíveis, o acesso directo da trajetória (usuários agendar Self, usando um calendário [veja acima]) e a abordagem totalmente automatizada de maciço-1 fornece um rigoroso, alta produtividade e economia de tempo alternativa à clássicas experiências práticas de MX e o potencial para implementar mais avançados procedimentos e aplicações em fluxos de trabalho automáticos. Num futuro próximo, cartografia de cristal em 3D19 será implementada para melhorar a precisão de centragem de raio-x, enquanto protocolos mais complexos, tais como experimentos de desidratação cristal20, serão automatizados. Espera-se que a coleta de dados totalmente autónoma vai se tornar um método padrão no MX, fornecendo dados de alta qualidade para telas de fragmento pequeno-molécula, otimizando a seleção de um grande número de mal diffracting cristais e fornecendo automaticamente fase informações para resolver o cristal estruturas de novo. Em combinação com a evolução da colheita automatizada de cristais21, a possibilidade de solução de estrutura de cristal da proteína como um serviço automatizado bem poderia se tornar uma realidade.

Determinar a estrutura tridimensional de proteínas específicas é crucial em biologia. A informação que é derivada de fazer então lança luz sobre a função biológica e sobre a forma e a especificidade do ativos e/ou vinculante sites contidos na molécula sob estudo. Em muitos casos, isso permite que os mecanismos de ação a ser determinado ou, se for caso disso, potenciais moléculas terapêuticas a serem desenvolvidas. MX é a técnica mais comumente usada para obter informações estruturais, mas um gargalo é a determinação das condições ideais para obter cristais bem diffracting. Portanto, os ensaios de cristalização são realizados em condições diferentes numerosos e são então selecionados, para encontrar os melhores cristais deve ser usado para coleta de dados de difração. A automatização da instalação de cristalização ensaios1 ajudou claramente a este respeito. No entanto, as etapas subsequentes (ou seja, montagem de cristal, triagem de difração e coleta de dados de Difração) são geralmente realizadas manualmente, levando um monte de tempo, esforço e recursos. A automação de difração triagem e recolha de dados, portanto, significa um enorme ganho em tempo e eficiência.
Coleção de rastreio e dados de difração no MX mais geralmente é realizada no Síncrotron MX de luz síncroton no qual automação em grande medida facilitou este processo. No entanto, na maioria dos casos, é necessário que o cientista para estarem presentes a trajetória durante um experimento ou operá-lo remotamente. Recentemente, uma nova geração de completamente automatizado de luz síncroton MX tem sido desenvolvidos2. Aqui, os usuários não precisam estar presentes, fisicamente ou remotamente, durante uma sessão experimental. Isso permite que os cientistas a gastar mais tempo com menos tarefas de rotina, ao invés de passar dias inteiros e muitas vezes noites, cristais de triagem e coleta de dados de difração. Trajetória de totalmente automatizada primeira do mundo é o maciçamente automatizada amostra seleção usina integrada (maciço-1, ID30A-1)2,3 na radiação síncrotron Europeu Facility (ESRF). Tem um ambiente único exemplo em que uma alta capacidade contendo amostra dewar opera em conjunto com um alterador robótico amostra que também atua como goniômetro4,5 a trajetória. MACIÇO-1 é uma trajetória de undulator equipada com um único fóton-contagem de híbrido pixel detector6, que opera no comprimento de onda fixo de 0.969 Å (12.84 keV) com um feixe intenso de raio-x (2 x 1012 fótons/s). O tamanho do feixe na posição de amostra pode ser ajustado entre um mínimo de 10 µm (feixe redondo) a um máximo de 100 µm x 65 µm (horizontal pelo tamanho vertical do feixe). Em média, a trajetória pode processar, em um totalmente automático da forma 120 cristais (veja abaixo), em 24 h. A operação da trajetória é baseada em uma série de fluxos de trabalho7, cada uma das quais toma decisões inteligentes com base no resultado das etapas anteriores do fluxo de trabalho, para assegurar a medição dos melhores dados possíveis da amostra em estudo. Em particular, a avaliação das características de difração de uma amostra individual leva em conta cristal volume e fluxo e garante, onde o cristal é maior do que o feixe de raios-x, que só a melhor região do cristal é usado para dados subsequentes coleção. Conjuntos de dados de difração são, assim, otimizados para uma resolução máxima com a radiação minimizada dano2,3. Exigentes protocolos de coleta de dados, como estratégias de coleção pseudo helicoidal (multi-posições) dados para ambos coleta de dados de difração anômala nativo e single-comprimento de onda (SAD), também estão disponíveis8.
Experimentos completamente automáticos no maciço-1 envolvem cryocooling e montagem de cristais em um monte de amostra magnética adequado para o padrão de equipamento desejado beamline pinos da coluna9, inserindo os parâmetros desejados e experimentais no ' difração plano ' da tabela no sistema integrado de cristalografia de proteínas de luz síncroton (ISPyB)10, um sistema de gestão de informação baseado na web para experimentos de MX e envio de amostras para a trajetória. A ESRF, todos os custos do transporte das amostras de/para a trajetória são com o apoio do escritório do usuário ESRF (consulte o site do ESRF11 para obter detalhes). No maciço-1, sem restrições são colocadas sobre o tamanho do laço ou qualidade de cristal. Ao escolher um plano de difração por um cristal de determinado, o usuário pode usar as configurações padrão ou escolher entre fluxos de trabalho específicos, que podem ser personalizados para cada amostra. Dispõem de vários fluxos de trabalho pré-programados. O fluxo de trabalho3 MXPressE, o loop de amostra contendo primeiro é alinhado para a posição de amostra usando a centragem óptica. Então, X-ray-based centralização assegura que a melhor região do cristal é centralizado para o feixe de raio-x. Estratégias de coleta de dados, em seguida, são calculadas usando eEDNA, um framework para o desenvolvimento de aplicativos baseados em plugin especialmente para análise de dados on-line no campo de experimentos de raios-x, tendo em conta cristal volume e o fluxo em tempo real com a trajetória. Após a recolha de um conjunto de dados completo de difração, isto é então processado usando uma série de condutas de tratamento automático de dados12 e os resultados são disponibilizados para inspeção e download em ISPyB. O fluxo de trabalho do MXPressE SAD3 visa cristais selenometionina-contendo da proteína alvo e explora o fato de que a energia de funcionamento do maciço-1 é apenas acima da borda Se K. Aqui, a estratégia de coleta de dados de eEDNA MXPressE é otimizada para coleta de dados triste (ou seja, alta redundância e com a resolução definida para onde o Rmesclagem entre pares Bijvoet é inferior a 5%). Para as propriedades de difração de uma série de cristais sem coleta de dados subsequentes da tela, o fluxo de trabalho do MXScore3 pode ser usado para produzir uma avaliação de qualidade total dos cristais analisados. O fluxo de trabalho3 MXPressI, dos dados de rotação de 180 ° são coletados usando oscilações de 0,2 ° e o ângulo phi inicial e a resolução determinada por uma estratégia de eEDNA. MXPressO 3 inclui uma resolução de preobserved para o fluxo de trabalho (padrão: dmin = 2 Å). Para fazer uma avaliação inicial dos cristais resultantes de uma julgamento de cristalização, MXPressM3 fluxo de trabalho é oferecido. Isto executa uma malha do elevado-dose varredura sobre a orientação mais ampla do suporte de amostra com nenhuma coleção de dados ou centralização. Recentemente, dois novos experimento fluxos de trabalho, MXPressP e MXPressP_SAD, que realizam coletas de dados pseudohelical, têm sido implementadas8. A execução de todas as etapas em todos os fluxos de trabalho pode ser acompanhada on-line e em tempo real pelo usuário, através de ISPyB.
Aqui nós mostramos como preparar um experimento MX totalmente automatizado no maciço-1 e como recuperar e analisar os dados resultantes da experiência. Como exemplo, usamos a proteína de sistema de clivagem de glicina mitocondrial humano H (GCSH). Esta proteína de contendo ácido lipoico é parte do sistema de clivagem da glicina responsável pela degradação da glicina. Mais, este sistema inclui a proteína P, uma descarboxilase de glicina dependente de fosfato de piridoxal, a proteína de T, uma enzima tetrahidrofolato-reque e a proteína L, um lipoamide desidrogenase. GCSH transfere o grupo metilamina de glicina da proteína P para a proteína de T. Defeitos na proteína H são a causa de nonketotic hyperglycinemia (NKH) em seres humanos13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline MASSIF-1</td>
			<td>ESRF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21DE3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzing membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>132655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loop</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR8-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MonoQ 5/50 GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5166-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPINE pucks</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CSM003-0001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1064430500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCSH purification buffer</td>
			<td>20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCSH cryo-protection buffer</td>
			<td>0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MxCube</td>
			<td></td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCube2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES workflow server</td>
			<td></td>
			<td>Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLISS beamline control</td>
			<td></td>
			<td>Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AUTO processing of images</td>
			<td></td>
			<td>Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEST and EDNA</td>
			<td></td>
			<td>Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phaser MR</td>
			<td></td>
			<td>McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td></td>
			<td>Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refmac5</td>
			<td></td>
			<td>Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240--255 (1997).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matthews</td>
			<td></td>
			<td>Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully autonomous characterization and data collection from crystals of biological macromolecules

Feixes de raios-x de alto-brilho juntamente com automação conduziram ao uso de luz síncroton síncrotron-baseado macromolecular cristalografia de raios x (MX) para mesmo os projetos mais desafiadores em biologia estrutural. No entanto, a maioria das instalações ainda exigem a presença de uma cientista no local para realizar os experimentos. Uma nova geração de automática de Luz Síncroton, dedicado à caracterização automática de e coleta de dados de, cristais de macromoléculas biológicas foi recentemente desenvolvido. Essas beamlines representam uma nova ferramenta para biólogos estruturais para a tela os resultados de ensaios de cristalização inicial e/ou a coleção de um grande número de conjuntos de dados de difração, sem ter de se controlar a trajetória de usuários. Aqui nós mostramos como configurar um experimento para triagem automática e coleta de dados, como um experimento é realizado na trajetória, como os conjuntos de dados resultantes são processados, e como, quando possível, a estrutura de cristal da macromolécula biológica está resolvida.

O fluxo de trabalho de MXPressP foi usado na trajetória do ESRF maciço-1 para, totalmente automática, montar, centro com o feixe de raios-x, caracterizar e coletar os conjuntos de dados de difração completa de uma série de cristais de GCSH humana. As amostras foram montadas e o loop analisado para uma área de varredura (Figura 1, à esquerda). Após a análise de difração, quatro pontos foram selecionados dentro do cristal para coleta de dados (Figura 1, direita). Posterior processamento por gasodutos de análise automatizada de dados, incluindo o pipeline do senhor, rendido a conjuntos de dados de alta qualidade (tabela 1) para que uma solução de deputado foi encontrada. Este último permite que os usuários rapidamente avaliar se o conjunto de dados obtido e o modelo de pesquisa utilizados são adequados para eliminação por substituição molecular. Além disso, a presença de ligantes pode ser julgada, permitindo ao usuário focar apenas os conjuntos de dados mais promissoras para uma análise mais aprofundada. Determinação da estrutura manual pelo Sr rendeu um mapa de densidade de elétrons de alta qualidade depois automatizada de um único ciclo de refinamento (Figura 2a). Para este conjunto de dados, o pipeline automatizado corta os dados em um 1.32 Å resolução; no entanto, os usuários ainda podem decidir cortar os dados com uma resolução menor para chegar a estatísticas de qualidade diferente (CC1/2, < I/σ(I) >, Rmeas) na camada mais alta resolução. A estrutura de cristal da estrutura GCSH humana é similar da proteína bovina (3KlR)16.
Densidade de elétrons contínua é visível para a cadeia inteira de aminoácido, além da marca de histidina N-terminal. Das quatro substituições que distinguem a GCSH humana e bovina, três são facilmente identificáveis da densidade de elétrons (Ile/Val66, Asp/Glu98 e Leu/Phe149; Figura 2b -d). Isto é menos claro para a substituição de Asp/Lys125 para que a densidade de elétrons da cadeia lateral é apenas parcialmente resolvida devido a flexibilidade (Figura 1e). O modelo atualmente obtido tem Rtrabalhar e R valoreslivre de 20,4% e 23,8%, respectivamente e pode ser ainda mais otimizado por mais ciclos de construção automatizada e manual modelo e refinamento.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Pipeline de granadas</td>
			<td>Pipeline de XDS_APP</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Processamento e coleta de dados</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fonte de raio-x / Beam linha</td>
			<td colspan="2">ESRF / MACIÇO-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Comprimento de onda (Å)</td>
			<td colspan="2">0.966</td>
		</tr>
<tr>
<td>Resolução (Å)</td>
			<td>41.88 – 1.48 (1.53-1.48)</td>
			<td>41.86-1.32 (1.39-1.32)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Reflexões de total/exclusivo</td>
			<td>127670 / 28644</td>
			<td>177332 / 40134</td>
		</tr>
<tr>
<td>(12178 / 2775)</td>
			<td>(23772 / 5714)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grupo de espaço para indexação, dimensionamento e fusão</td>
			<td>C222</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dimensões da célula</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>a, b, c (Å)</td>
			<td>42.20, 83,75, 95.85</td>
			<td>42,19, 83.72, 95,82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mosaicity</td>
			<td>0.05</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (%)</td>
			<td>10.0 (110,7)</td>
			<td>11.1 (198.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>< I/σ(I) ></td>
			<td>9.6 (1.3)</td>
			<td>7.6 (0.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2 (%)</td>
			<td>99.7 (53,9)</td>
			<td>99.7 (19,1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Completude (%)</td>
			<td>99.6 (99,6)</td>
			<td>99,5 (98,6)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Multiplicidade</td>
			<td>4.5 (4.4)</td>
			<td>4.4 (4.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Substituição molecular e refinamento do modelo preliminar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grupo de espaço para eliminação gradual</td>
			<td>C2</td>
			<td>C2221
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dimensões da célula</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>a, b, c (Å)</td>
			<td>83.74, 42.18, 95,82</td>
			<td>42,19, 83.72, 95,82</td>
		</tr>
<tr>
<td>Α, Β, Γ (°)</td>
			<td>90, 90.03, 90</td>
			<td>90, 90, 90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Modelo de pesquisa para deputado (PDB)</td>
			<td>3KLR</td>
			<td>3KLR</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moléculas de proteína / ASU</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Resíduos de proteína</td>
			<td>250</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rtrabalhar/rlivre (%) após 1º refinamento</td>
			<td>24,3 / 26.5</td>
			<td>20,4 23.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Distância de ligação RMSD (Å) após 1º refinamento</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ângulo de ligação RMSD (°) após 1º refinamento</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rotamer outlier (%) após 1º refinamento</td>
			<td>1,07</td>
			<td>4.29</td>
		</tr>
<tr>
<td>Roberta favorecida/permitido/não permitido (%) após 1º refinamento</td>
			<td>95.93 / 4,07 / 0</td>
			<td>95.12 / 4.88 / 0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: estatísticas de coleção, refinamento e validação de dados de difração de raios x. Valores para o shell de resolução mais alta são dadas entre parênteses.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig1.jpg"> Figura 1: amostra de análise antes da coleta de dados. (A) a região selecionada para digitalização é mostrado por uma caixa vermelha. (B) a análise de imagens de difração é mostrada como um mapa de calor. Quatro posições dentro do cristal localizado foram selecionadas para coleta de dados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59032/59032fig2.jpg"> Figura 2: validação Visual dos mapas de densidade de elétrons obtidos após refinamento. Mapas de densidade de elétrons contorneados em 2 x nível r.m.s em torno de (um) Trp143, (b), Val66 (Ile de GCSH humana) e (c), Glu98 (Asp na GCSH humana) e mapas de contorno em 1 x r.m.s nível em torno de (d), Phe149 (Leu em GCSH humana) e (e) Lys125 (Asp na GCSH humana). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59032/59032fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Caracterização totalmente autónoma e coleta de dados de cristais de macromoléculas biológicas

Aqui, descrevemos como usar a triagem automatizada e opções de coleta de dados disponíveis em um pouco de luz síncroton síncrotron. Os cientistas enviar amostras de cryocooled para o síncrotron e as propriedades de difração são selecionadas, os conjuntos de dados são recolhidos e tratados e, sempre que possível, uma solução de estrutura é realizada — tudo sem intervenção humana.

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

A cristalografia de raios-X é a técnica dominante para determinar informações estruturais 3D de proteínas. Linhas de feixe síncrotron são necessárias para obter dados dos cristais pequenos e fracamente difundidores que as proteínas produzem. Massive one é uma linha de feixe única porque automatiza totalmente o processo de coleta de dados a partir de macromoléculas biológicas.Desde a montagem da amostra, localização e coleta final de dados. A automação completa desse tipo é muito importante, pois permite que os pesquisadores passem seu tempo em laboratório, em vez de coletar dados na linha de feixe. A linha de feixe também é inteligente e, em média, pode coletar dados melhores do que quando a linha de feixe é operada por humanos.Para iniciar este protocolo, realize a montagem de cristal e solicite tempo de feixe em Massive one, conforme descrito no protocolo de texto. Navegue até o sistema de informações para linhas de feixe de cristalografia de proteínas, ou site ispyb. Escolha experimentos MX, faça login com o número do experimento e senha.Clique na remessa, adicione novas e forneça as informações necessárias. Em seguida, clique em salvar. Clique em adicionar parcela e preencha as informações solicitadas.Clique em salvar e clique em adicionar contêiner. Dê o código de barras do disco como nome, e escolha o disco da coluna, clique novamente em salvar. Clique no símbolo do recipiente e edite e preencha as informações necessárias sobre as amostras, como nome da proteína, fluxo de trabalho preferido e posição de cristal, no disco.Escolha a proteína que foi aprovada pelo grupo de segurança ESRF. Digite um nome de amostra único para identificar cada amostra individual. Opcionalmente, escaneie o código de barras do pino.O resto das informações a serem inclusivas também é opcional. Para cada amostra individual, digite o tipo de experimento. Isso define qual fluxo de trabalho automático será usado para processar cada cristal.Dado que os cristais GCSH são agulhas, escolha MX pressione P.Next, entre em um grupo espacial. Se presente, este será usado para cálculos de estratégia de coleta de dados e pelas linhas automáticas de tubos de processamento de dados disponíveis. Digite a resolução desejada.Isso define a distância do cristal ao detector das varreduras iniciais de malha, caracterização e coleta de dados padrão. Agora, defina a resolução de limiar desejada para evitar a coleta de conjuntos de dados completos de cristais que não difratam a este limite. Isso pode salvar o espaço de armazenamento de dados e analisar o tempo.Defina a completude necessária. Em seguida, defina a multiplicidade necessária. Se mais de um cristal estiver contido no suporte da amostra, defina o número máximo de cristais a serem analisados.O valor padrão é de um ou cinco para MX press P.O tamanho do feixe apropriado também pode ser selecionado. Coloque no grupo espacial, se conhecido, na coluna do grupo espacial force. Em seguida, ajuste a sensibilidade de radiação dos cristais.Se desejar, defina o ângulo de rotação total a ser coletado para a coleta completa do conjunto de dados. Uma vez que todas as informações foram inserindo no sistema, salve os valores. Clique, retorne aos embarques e pressione enviar envio para a ESRF.Imprima a etiqueta de envio e envie as amostras. Os usuários devem organizar uma coleta com um mensageiro usando os detalhes da conta ESRF. No dia do experimento, as amostras são transferidas para o Massive one high capacit dew-er.Os cientistas da linha de raios lançam a coleta de dados, que pode ser seguida pelos usuários remotamente. Para cada tipo de amostra diferente, os usuários recebem um e-mail informando que a coleta de dados foi iniciada. A execução de todas as etapas em todos os fluxos de trabalho pode ser acompanhada online e em tempo real.Isso é acessível ao usuário fazendo login no ISPyB. Os resultados também podem ser vistos e baixados. Para cada amostra analisada, examine os resultados do experimento automático no ISPyB.Clique na sessão experimental desejada no ID30A1. Selecione o pipeline de processamento automático preferido. Baixe os dados escritos no grupo espacial correto com a maior completude e maior resolução.Clicando nos últimos resultados de coleta e, em seguida, baixe. O fluxo de trabalho P de prensa MX foi usado pela linha de feixe ESRF Massive one para montar totalmente, centralizar o feixe de raios-X, caracterizar e coletar conjuntos de dados de difração completos de uma série de cristais de GCSH humanos. As amostras foram montadas e o laço analisado para uma área de varredura.Após as análises de difração, foram selecionados quatro pontos dentro do cristal para coleta de dados. A determinação manual da estrutura por substituição molecular produziu um mapa de densidade eletrônica de alta qualidade após um único ciclo automatizado de refinamento. Para este conjunto de dados, o pipeline automatizado cortou os dados em uma resolução de um ponto três dois angstrom.No entanto, os usuários podem decidir cortar os dados em uma resolução menor. A densidade eletrônica contínua é visível para toda a cadeia de aminoácidos além da tag histidina eterminal. Das quatro substituições que distinguem o GCSH humano e bovino, três são facilmente identificáveis na densidade eletrônica.Isso é menos claro para o ácido aspartc à substituição de lisina 125. Para a qual a densidade eletrônica da cadeia lateral é apenas parcialmente resolvida devido à flexibilidade. O modelo atualmente obtido tem um valor de trabalho R de 20 pontos quatro por cento e um valor livre de R de 23 pontos oito por cento e pode ser ainda otimizado por ciclos adicionais de construção e refinamento de modelos automatizados e manuais.É importante adequar os requisitos ao seu sistema. Por exemplo, definir a resolução já observada para um valor conhecido pode economizar tempo e garantir uma melhor coleta de dados. A coleta totalmente automática de dados democratizou a cristalografia e agora até mesmo pequenos laboratórios podem embarcar em projetos famosos quando isso era viável antes apenas com enorme poder de homem.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS para Caracterização em profundidade e Quantificação de Glutamina e Asparagina em desamidação da espingarda Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Bioquímica

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcristalografia de Cristais de Proteína e<em&gt; Em Cellulo</em&gt; Difração

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

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Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

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